一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法与流程

文档序号:15457472发布日期:2018-09-15 01:30
本发明属于基因工程
技术领域
,具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法。
背景技术
:非洲猪瘟(AfricanSwineFever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(AfricanSwineFeverVirus,ASFV)引起的猪的一种急性、烈性传染病。临床上以高热、全身性出血和高死亡率为特征。该病对养猪业危害巨大,被OIE列为A类疫病。尽管我国尚无该病的传入,却时刻面临传入的风险。因此,对该病开展储备性研究,对于该病的防范具有重要意义。ASFV为正20面体,直径约175nm~215nm。由外包膜、病毒衣壳、内包膜、核壳、病毒核酸5个组成部分。病毒核酸为双链DNA,长度为170kb~190kb。病毒基因可编码200多种蛋白质,其中结构蛋白有54种。P54蛋白是ASFV的Ⅰ型跨膜结构蛋白,由E183L基因编码,在病毒的复制过程中起重要作用,参与该病毒对细胞的吸附和侵入,能引起宿主细胞凋亡,在病毒变形和感染早期起重要作用。P54蛋白可生成二硫键,在ASFV转染细胞时,形成包膜前体,通过靶向定位内质网膜进行蛋白表达,损伤细胞,P54抗体可中和P54蛋白,部分阻断ASFV的侵入,减轻宿主细胞的损伤。迄今为止,国际上尚未有任何可预防非洲猪瘟病毒感染的疫苗,现有技术中,缺乏对非洲猪瘟防疫的疫苗或其它防范措施的研究。技术实现要素:有鉴于此,本发明的目的在于提供一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法,以制备过表达E183L基因的重组腺病毒,用于研究ASFV候选疫苗。腺病毒(Adenovirus)是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一,可用于在哺乳动物细胞中高水平地表达目的蛋白。因腺病毒感染不依赖细胞周期,故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。同时其可感染的宿主范围广泛,可感染除人以外的几乎所有类型的细胞,包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。并且具有病毒滴度高,可用于动物试验以及有较好的生物安全性等特点。因此,利用腺病毒进行表达E183L基因重组腺病毒载体的构建及重组腺病毒的包装,对研究基于表达非洲猪瘟P54蛋白的候选疫苗具有重要意义。为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体,包括pAD-EF1α-GFP腺病毒载体、插入pAD-EF1α-GFP载体的非洲猪瘟病毒E183L基因。E183L基因的序列如SEQNo.1所示。一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法,包括如下步骤:1)将E183L序列在基因合成公司合成,该序列两端加酶切位点AsisⅠ和MLuⅠ。2)用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因合成序列E183L和pKO-FH载体进行双酶切,分别得到E183L基因片段和pKO线性化载体片段。3)将所述步骤2)得到的E183L基因片段和pKO载体片段进行连接,得到pKO-E183L。4)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对所述步骤3)得到的连接产物pKO-E183L和pAD-EF1α-GFP腺病毒载体进行双酶切,分别得到线性化E183L基因片段和腺病毒pAD载体片段。5)将所述步骤4)得到的线性化E183L基因片段和腺病毒pAD载体片段进行连接,得到pAD-E183L,使用CMV-F与FH-R进行测序。6)将所述步骤5)得到的质粒pAD-E183L用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切,挑选重组阳性质粒进行后续实验。优选的,所述步骤2)中双酶切反应的酶切反应体系如下表1:表1步骤2)的双酶切体系E183L基因片段或pKO-FH载体20uL10×Buffer3μLAsisⅠ1μLMLuⅠ1μLddH2O5μL总计30μL所述双酶切的温度为37℃,所述双酶切的时间为1小时。优选的,所述步骤3)中连接体系如下表2:表2步骤3)的连接体系目的基因E183L片段2~6μLpKO载体片段2~4μL10×T4Buffer1μLT4DNA连接酶(10U/μL)1μL总计10μL所述连接的温度为22℃,所述连接的时间为2小时。优选的,所述步骤3)中连接后还包括:对所述连接得到重组质粒进行阳性菌落的构建和鉴定。优选的,所述步骤4)中双酶切的反应体系如下表3:表3步骤4)的双酶切反应体系PI-SCE1uLI-CEU1uL10×buffer5uLKO-E183L或腺病毒AD-EF1α-GFP载体20uLBSA0.5uLddH2O22.5uL总计50uL所述双酶切的酶切程序如下表4:表4步骤4)的双酶切反应程序37℃2.5小时65℃20分钟优选的,所述步骤5)中连接体系如下表5:表5步骤5)的连接体系目的基因E183L片段2~6μL腺病毒pAD载体片段2~4μL10×T4Buffer1μLT4DNA连接酶(10U/μL)1μL总计10μL所述连接的温度为22℃,所述连接的时间为2小时。优选的,所述步骤6)中单酶切的酶切反应体系如下表6:表6步骤6)的单酶切反应体系重组质粒pAD-E183L20μL10×Buffer5μLddH2O24.5μLPacⅠ0.5μL总计50μL所述单酶切程序如下表7:表7步骤6)的单酶切程序37℃3小时95℃5分钟本发明提供了表达非洲猪瘟病毒E183L基因的重组腺病毒的制备方法,由以下步骤制备得到:1)将8μL的聚醚酰亚胺PEI和250μLDMEM培养基配制成混合液Mix1,静置5分钟以上。将前述步骤6)中得到的重组阳性质粒与250μLDMEM培养基制成混合液Mix2。将混合液Mix1和Mix2均匀混合并震荡混匀,离心并静置30分钟。2)在细胞板上铺满细胞数约0.3-0.5×106个/孔的HEK293细胞。3)将步骤1)得到的静置后的混合液逐滴加入细胞板,十字混匀后置于CO2培养箱培养2-3天。4)收集具有CPE效应的细胞,破碎细胞,转移至离心管中,离心后收集上清和细胞沉淀,过滤上清得到过表达E183L基因的重组腺病毒。步骤4)具体为:收集具有CPE效应的细胞,用电移液枪移至离心管中,并做好相应的标记,离心弃上清,沉淀用A195回溶,得到回溶液;EP管分装回溶液后先干冰冻存6-10min,再置于37℃,待管中冰块即将融化时取出摇匀,反复冻融4次后,12000g离心2min,取上清备用,4℃保存;病毒的预处理:a)病毒上清处理:将在4℃条件下保存的上清离心,3500g,4℃,离心30min;离心后弃上清,收集病毒沉淀;用A195将病毒沉淀重悬,收集到管中;b)细胞沉淀处理:细胞沉淀用A195重悬,混匀,反复冻融四次;冻融时样品置于干冰中冻12-15分钟,然后转移至37℃水浴锅中融2-3分钟,如此反复四次;冻融完毕后,3500g,4℃,离心30min,分别收集上清和细胞沉淀;上清与重悬后的病毒沉淀混合;细胞碎片用A195重悬后加入5mol/LNaCl至终浓度为1moL/L;c)超声破碎细胞:重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次,AMPL值为30%,30s/次,每次间隔20-30s,至液体不粘稠;超声完毕后,12000rpm,4℃离心10min;离心后,与病毒上清和细胞沉淀处理后样品混合;用电动移液器在离心管中逐层加入不同浓度的碘克沙醇;先加入60%碘克沙醇溶液4.2mL形成第一层,再加入40%碘克沙醇溶液5mL形成第二层,其次加入25%碘克沙醇溶液6mL形成第三层,最后加入15%碘克沙醇溶液9mL形成第四层;将经过病毒的预处理步骤的病毒液加入到离心管最上层,48000rpm离心2小时30分钟;离心前应将对应的离心管配平,误差控制在0.1g以内;离心完毕,弃前5mL,收集6-10mL液体至15mL离心管并用PBS、PF68的混合液稀释至体积15mL,然后用0.20μm的滤膜过滤,将过滤后的液体置于超滤管中,3500g离心50min。将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中,最后加入5×A195储存液至储存液终溶度为1×;所述的5×A195为含30%胎牛血清的DMEM培养基,PF68为含10%甘油、10%DMSO的DMEM,百分比为质量分数;PBS、PF68的混合液中,PBS溶液、PF68溶液体积比为1:1,其中PBS溶液:NaCl137mmol/L,KCl2.7mmol/L,Na2HPO410mmol/L,KH2PO42mmol/L。相对于现有技术,本发明提供了一种E183L基因过表达腺病毒质粒pAD-E183L,以pAD-EF1α-GFP腺病毒表达载体为基础,在多克隆位点引入E183L基因,来构建E183L基因过表达腺病毒载体,所述该载体携带CMV强启动子,以便在真核细胞中过表达其携带的基因,同时该载体携带绿色荧光蛋白,可方便阳性细胞筛选,本发明提供含E183L基因的腺病毒,利用构建得到的线性化的重组质粒pAD-E183L与PEI混合,完成腺病毒包装,得到能直接感染真核细胞的腺病毒,实现E183L基因在真核细胞中正常表达的目的,为进一步研究基于表达E183L重组腺病毒载体疫苗打好基础。附图说明图1是本发明重组腺病毒质粒酶切(PacⅠ)结果图,由于重组机制的不同,酶切后条带大小不同,分为两种情况:一条为3kb或5kb左右,一条30kb左右;图2是本发明实施例中腺病毒感染HEK293的荧光表达图;图3是本发明实施例中腺病毒感染HEK293的白光表达图;图4为本发明的pKO-FH载体结构图;图5为本发明的pAD-EF1α-GFP载体结构图。具体实施方式本发明对所述混合的方法没有特殊限制,采用的培养方案没有特殊限制。本发明中,在重组腺病毒制备过程中,Mix1和Mix2混合液中的DMEM为完全培养基,提供细胞增殖的必要条件。所述完全培养基为含体积浓度为5%血清的DMEM完全培养液。使用完全培养基后,本发明将细胞在完全培养基的条件下培养48小时以上,反复冻融后,离心,弃细胞碎片,收集细胞上清,使用滤器过滤细胞上清,得到表达E183L基因的重组腺病毒。本发明中,所述过滤的方法优选采用微滤。所述微滤的孔径优选为0.2μm。本发明中,所述离心的方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的细胞离心方案即可。本发明中,所述细胞系的种类优选为HEK293细胞。实施例1直接合成目的基因片段,并加酶切位点AsisⅠ/MLuⅠ。实施例2用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因合成序列E183L和载体pKO-FH(图4)进行双酶切,分别得到线性化E183L基因片段和pKO载体片段。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小,并用胶回收试剂盒回收目的片段。双酶切体系见表1。实施例3用T4连接酶将线性化E183L基因片段和pKO载体片段进行连接,得到pKO-E183L,连接体系见表2。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。涂布于含卡那霉素抗性的LB平板,挑取单个菌落,扩大培养后提取质粒,AsisⅠ和MLuⅠ双酶切鉴定阳性克隆,并测序验证,获得正确的pKO-E183L克隆,使用CMV-F(SEQNo.2:5’CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCA-3’)与FH-R(SEQNo.3:5’CTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCG-3’)进行测序。转化过程如下:(1)从-80℃取出提前制备好的DH5a感受态置于冰浴中。(2)待DH5a感受态细胞融化后,取1μL连接产物于20μLDH5a感受态细胞中,充分混匀,冰浴中静置30分钟。(3)将离心管放入42℃水浴锅中40秒(期间不要摇动离心管),然后快速移至冰浴中,静置2分钟。(4)向离心管中加入200μL的无菌的LB培养基(不加抗生素),混匀后置于摇床中37℃,200rpm,振摇1小时后,涂布到卡那霉素抗性的固体培养基平皿中。(5)37℃培养箱中培养过夜。实施例4一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒的制备方法,该方法包括以下步骤:1)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对连接产物pKO-E183L和腺病毒pAD-EF1α-GFP载体(图5)双酶切线性化(酶切反应体系见表3,酶切反应程序见表4),胶回收相应片段。连接酶连接E183L基因片段和pAD载体片段(连接反应体系见表5),将连接产物转化大肠杆菌扩增,而后提取质粒,鉴定正确后获得pADE183L。2)将步骤1)提取的质粒用PacⅠ单酶切后重组质粒与PEI混匀离心,静置,加入DMEM培养基,其中单酶切反应体系见表6,单酶切反应程序见表7。3)将步骤2)的重组腺病毒质粒载体混合液转染HEK293细胞,病毒包装完成,即得到含有E183L基因重组腺病毒(图2和图3)。由图2和图3可知,重组病毒包装成功。步骤2)和步骤3)过程如下:1.250μlDMEM和8μlPEI配成Mix1,静置5min以上。2.250μlDMEM和单酶切后的重组质粒配成Mix2。3.将Mix1和Mix2混合,震荡混匀,离心后静置30min。4.静置期间铺6孔板HEK293细胞,细胞数约0.3-0.5×106个/孔。5.将静置后的混合液逐滴加入至6孔板的细胞中。十字混匀后置于CO2培养箱中培养。在以上技术方案中,步骤1)所述pKO-E183L质粒双酶切后回收的条带大小为目的基因E183L基因序列大小加上1.2kb。在以上技术方案中,步骤1)所述连接酶为T4DNA连接酶,所述大肠杆菌为DH5α大肠杆菌;步骤2)所述静置时间为30分钟,所述培养基为含5%牛血清的DMEM培养基。在以上技术方案中,步骤3)所述HEK293细胞装于10cm细胞盘中,十字摇匀后置于CO2培养箱培养2-3天。实施例5收集具有CPE效应的细胞,用电移液枪移至15mL离心管中,并做好相应的标记,3500rpm,离心7min。弃上清,沉淀用1mL的1xA195回溶;EP管分装后先干冰冻存6-10min,再置于37℃,待管中冰块即将融化时取出摇匀,反复冻融4次后,12000g离心2min,取上清备用。实施例6为获得纯病毒,需对样品进行一系列前处理,具体处理方法如下:1)病毒上清处理:将4℃过夜的上清离心,3500g,4℃,离心30min;离心后弃上清,收集病毒沉淀;用2mLA195将病毒沉淀重悬,收集到15mL管中。2)细胞沉淀处理细胞沉淀用6mLA195重悬,混匀,反复冻融四次。冻融时样品置于干冰中冻12-15分钟,然后转移至37℃水浴锅中融2-3分钟,如此反复四次;冻融完毕后,3500g,4℃,离心30min,分别收集上清和沉淀;上清与重悬后的病毒沉淀混合;细胞碎片用2mLA195重悬后加入0.5mL5mol/LNaCl至终浓度为1moL/L。3)超声破碎细胞重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次(AMPL值为30%,30s/次,每次间隔20-30s);超声完毕后,12000rpm,4℃离心10min。离心后,与病毒上清和细胞沉淀处理后样品混合,即离心后获得的样品与病毒上清(病毒上清处理步骤获得的产物、细胞沉淀处理步骤中获得的上清)和细胞沉淀处理后的样品(细胞沉淀处理步骤获得的细胞碎片重悬后产物)混合。实施例7病毒纯化与浓缩,具体步骤如下:1)用电动移液器在50mL离心管中逐层加入不同浓度的碘克沙醇。先加入60%碘克沙醇层4.2mL,再加入40%碘克沙醇层5mL,其次加入25%碘克沙醇层6mL,最后加入15%碘克沙醇层9mL。碘克沙醇溶液的浓度为质量浓度,溶剂为150mmol/LKCl、30mmol/LMgCl2、120mmol/L三甲基甘氨酸的KOH溶液,pH7.8。2)将处理好的病毒液加入到最上层,48000rpm离心2小时30分钟。离心前应将对应的离心管配平,误差控制在0.1g以内。3)离心完毕,弃前5mL,收集6-10mL液体至15mL离心管并用PBS+PF68稀释至体积15mL,然后用0.20μm的滤膜过滤;将过滤后的液体置于一个15ml的超滤管中,3500g离心50min;如果超滤管中剩下的液体体积还不到理想体积,需要将离心下去的液体弃掉,向超滤管中加入PBS+PF68稀释,再次离心。时间长短可以根据溶液的粘稠程度而定。4)将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中,最后加入5×A195储存液至储存液终溶度为1×。所述的5×A195为含30%胎牛血清的DMEM培养基,PF68为含10%甘油、10%DMSO的DMEM。PBS、PF68的混合液中,PBS溶液、PF68溶液体积比为1:1,其中PBS溶液:NaCl137mmol/L,KCl2.7mmol/L,Na2HPO410mmol/L,KH2PO42mmol/L。选取的A195、PF68配方,使得对病毒损伤小。实施例8对已制备好的病毒进行滴度检测,具体步骤如下:1)去除病毒外壳,各组成体系如下表8:表8滴度检测组成成分组成成分体积病毒液5μL蛋白酶K(5μg/μL)1μL超纯水4μL37℃孵育30min,然后95℃维持5min使酶失活。2)12,000rpm离心2min,取上清。3)设置7个梯度稀释浓度分别为:2.58╳1012vp/μl,2.58╳1011vp/μl,2.58╳1010vp/μl,2.58╳109vp/μl,2.58╳108vp/μl,2.58╳107vp/μl,并将超纯水作为阴性对照。4)PCR检测,总共20μL体系,具体反应体系如下表9:表9滴度检测具体反应体系组成成分体积2XSYBRGreen缓冲液10μLF、R引物混合物0.8μL超纯水7.2μL病毒样品或标准品2μL总计20μL所述步骤4)中PCR如下95℃5min;95℃15sec;60℃15sec;72℃15sec;40个循环。5)病毒颗粒数(个/mL)=与标准品相对值×1000。病毒颗粒数检测结果为2.58╳1010vp/ml。实施例9病毒特异性检测,具体步骤如下:1)去除病毒外壳,各组成体系如下表10:表10特异性检测组成成分组成成分体积病毒液5μL蛋白酶K(5μg/μL)1μL超纯水4μL37℃孵育30min,然后95℃维持5min使酶失活。2)12,000rpm离心2min,取上清。3)PCR反应,总共20μL体系,具体反应体系如下表11:表11PCR反应体系步骤2)中所得产物1.5μL10×Taq酶buffer2μLdNTP0.4μLTaq酶0.3μLDMSO1μLF,R引物混合物4μL超纯水10.8μL总计20μL所述步骤3)中qPCR反应程序如下:95℃4min;95℃30sec;64℃45sec;72℃1min1cycles95℃30sec;62℃45sec;72℃1min2cycles95℃30sec;60℃45sec;72℃1min3cycles95℃30sec;58℃45sec;72℃1min26cycle72℃10min;4℃无限4)PCR产物跑胶,胶回收测序。将PCR产物与E183L序列进行序列比对,结果为同源性100%。以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表<110>扬州大学<120>一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法<130>xhx2018032805<141>2018-03-28<160>3<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>552<212>DNA<213>Africanswinefevervirus<400>1atggattctgaattttttcaaccggtttatccgcggcattatggtgagtgtttgtcacca60gtcactacaccaagcttcttctccacacatatgtatactattctcattgctatcgtggtc120ttagtcatcattatcatcgttctaatctatctattctcttcaagaaagaaaaaagctgct180gctattgaggaggaagatatacagtttataaatccttatcaagatcagcagtgggtagaa240gtcactccacaaccaggtacctctaaaccagctggagcgactacagcaagtgtaggcaag300ccagtcacgggcagaccggcaacaaacagaccagcaacaaacaaaccagttacggacaac360ccagttacggacagactagtcatggcaactggcgggccggcggccgcacctgcggccgcg420agtgctcctgctcatccggctgagccttacacgacagtcactactcagaacactgcttca480caaacaatgtcggctattgaaaatttacgacaaagaaacacctatacgcataaagaccta540gaaaactccttg552<210>2<211>24<212>DNA<213>Adenoviridae<400>2caatgggagtttgttttggcacca24<210>3<211>29<212>DNA<213>Adenoviridae<400>3cttattagtggtggtggtggtggtgctcg29当前第1页1 2 3 
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