本发明属于食品生物技术的分子生物学领域，具体地涉及一种新调控基因aurt及利用新调控基因aurt提高金褐霉素产量的方法。
背景技术：
金褐霉素(aureofuscin)是金褐链霉菌产生的一种四烯大环内酯类抗真菌抗生素，与国外文献报道的纳他霉素的化学结构类似。根据研究报道，金褐霉素对霉菌、多种酵母菌及丝状真菌有很强的抗菌作用，但不抗细菌，临床上用于治疗真菌性角膜炎，其疗效优于两性霉素b，同时对一些真菌引起的皮肤病及霉菌性阴道炎等也有很好疗效。金褐霉素发酵产量低，提取得率也不高，前期从发酵水平上提高金褐霉素的产量效果不理想，所以更深入的从分子水平出发研究和实现产业化开发，以进一步增加金褐霉素的产量具有实际的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是从分子水平获得金褐链霉菌中的调控基因aurt，并利用其提高金褐霉素的产量。
本发明采用的技术方案是：新调控基因aurt，所述的新调控基因aurt的氨基酸序列如seqidno:1所示。
新调控基因aurt在提高金褐霉素产量中的应用。方法包括如下步骤：
(一)利用pcr扩增技术提取金褐链霉菌基因组dna中的调控基因aurt，将基因aurt克隆到表达质粒载体pset152中，获得含有调控基因aurt的重组质粒pbjaurt。具体为：
1)提取野生型金褐链霉菌的总dna；
2)以t1和t2为引物，以总dna为模板，进行pcr扩增，得645bp的aurt基因；所述的t1和t2的的序列为：
t1：5'-atggtgtccacggagagcat-3'；
t2：5'-ctagtcggcgcggcccgtcg-3'
pcr扩增体系(20ul):t1:1ul；t2:1ul；dna模板:1ul；10×pcrbuffer:2ul；dntpmixture:1.6ul；ddh2o:13ulpcr。
pcr扩增反应条件是：94℃，5min；95℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min；30个循环；72℃，7min；4℃，保温。
3)将aurt基因和表达质粒载体pset152分别通过bamhi和ecorv限制性内切酶双酶切，经过t4dnaligase连接，构建重组质粒pbjaurt。
(二)将含有调控基因aurt的重组质粒pbjaurt转化进入大肠杆菌et12567中，得到转化子。具体为：将含有调控基因aurt的重组质粒pbjaurt转化到大肠杆菌et12567感受态细胞中，涂布在含有50ug/ml安普霉素的lb培养基上，37℃过夜培养，得到转化子。
(三)利用大肠杆菌-链霉菌接合转移的方法，将金褐链霉菌孢子于50℃下热激10min和预萌发后与步骤(二)得到的转化子按重量比1:1混匀，30℃培养13-20小时后，用50ug/ml的安普霉素和25ug/ml的萘啶酮酸进行覆盖，30℃继续培养24-48小时后，得到接合转移子。
(四)将筛选的接合转移子在发酵培养基中进行发酵培养。优选的，所述的发酵培养基组成为：酵母浸粉0.2％、可溶性淀粉1％、水余量。更优选的，将接合转移子按10％的接种量接种至发酵培养基中，于29℃，220rpm条件下振荡培养。
本发明的有益效果是：本发明优化了金褐链霉菌基因组dna的pcr扩增体系，获得了新调控基因aurt。通过属间接合转移体系，使得aurt基因能在野生型金褐链霉菌中进行表达。经过多次筛选后得到转化子并发酵培养，采用hplc法测定金褐霉素的产量。与野生型金褐链霉菌菌株相比发酵产量增加约3.5倍，且在传代过程中产量稳定。重组菌株能够提高金褐霉素的产量，说明aurt基因可以促进金褐霉素的生物合成。从分子水平证明提高金褐链霉菌中的调控基因aurt水平是增加金褐霉素产量的有效方法。
附图说明
图1是质粒pbjaurt的构建图。
图2是金褐链霉菌基因组dna中的aurt基因的pcr结果图。
图3a是hplc法测定标准品金褐霉素色谱峰。
图3b是转化子发酵产金褐霉素色谱峰。
图3c是原始金褐链霉菌菌株产金褐霉素色谱峰。
具体实施方式
实施例提高金褐霉素产量的方法
(一)方法如下：
1、利用pcr扩增技术提取金褐链霉菌基因组dna中的调控基因aurt，将基因aurt克隆到表达质粒载体pset152中，获得含有调控基因aurt的重组质粒pbjaurt。具体为：
1)提取野生型金褐链霉菌的总dna；
2)以t1和t2为引物，以总dna为模板，进行pcr扩增，得645bp的aurt基因；所述的t1和t2的的序列为：
t1：5'-atggtgtccacggagagcat-3'
t2：5'-ctagtcggcgcggcccgtcg-3'
pcr扩增体系(20ul):t1:1ul；t2:1ul；dna模板:1ul；10×pcrbuffer:2ul；dntpmixture:1.6ul；ddh2o:13ul。
pcr反应条件是：94℃，5min；95℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min；30个循环；72℃，7min；4℃，保温。
获得的调控基因aurt的pcr结果如图2，由图2可见，左到右依次为100bpdnamarker和aurt基因，aurt在645bp处显示亮带。
获得的调控基因aurt的氨基酸序列如seqidno：1，蛋白序列如seqidno：2。
3)将aurt基因和表达载体pset152分别进行bamhi和ecorv限制性内切酶双酶切，经过t4dna连接酶连接，构建重组质粒pbjaurt。
2、将含有调控基因aurt的重组质粒pbjaurt转化到大肠杆菌et12567感受态细胞中，涂布在含有50ug/ml安普霉素的lb培养基上，37℃过夜培养，得到转化子。
3、利用大肠杆菌-链霉菌接合转移的方法，将金褐链霉菌孢子于50℃下热激10min和预萌发后与步骤2得到的转化子按重量比1:1混匀，30℃培养13-20小时后，用50ug/ml的安普霉素和25ug/ml的萘啶酮酸进行覆盖，30℃继续培养24-48小时后，得到接合转移子。这就使得含有调控基因aurt的重组质粒转入野生型金褐链霉菌菌株的染色体dna上。
挑取单菌落，分别进行菌落pcr和酶切检测，经过琼脂糖凝胶电泳，结果显示在约645bp处明显有很亮的条带，即挑选出重组质粒。
4、将接合转移子到含安普霉素和萘啶酮酸的平板上，继代培养，将筛选的接合转移子按照10％的接种量接种至发酵培养基(酵母浸粉0.2％、可溶性淀粉1％)中，于29℃，220rpm条件下振荡培养。
(二)检测
将发酵液采用hplc法测定分析金褐霉素的产量变化情况。结果如图3a-图3c。图3a代表金褐霉素标准品；图3b代表转化子发酵液；图3c代表原始金褐链霉菌菌株，标准品和发酵液均在保留时间6.9min时得到目标产物，原始菌株在保留时间7.45min时得到目标产物；根据色谱峰测定金褐霉素的产量变化，与原始金褐链霉菌菌株相比转化子发酵产量增加约3.5倍。
<110>辽宁大学
<120>新调控基因aurt及其在提高金褐霉素产量中的应用
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<212>dna
<213>金褐链霉菌调控基因aurt
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<212>氨基酸
<213>金褐链霉菌调控基因aurt
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