本发明涉及食品领域，具体是在指一种提高米茶中γ-氨基丁酸含量的方法。
背景技术：
米茶是以糙米为原料，经过浸润、培炒等工序制成。专利cn102461688公开了“一种糙米茶饮料的制作方法”，将糙米经烘烤、粉碎和复配茶粉后得到的产品；cn1620933公开了“一种米茶饮料生产工艺”，将炒制的大米与大豆混合，煮制后过滤得到产品；cn103621730公开了“一种米茶饮料”，采用阶段性升温炒制工艺，将大米分别在30℃-50℃、50℃-90℃、90℃-110℃的温度条件下炒制5-8分钟、2-4分钟和1-3分钟得到米茶，然后将炒制的米茶放入水中煮制6-10分钟制得米茶饮料。
为了提高米茶的营养，通常将糙米进行发芽处理，糙米发芽过程中，内源酶被激活，分解部分淀粉、非淀粉多糖和蛋白质等生物高分子化合物，产生小分子糖、肽类和氨基酸等营养物质，γ-氨基丁酸(γ-amiobutyricacid,gaba)是其中最主要的功能性成分，也是评价米茶营养价值的重要指标。gaba是一种非蛋白组成氨基酸，广泛分布于动植物体内，具有降血压、抗惊厥、改善脑机能、促进生长激素分泌，以及调节肝、肾功能和促进乙醇代谢等作用。
通过检索，专利cn102919470公开了“一种富含γ-氨基丁酸发芽糙米茶生产工艺及其产品”，将浸泡后的糙米，置于15～25倍体积(v/w)的饮用水中，于15～35℃通气避光发芽6～60h，通入的空气流速为0.6～2.0l/min，至芽长1～15mm，从而提高米茶中的γ-氨基丁酸含量。
其它提高米茶gaba含量的方法包括糙米采用超声波、纤维素酶和果胶酶联合预处理后再进行发芽(刘俊飞，汤晓智，扈战强，代飞云，方勇，胡秋辉.超声波辅助酶预处理对糙米发芽及发芽糙米理化特性的影响.食品科学，2015,36(4):11-18)；优化发芽的温度、ph等发芽条件(姚森，郑理，赵思明，熊善柏.发芽条件对发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影响.农业工程学报，2006,22(12):211-215；邓宇.发芽条件及营养液对发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影响.食品工业，2010，(2):79-82)；采用循环加湿法进行糙米发芽(贾富国，王吉泰，兰海鹏，韩珊，张强，付倩.循环加湿工艺对发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影响.农业工程学报，2012，28(20):288-292)。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提高米茶中γ-氨基丁酸含量的方法。通过采用具有生产γ-氨基丁酸能力的植物乳杆菌发酵，以植物乳杆菌液体发酵液浸泡糙米，再在适度真空条件下进行发芽，制得的米茶富集对人体有益营养成分，达到增进健康的目的。
为实现上述目的，本发明提供了一种高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌。其保藏编号为：cgmccno.13338。
本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，已于2016年11月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的菌株名称是：wz-01；分类命名是植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)；保藏编号为：cgmccno.13338。该植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)的核苷酸序列如seqidno:1所示。
本发明还提供一种上述植物乳杆菌在提高米茶中γ-氨基丁酸含量的应用，即一种提高米茶中γ-氨基丁酸含量的方法，其特征在于包括以下步骤：将植物乳杆菌cgmccno.13338进行培养获得植物乳杆菌液体培养液，并用该植物乳杆菌液体培养液对糙米进行浸泡和真空发芽，然后再进行烘干炒制获得米茶成品，该米茶成品中γ-氨基丁酸含量为30-65毫克/100克。
本发明米茶中γ-氨基丁酸含量的测定具体按照以下方法：
(1)米茶的粉碎与γ-氨基丁酸的提取：米茶粉碎过60目筛，取10克米粉加入100毫升60％的乙醇溶液，振荡提取两小时，离心取上清液，上清液再以0.45μm滤膜过滤。
(2)样品衍生化：400微升硼酸缓冲液，80微升样品溶液，邻苯二甲醛衍生试剂160微升，充分混合室温反应5分钟。
(3)hplc测定条件：流动相v(醋酸钠缓冲液)：v(乙腈)＝3：1，色谱柱为sunfiretmc18柱(4.6mm×250mm，5μm)，检测器为紫外分光检测器，检测波长338nm，流速0.8毫升/分钟，柱温40℃，洗脱时间15分钟，进样量20微升。
进一步设置是包括以下步骤：
(1)斜面培养：将植物乳杆菌cgmccno.13338接种到斜面培养基上，在35℃条件下培养48小时；斜面培养基组成以克/升计：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，磷酸氢二钾2，柠檬酸铵2，乙酸钠5，葡萄糖20，硫酸镁0.5，硫酸锰0.25，琼脂20，以去离子水配制，ph值6.2-6.4，121℃灭菌15分钟；
(2)液体培养：将斜面培养基上长好的菌种接种到新鲜的液体培养基中，在35℃条件下静置培养24小时；液体培养基的组成以克/升计：酵母膏5，磷酸氢二钾2，柠檬酸铵2，磷酸二氢钾1，葡萄糖30，硫酸镁0.5，谷氨酸钠5，以自来水配制，ph值6.5，121℃灭菌15分钟；
(3)大米浸泡：挑选颗粒饱满，无病虫害的糙米，加入经步骤(2)液体培养所获得的植物乳杆菌液体培养液，糙米与植物乳杆菌液体培养液的质量体积比为1：1.5-2.0，于20-30℃浸泡3-10小时；
(4)真空发芽：将浸泡的糙米捞出，加入0.2-0.5体积倍的所述植物乳杆菌液体培养液，置于真空培养箱中，于真空度50-80kpa、20-30℃发芽15-36小时；
(5)烘干、焙炒：经过发芽的糙米在烘干至含水量13％，然后再进行焙炒制得米茶，焙炒程序为：80-120℃，30-60分钟；120-150℃，10-20分钟；150-220℃，10-30分钟。
进一步设置是，糙米为粳糙米、糯糙米或籼糙米。
本发明的积极进步效果在于：
本发明将乳酸菌发酵与糙米控氧发芽相结合，提供了一种提高米茶中γ-氨基丁酸含量的方法，与现有技术相比，制得的米茶产品具有以下优点：
(1)制得的米茶中γ-氨基丁酸含量高，对人体具有调整血压、镇静神经、调节肝肾功能等作用；
(2)糙米经乳酸菌发酵和发芽处理后，制成的产品富含乳酸菌发酵益生成分、营养丰富、保健作用良好，有效地提高了稻米的附加值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1采用mega7.0软件，邻位连接法显示菌株cgmccno.13338与genebank数据库中相关种的16srdna序列系统发育树。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明作进一步地详细描述。
以下实施例中所用的菌种培养基如下：
乳酸菌筛选培养基(g/l)：酪蛋白胨10，牛肉膏10，酵母提取物5，葡萄糖5，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，柠檬酸三铵2，吐温801，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，碳酸钙10，琼脂15，ph6.8，0.6％溴甲酚绿1；
植物乳杆菌(lactobacilusplantarum)wz-01的筛选分离与鉴定
一、植物乳杆菌(lactobacilusplantarum)wz-01是从发酵蔬菜中分离而来的。取发酵蔬菜液，将其稀释10-5，10-6，10-7倍，取100微升涂布在乳酸菌筛选培养基平板，每个浓度重复三次，37℃培养48小时，圆形稍扁平的白色菌落及其周围培养基变为黄色者为产酸菌，挑选产酸菌多次纯化，将纯化后的菌株接种到斜面培养基上，37℃培养48小时后放于4℃冰箱保存待用。
将4℃冰箱保存待用的菌株接种到种子培养基中，37℃培养24小时后，分别取10毫升种子液接种于100克羊栖菜中进行发酵，通过感官评定，从中筛选出一株脱腥效果强的菌株，定名为wz-01。
二、植物乳杆菌(lactobacilusplantarum)wz-01的分子生物学鉴定
将目的菌株在斜面培养基上培养24小时，提取基因组dna，利用pcr技术扩增该菌株的16srdna，所用引物，正向引物(5'-cagagtttgatcctggct-3')，反向引物(5'-aggaggtgatccagccgca-3')；
pcr反应体系组成如下表：
pcr条件如下表所示：
对pcr产物进行dna测序，序列已提交genebank，序列登记号为mh016560，与genebank数据库中的16srdna进行同源性比对，结果见图1，发现与lactobacilusplantarumt34(genbankaccessionno.mg739430.1)的同源性最高，高达99％，确定该菌株为植物乳杆菌(lactobacilusplantarum)，已于2016年11月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为：cgmccno.13338。
以下实施例中所用的菌种培养基如下：
斜面培养基组成以克/升计：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，磷酸氢二钾2，柠檬酸铵2，乙酸钠5，葡萄糖20，硫酸镁0.5，硫酸锰0.25，琼脂20，以去离子水配制，ph值6.2-6.4，121℃灭菌15分钟；
种子培养基的组成以克/升计：酵母膏5，磷酸氢二钾2，柠檬酸铵2，磷酸二氢钾1，葡萄糖30，硫酸镁0.5，谷氨酸钠5，以自来水配制，ph值6.5，121℃灭菌15分钟；
实施例1富含γ-氨基丁酸乳酸菌发酵液的制备
(1)斜面培养：将植物乳杆菌cgmccno.13338接种到斜面培养基上，在35℃条件下培养48小时；
(2)液体培养：将斜面上长好的菌种接种到新鲜的液体培养基中，在35℃条件下静置培养24小时，制得富含γ-氨基丁酸乳酸菌液体培养液，培养液中γ-氨基丁酸含量为120-150毫克/升。
实施例2γ-氨基丁酸含量的hplc测定
γ-氨基丁酸标样购自默克生命科学(上海)有限公司；
米茶粉碎过60目筛，取10克米粉加入100毫升60％的乙醇溶液，振荡提取两小时，离心取上清液，上清液再以0.45μm滤膜过滤。取400微升硼酸缓冲液，80微升样品溶液，邻苯二甲醛衍生试剂160微升，充分混合室温反应5分钟进行γ-氨基丁酸的衍生化。取衍生化后的样品进行hplc分析。hplc分析条件为：
hplc柱：sunfiretmc18柱(4.6mm×250mm，5um)；
流动相：50毫摩尔/升的醋酸钠缓冲液：乙腈＝3：1；
流速：0.8毫升/分钟；
柱温：40℃；
进样量：20微升；
检测波长：338纳米。
实施例3米茶的制备
挑选颗粒饱满，无病虫害的粳糙米，加入植物乳杆菌液体培养液，糙米与植物乳杆菌液体培养液的比例为1：1.5，于25℃浸泡10小时；将浸泡的糙米捞出，加入0.2倍体积的植物乳杆菌液体培养液，置于真空培养箱中，于真空度50kpa、28℃发芽15小时；经过发芽的糙米烘干至含水量13％，然后再进行焙炒制得米茶。焙炒程序为：80℃，40分钟；120℃，10分钟；200℃，20分钟。经hplc分析，米茶中的γ-氨基丁酸含量为46毫克/100克。
实施例4米茶的制备
挑选颗粒饱满，无病虫害的糯糙米，加入植物乳杆菌液体培养液，糙米与植物乳杆菌液体培养液的比例为1：1.5，于20℃浸泡10小时；将浸泡的糙米捞出，加入0.3倍体积的植物乳杆菌液体培养液，置于真空培养箱中，于真空度60kpa、28℃发芽24小时；经过发芽的糙米烘干至含水量13％，然后再进行焙炒制得米茶。焙炒程序为：100℃，40分钟；150℃，10分钟；220℃，10分钟。经hplc分析，米茶中的γ-氨基丁酸含量为30毫克/100克。
实施例5米茶的制备
挑选颗粒饱满，无病虫害的籼糙米，加入植物乳杆菌液体培养液，糙米与植物乳杆菌液体培养液的比例为1：1.5，于30℃浸泡3小时；将浸泡的糙米捞出，加入0.5倍体积的植物乳杆菌液体培养液，置于真空培养箱中，于真空度50kpa、20℃发芽36小时；经过发芽的糙米烘干至含水量13％，然后再进行焙炒制得米茶。焙炒程序为：120℃，30分钟；150℃，10分钟；220℃，10分钟。经hplc分析，米茶中的γ-氨基丁酸含量为42毫克/100克。
实施例6米茶的制备
挑选颗粒饱满，无病虫害的粳糙米，加入植物乳杆菌液体培养液，糙米与植物乳杆菌液体培养液的比例为1：2.0，于25℃浸泡10小时；将浸泡的糙米捞出，加入0.2倍体积的植物乳杆菌液体培养液，置于真空培养箱中，于真空度50kpa、28℃发芽15小时；经过发芽的糙米烘干至含水量13％，然后再进行焙炒制得米茶。然后再进行焙炒制得米茶。焙炒程序为：100℃，35分钟；150℃，10分钟；220℃，10分钟。经hplc分析，米茶中的γ-氨基丁酸含量为51毫克/100克。
实施例7米茶的制备
挑选颗粒饱满，无病虫害的粳糙米，加入植物乳杆菌液体培养液，糙米与植物乳杆菌液体培养液的比例为1：1.5，于30℃浸泡5小时；将浸泡的糙米捞出，加入0.5倍体积的植物乳杆菌液体培养液，置于真空培养箱中，于真空度50kpa、20℃发芽36小时；经过发芽的糙米烘干至含水量13％，焙炒程序为：100℃，35分钟；150℃，10分钟；220℃，10分钟。经hplc分析，米茶中的γ-氨基丁酸含量为48毫克/100克。
实施例8米茶的制备
挑选颗粒饱满，无病虫害的粳糙米，加入植物乳杆菌液体培养液，糙米与植物乳杆菌液体培养液的比例为1：1.5，于25℃浸泡10小时；将浸泡的糙米捞出，加入0.2倍体积的植物乳杆菌液体培养液，置于真空培养箱中，于真空度50kpa、25℃发芽30小时；经过发芽的糙米烘干至含水量13％，然后再进行焙炒制得米茶。焙炒程序为：100℃，35分钟；150℃，10分钟；220℃，10分钟。经hplc分析，米茶中的γ-氨基丁酸含量为59毫克/100克。
实施例9米茶的制备
挑选颗粒饱满，无病虫害的粳糙米，加入植物乳杆菌液体培养液，糙米与植物乳杆菌液体培养液的比例为1：2.0，于25℃浸泡10小时；将浸泡的糙米捞出，加入0.2倍体积的植物乳杆菌液体培养液，置于真空培养箱中，于真空度80kpa、28℃发芽24小时；经过发芽的糙米烘干至含水量13％，然后再进行焙炒制得米茶。焙炒程序为：100℃，35分钟；150℃，10分钟；220℃，10分钟。经hplc分析，米茶中的γ-氨基丁酸含量为53毫克/100克。
实施例10米茶的制备
挑选颗粒饱满，无病虫害的粳糙米，加入植物乳杆菌液体培养液，糙米与植物乳杆菌液体培养液的比例为1：2.0，于25℃浸泡10小时；将浸泡的糙米捞出，加入0.5倍体积的植物乳杆菌液体培养液，置于真空培养箱中，于真空度80kpa、25℃发芽36小时；经过发芽的糙米烘干至含水量13％，然后再进行焙炒制得米茶。焙炒程序为：100℃，35分钟；150℃，10分钟；220℃，10分钟。经hplc分析，米茶中的γ-氨基丁酸含量为65毫克/100克。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
sequencelisting
<110>温州大学
<120>一种提高米茶中γ-氨基丁酸含量的方法
<130>2018
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<213>植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）wz-01
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