一种用于假肉监测的检测方法与流程

文档序号:15457508发布日期:2018-09-15 01:31

本发明涉及食品检测领域,尤其涉及了一种用于假肉监测的检测方法。



背景技术:

中国畜禽肉品的消费市场庞大,六十年来我国年人均肉类消费量增长了近13倍。随着需求的不断增大,交易市场不规范、市场管理水平低下等为不法分子的不法行为提供了可乘之机,肉类尤其是牛肉、羊肉、驴肉等高价肉品掺假利润丰厚,掺假肉主要集中在注水、注胶肉;牛、羊肉中掺杂鸭肉或猪肉;牛、羊肉与狗肉等肉类食品中掺杂植物源型蛋白;再有,肉制品中掺杂狐狸肉、貉子肉等经济动物肉等形式。

传统对肉品质的鉴别方法主要是依赖于感官判断和形态学检验。但感官判断和形态学检验的局限性较大,尤其不适用于肉类来源鉴别和加工产品的鉴别。

目前对肉类成分的鉴别方法主要包括:基于蛋白的检测方法,如免疫学方法和液相色谱方法;以及基于核酸的方法,主要包括利用PCR技术对肉源性成分鉴别的方法。由于食品前处理过程易使得蛋白变性或降解,同时对肉类食品的原材料来自何种组织或器官无法了解,而许多蛋白在不同组织不同器官中的表达情况都存在不同,因此基于蛋白的肉类检测方法存在一定的局限性。基于核酸检测的荧光定量PCR技术由于其灵敏度高,操作简易,检测过程短,因而在日常肉类成分鉴别中有着普遍的应用,常用的荧光定量PCR法包括TaqManTM和SYBR Green两种。TaqManTM方法由于需要合成荧光标记的特异性引物,对不同的肉类成分需要合成不同的特异性探针,导致检测成本高。而SYBR Green方法则是将荧光染料加在反应体系中,无需合成荧光标记的特异性探针,因而更加简便且检测成本较低。在利用核酸对肉类成分检测的方法中,由于一些深加工肉制品,DNA损失的程度在90%以上,同时由于不同食品的配料和生产方式不同,因此有可能存在抑制PCR的成分,容易导致对肉类成分鉴定的PCR反应不成功,从而出现假阴性样品的结果。因此,畜肉及深加工肉制品掺假亟待需开发一种简便、高效、快速的检测方法。



技术实现要素:

本发明针对现有技术中样品预处理繁杂、检测成本较高和易出现假阳性等缺点,提供了一种简便、高效、快速的用于假肉监测的检测方法。

为了解决上述技术问题,本发明通过下述技术方案得以解决:

一种用于假肉监测的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤一,样品DNA提取

50mg肉组织用液氮研磨成粉,加入1mL细胞裂解液;样品在55℃恒温过夜;溶解产物转移至离心管,加入1mL的Tris饱和酚和1mL的8-羟基喹啉,混匀轻摇10min后进行第一次离心后取第一水相,用1/2第一水相体积的Tris饱和酚萃取后进行第二次离心后取第二水相,加入1/2第二水相体积的氯仿,混匀30s后进行第三次离心取第三水相;将第三水相转移至另一离心管,用均为1/20第三水相体积、浓度为3mol/L的醋酸钠和无水乙醇沉淀后进行第四次离心,弃上清,得到的沉淀物用70%的乙醇清洗,干燥后溶于100μL TE缓冲液中得到DNA提取物,该提取物即为DNA模板,用超微量核酸蛋白分析仪测定模板DNA的质量和浓度;

细胞裂解液为Tris-HCI、EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠(SDS)、核糖核酸酶(RNase酶)组成的混合液,其中Tris-HCI的浓度为50mmol/L、pH为8.0,乙二胺四乙酸的浓度为10mmol/L、pH为8.0,NaCl的浓度为100mmol/L,蛋白酶K的浓度150μg/mL,十二烷基硫酸钠的质量分数为2%,核糖核酸酶的体积为10μL;TE缓冲液:10mL浓度为1mol/L、pH为8.0的Tris-HCl和2mL浓度为500mmol/L、pH为8.0的EDTA混合,之后加水定容至1000mL,121℃高压灭菌20min;

步骤二,根据猪(GenBank登录号:GU135833.1)、牛(GenBank登录号:HQ184045.1)、山羊(GenBank登录号:AB044308.1)、鸡(GenBank登录号:GU261717.1)线粒体细胞色素b基因序列,应用CLUSTALW1.83软件和BLAST软件进行序列比较,用Primer Premier 5.0设计一条公用上游引物,再根据种属间的差异设计各自的特异下游引物,建立反应体系,反应体系为:25μL由10×SYBR Green I,3.0μL DNA模板,15μLIsothermal Master Mix Iso-001,上游引物与7条下游引物各0.5μL组成。

作为优选,第一次离心、第二次离心的离心条件:温度为15℃、转速为10000rpm,离心时间为10min;第三次离心、第四次离心的离心条件:相对离心场为1200g,离心时间为15min。

作为优选,上游引物序列为5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3',下游引物序列为:牛5'-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-3';山羊5'-CTCGACAAATGTGAGTTACAGAGGAA-3';猪5'-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3';鸡5'-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3'。

作为优选,牛、山羊、猪、鸡的特异性扩增产物片段分别为274bp,157bp,398bp,227bp。

经复杂加工的熟肉制品提取的DNA片段有时会破碎断裂,因而选取了扩增效果最稳定、扩增片段小的引物,避免了肉因高温高压处理DNA被破坏而引起的假阴性结果。

作为优选,反应体系的反应条件为95℃预变性3min;40个循环:95℃变性30s,58~68℃退火30~50s,72℃延伸30s。

作为优选,反应体系的反应条件为95℃预变性3min;40个循环:95℃变性30s,59℃退火31s,72℃延伸30s。

本发明由于采用了以上技术方案,具有显著的技术效果:采用液氮研磨,防止了因研磨过程中发热而导致的DNA降解和断裂,从而保证DNA的完整性,且节省时间;去除蛋白质常用酚/氯仿提取,但酚类物质具有高度腐蚀性,易引起严重烧伤,并且易被氧化产生醌、二酸等破坏核酸的二酯键,并引起DNA链的交联,因此在离心时同时加入Tris饱和酚和8-羟基喹啉,以减少酚氧化,并提供颜色指示;现有一般采用醋酸钠和无水乙醇沉淀DNA,但无水乙醇容易将醋酸钠一起沉淀,在DNA沉淀中无水乙醇难以挥发除去,且实验的重复性差,加入无水乙醇可以使DNA沉淀完全;经复杂加工的熟肉制品提取的DNA片段有时会破碎断裂,因而选取了扩增效果最稳定、扩增片段小的引物,避免了肉因高温高压处理DNA被破坏而引起的假阴性结果;可以根据需要灵活组合鉴定的肉制品种类和检测样本的份数。

附图说明

图1为引物灵敏度电泳图谱,M:1000bp ladder DNAmarker;C:鸡;B:牛;S:山羊;P:猪。

图2为本发明实施例1引物特异性电泳谱图。

图3为本发明实施例2引物特异性电泳谱图。

图4为本发明实施例3引物特异性电泳谱图。

图5为本发明实施例4引物特异性电泳谱图。

具体实施方式

下面实施例是对本发明进一步详细描述,但不是限制本发明的范围。

实施例1

一种用于假肉监测的检测方法,包括以下步骤:

步骤一,样品DNA提取

50mg肉组织用液氮研磨成粉,加入1mL细胞裂解液;样品在55℃恒温过夜;溶解产物转移至离心管,加入1mL的Tris饱和酚和1mL的8-羟基喹啉,混匀轻摇10min后进行第一次离心后取第一水相,用1/2第一水相体积的Tris饱和酚萃取后进行第二次离心后取第二水相,加入1/2第二水相体积的氯仿,混匀30s后进行第三次离心取第三水相;将第三水相转移至另一离心管,用均为1/20第三水相体积、浓度为3mol/L的醋酸钠和无水乙醇沉淀后进行第四次离心,弃上清,得到的沉淀物用70%的乙醇清洗,干燥后溶于100μL TE缓冲液中得到DNA提取物,该提取物即为DNA模板,用超微量核酸蛋白分析仪测定模板DNA的质量和浓度;

细胞裂解液为Tris-HCI、EDTA、NaCl、蛋白酶K、SDS、RNase酶组成的混合液,其中Tris-HCI的浓度为50mmol/L、pH为8.0,乙二胺四乙酸的浓度为10mmol/L、pH为8.0,NaCl的浓度为100mmol/L,蛋白酶K的浓度150μg/mL,十二烷基硫酸钠的质量分数为2%,核糖核酸酶的体积为10μL;TE缓冲液:10mL浓度为1mol/L、pH为8.0的Tris-HCl和2mL浓度为500mmol/L、pH为8.0的EDTA混合,之后加水定容至1000mL,121℃高压灭菌20min;

步骤二,根据牛、山羊、猪、鸡线粒体基因,应用CLUSTALW1.83软件和BLAST软件进行序列比较,用PrimerPremier 5.0设计一条公用上游引物,再根据种属间的差异设计各自的特异下游引物,建立反应体系,反应体系为:25μL由10×SYBR Green I,3.0μL DNA模板,15μLIsothermal MasterMix Iso-001,Isothermal Master Mix Iso-001购自英国的Optigene公司;上游引物与4条下游引物各0.5μL组成。

第一次离心、第二次离心的离心条件:温度为15℃、转速为10000rpm,离心时间为10min;第三次离心、第四次离心的离心条件:相对离心场为1200g,离心时间为15min。

上游引物序列为5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3',下游引物序列为:牛5'-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-3';山羊5'-CTCGACAAATGTGAGTTACAGAGGAA-3';猪5'-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3';鸡5'-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3'。

牛、山羊、猪、鸡的特异性扩增产物片段分别为274bp,157bp,398bp,227bp。

经复杂加工的熟肉制品提取的DNA片段有时会破碎断裂,因而选取了扩增效果最稳定、扩增片段小的引物,避免了肉因高温高压处理DNA被破坏而引起的假阴性结果。

反应体系的反应条件为95℃预变性3min;40个循环:95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s。

实施例2

与实施例1相同,不同之处在于,反应体系的反应条件为95℃预变性3min;40个循环:95℃变性30s,60℃退火40s,72℃延伸30s。

实施例3

与实施例1相同,不同之处在于,反应体系的反应条件为95℃预变性5min;40个循环:95℃变性40s,65℃退火50s,72℃延伸30s。

实施例4

与实施例1相同,不同之处在于,反应体系的反应条件为95℃预变性5min;40个循环:95℃变性40s,68℃退火30s,72℃延伸30s。

实施例5

与实施例1相同,不同之处在于,反应体系的反应条件为95℃预变性3min;40个循环:95℃变性30s,59℃退火31s,72℃延伸30s。

实验结果

1、DNA提取方法对浓度与OD260/280值的影响

表1 DNA提取方法对浓度与OD260/280值的影响

实施例2、实施例3、实施例4、实施例5与实施例1的检测结果相同,CTAB-蛋白酶K法由于对肌肉组织消化效果较差,因此,DNA的提取效率低,实施例1中对样品DNA的提取因为在离心时同时加入饱和酚和8-羟基喹啉,以减少酚氧化,并提供颜色指示;现有一般采用醋酸钠和无水乙醇沉淀DNA,但无水乙醇容易将醋酸钠一起沉淀,在DNA沉淀中无水乙醇难以挥发除去,且实验的重复性差,加入70%的乙醇可以使DNA沉淀完全。因此,相对于试剂盒法,实施例1-5的提取效率高,而且无蛋白质、酚的污染。

2、肉样检测

表2肉样检测结果

3、退火温度及时间对反应特异性的影响

退火温度是引物与模板结合的温度,是影响反应特异性的重要因素,退火温度过低会产生非特异性扩增,退火温度过高扩增不出目的片段,对退火温度的控制可以保证整个目的片段的完整扩增。将100ng·μL-1猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉来源的DNA模板原液进行10倍梯度稀释,使用引物对之进行检测以考察方法的灵敏度,结果如图1所示。实施例1、实施例2、实施例3及实施例4对反应特异性的影响如图2-5所示,实施例5与实施例4一致,实施例1的扩增电泳带最为清晰,实施例3的最为不清晰。

总之,以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰,皆应属本发明专利的涵盖范围。

再多了解一些
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