新调控基因AurT及其在提高金褐霉素产量中的应用的制作方法

文档序号:15457449发布日期:2018-09-15 01:30

本发明属于食品生物技术的分子生物学领域,具体地涉及一种新调控基因AurT及利用新调控基因AurT提高金褐霉素产量的方法。



背景技术:

金褐霉素(Aureofuscin)是金褐链霉菌产生的一种四烯大环内酯类抗真菌抗生素,与国外文献报道的纳他霉素的化学结构类似。根据研究报道,金褐霉素对霉菌、多种酵母菌及丝状真菌有很强的抗菌作用,但不抗细菌,临床上用于治疗真菌性角膜炎,其疗效优于两性霉素B,同时对一些真菌引起的皮肤病及霉菌性阴道炎等也有很好疗效。金褐霉素发酵产量低,提取得率也不高,前期从发酵水平上提高金褐霉素的产量效果不理想,所以更深入的从分子水平出发研究和实现产业化开发,以进一步增加金褐霉素的产量具有实际的意义。



技术实现要素:

本发明的目的是从分子水平获得金褐链霉菌中的调控基因AurT,并利用其提高金褐霉素的产量。

本发明采用的技术方案是:新调控基因AurT,所述的新调控基因AurT的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

新调控基因AurT在提高金褐霉素产量中的应用。方法包括如下步骤:

(一)利用PCR扩增技术提取金褐链霉菌基因组DNA中的调控基因AurT,将基因AurT克隆到表达质粒载体pSET152中,获得含有调控基因AurT的重组质粒PBJAurT。具体为:

1)提取野生型金褐链霉菌的总DNA;

2)以T1和T2为引物,以总DNA为模板,进行PCR扩增,得645bp的AurT基因;所述的T1和T2的的序列为:

T1:5'-ATGGTGTCCACGGAGAGCAT-3';

T2:5'-CTAGTCGGCGCGGCCCGTCG-3'

PCR扩增体系(20ul):T1:1ul;T2:1ul;DNA模板:1ul;10×PCR buffer:2ul;dNTP Mixture:1.6ul;ddH2O:13ul PCR。

PCR扩增反应条件是:94℃,5min;95℃,30sec,55℃,30sec,72℃,1min;30个循环;72℃,7min;4℃,保温。

3)将AurT基因和表达质粒载体pSET152分别通过BamHI和EcoRV限制性内切酶双酶切,经过T4DNA ligase连接,构建重组质粒PBJAurT。

(二)将含有调控基因AurT的重组质粒PBJAurT转化进入大肠杆菌ET12567中,得到转化子。具体为:将含有调控基因AurT的重组质粒PBJAurT转化到大肠杆菌ET12567感受态细胞中,涂布在含有50ug/ml安普霉素的LB培养基上,37℃过夜培养,得到转化子。

(三)利用大肠杆菌-链霉菌接合转移的方法,将金褐链霉菌孢子于50℃下热激10min和预萌发后与步骤(二)得到的转化子按重量比1:1混匀,30℃培养13-20小时后,用50ug/ml的安普霉素和25ug/ml的萘啶酮酸进行覆盖,30℃继续培养24-48小时后,得到接合转移子。

(四)将筛选的接合转移子在发酵培养基中进行发酵培养。优选的,所述的发酵培养基组成为:酵母浸粉0.2%、可溶性淀粉1%、水余量。更优选的,将接合转移子按10%的接种量接种至发酵培养基中,于29℃,220rpm条件下振荡培养。

本发明的有益效果是:本发明优化了金褐链霉菌基因组DNA的PCR扩增体系,获得了新调控基因AurT。通过属间接合转移体系,使得AurT基因能在野生型金褐链霉菌中进行表达。经过多次筛选后得到转化子并发酵培养,采用HPLC法测定金褐霉素的产量。与野生型金褐链霉菌菌株相比发酵产量增加约3.5倍,且在传代过程中产量稳定。重组菌株能够提高金褐霉素的产量,说明AurT基因可以促进金褐霉素的生物合成。从分子水平证明提高金褐链霉菌中的调控基因AurT水平是增加金褐霉素产量的有效方法。

附图说明

图1是质粒PBJAurT的构建图。

图2是金褐链霉菌基因组DNA中的AurT基因的PCR结果图。

图3A是HPLC法测定标准品金褐霉素色谱峰。

图3B是转化子发酵产金褐霉素色谱峰。

图3C是原始金褐链霉菌菌株产金褐霉素色谱峰。

具体实施方式

实施例提高金褐霉素产量的方法

(一)方法如下:

1、利用PCR扩增技术提取金褐链霉菌基因组DNA中的调控基因AurT,将基因AurT克隆到表达质粒载体pSET152中,获得含有调控基因AurT的重组质粒PBJAurT。具体为:

1)提取野生型金褐链霉菌的总DNA;

2)以T1和T2为引物,以总DNA为模板,进行PCR扩增,得645bp的AurT基因;所述的T1和T2的的序列为:

T1:5'-ATGGTGTCCACGGAGAGCAT-3'

T2:5'-CTAGTCGGCGCGGCCCGTCG-3'

PCR扩增体系(20ul):T1:1ul;T2:1ul;DNA模板:1ul;10×PCR buffer:2ul;dNTP Mixture:1.6ul;ddH2O:13ul。

PCR反应条件是:94℃,5min;95℃,30sec,55℃,30sec,72℃,1min;30个循环;72℃,7min;4℃,保温。

获得的调控基因AurT的PCR结果如图2,由图2可见,左到右依次为100bp DNA Marker和AurT基因,AurT在645bp处显示亮带。

获得的调控基因AurT的氨基酸序列如SEQ ID NO:1,蛋白序列如SEQ ID NO:2。

3)将AurT基因和表达载体pSET152分别进行BamHI和EcoRV限制性内切酶双酶切,经过T4DNA连接酶连接,构建重组质粒PBJAurT。

2、将含有调控基因AurT的重组质粒PBJAurT转化到大肠杆菌ET12567感受态细胞中,涂布在含有50ug/ml安普霉素的LB培养基上,37℃过夜培养,得到转化子。

3、利用大肠杆菌-链霉菌接合转移的方法,将金褐链霉菌孢子于50℃下热激10min和预萌发后与步骤2得到的转化子按重量比1:1混匀,30℃培养13-20小时后,用50ug/ml的安普霉素和25ug/ml的萘啶酮酸进行覆盖,30℃继续培养24-48小时后,得到接合转移子。这就使得含有调控基因AurT的重组质粒转入野生型金褐链霉菌菌株的染色体DNA上。

挑取单菌落,分别进行菌落PCR和酶切检测,经过琼脂糖凝胶电泳,结果显示在约645bp处明显有很亮的条带,即挑选出重组质粒。

4、将接合转移子到含安普霉素和萘啶酮酸的平板上,继代培养,将筛选的接合转移子按照10%的接种量接种至发酵培养基(酵母浸粉0.2%、可溶性淀粉1%)中,于29℃,220rpm条件下振荡培养。

(二)检测

将发酵液采用HPLC法测定分析金褐霉素的产量变化情况。结果如图3A-图3C。图3A代表金褐霉素标准品;图3B代表转化子发酵液;图3C代表原始金褐链霉菌菌株,标准品和发酵液均在保留时间6.9min时得到目标产物,原始菌株在保留时间7.45min时得到目标产物;根据色谱峰测定金褐霉素的产量变化,与原始金褐链霉菌菌株相比转化子发酵产量增加约3.5倍。

<110> 辽宁大学

<120> 新调控基因AurT及其在提高金褐霉素产量中的应用

<160> 2

<210> 1

<211> 645

<212> DNA

<213> 金褐链霉菌调控基因AurT

<400> 1

ATGGTCTCCACGGAGAGCATCCTCGCGTTCGCGGCGATGTCGCTACTGGTGATCGTGATT 60

CCGGGGCCGAGCGTGCTGTTTGTGATCGGCAGAGCCCTTGCGCACGGCCGCCGCACGGCG 120

CTCGCGACGGTCCTCGGCAACCTGGTCGGCTCGTACCTCCTGGTGACGGCTGTGGCGTGG 180

GGCCTCGGCGCGCTGGTGGAAGGTTCGGTGGCGGTGTTCACGGGCGTGAAGCTGGCCGGC 240

GCGGCGTATCTCGTCTACCTCGGCGTGCGCGCGTTCCGGCACCGCAAGGAGATGCGCGCG 300

GCGGACATGGAGGCCCCGGCGGGTGAGCGGCGCGGCGATCTGCGCACGATCCTGGACGGG 360

ATTTTCGTGGGCGTCACCAATCCGAAGGGCGTCGTCTTCTTCGCGGCGGTGCTGCCGCAG 420

TTCGTGAACCACTCGGCCGGCCGGGTTCCCCTCCAGATGATGGTGTTGGGGCTGGTCCCG 480

GTCGCCATCGGCATGATCACGGACACCCTGTGGGGCCTGGGTGCCGCGGCGGCCCGTTCG 540

TGGTTCGCCCGCTCGGACCGCCGCCTGTCGATGGTCGGCGGGGCGGGCGGCTTCGCGATG 600

ATCGGGCTGGGCGTGACCGTGGCAGCGACGGGCCGCGACGACTAG 645

<210> 2

<211> 214

<212> 氨基酸

<213> 金褐链霉菌调控基因AurT

<400> 2

MVSTESILAFAAMSLLVIVIPGPSVLFVIGRALAHGRRTALATVLGNLVGSYLLVTAVAW 60

GLGALVEGSVAVFTGVKLAGAAYLVYLGVRAFRHRKEMRAADMEAPAGERRGDLRTILDG 120

IFVGVTNPKGVVFFAAVLPQFVNHSAGRVPLQMMVLGLVPVAIGMITDTLWGLGAAAARS 180

WFARSDRRLSMVGGAGGFAMIGLGVTVAATGRDD 214

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