本发明涉及微藻生物技术领域，具体涉及一种利用碳酸氢钠作为碳源的杜氏藻培养基、微藻培养方法、利用微藻进行诱导β-胡萝卜素等方面的应用。
背景技术：
盐生杜氏藻也称为杜氏盐藻，是一种耐盐真核绿藻，在环境胁迫条件下(高光强、温度应激、营养胁迫以及重金属刺激)以脂质球的形式在细胞中的叶绿体内大量积累β-胡萝卜素，使得整个细胞呈橙红色，所以盐生杜氏藻被认为是研究生物抗逆生长以及类胡萝卜素合成代谢的模式生物。β-胡萝卜素是一种天然的抗氧化剂，主要应用于营养、医药、化妆品和食品等方面，自二十世纪八十年代起，盐生杜氏藻已被多个国家和地区(以色列、澳大利亚、中国、美国和墨西哥等)用来生产高含量β-胡萝卜素的藻粉以及天然β-胡萝卜素。突出的功能功效和人们日益追求健康的理念使得β-胡萝卜素有着巨大的市场需求。
碳通常占微藻生物质干重的50％，其中碳传质对微藻高效培养以及光生物反应器的开发非常重要。在目前的商业化培养体系中，通常以二氧化碳气体作为无机碳供应，这种通气方式给光生物反应器的设计和运行带来诸多问题，导致盐生杜氏藻生产成本较高。其中，在光生物反应器中通过鼓泡通入含有二氧化碳的压缩气体，需要为每个光生物反应器安装鼓泡通气的管道系统，这在大规模培养过程中其实是很难实现的，庞大数量光生物反应器的鼓泡通气系统需要非常复杂的通气管道，这在一定程度上增加了每个反应器的制作成本和主体通气管道的建造成本，同时也会大大增加利用盐生杜氏藻生产β-胡萝卜素的生产成本。针对这种情况，碳酸氢盐是一种更好的碳源供应方式，因为碳酸氢盐不仅易于运输和存储，另外，高浓度的碳酸氢盐是良好的ph缓冲剂，可以使培养体系中的ph值维持恒定。
同时，与利用二氧化碳作为碳源不同的是，使用碳酸氢钠作为碳源时，面临着高浓度的钙离子和镁离子与碳酸盐产生沉淀的挑战。以碳酸氢盐为碳源培养微藻时，ph值会上升，从而产生碳酸盐，当ph过高时，会形成碳酸钙和碳酸镁的沉淀。尽管ph值的调整可以避免这个问题，但实际上在大规模培养中对ph值进行实时调控是不可行的。因此，当碳酸氢盐用作无机碳时，需要仔细控制初始培养基中的钙离子和镁离子浓度，而这些参数是现有技术无法提供的。
利用碳酸氢盐作为盐生杜氏藻生长的碳源时，藻细胞对碳源的生理响应与二氧化碳作为碳源不同，盐生杜氏藻细胞对营养元素的需求也与利用二氧化碳作为碳源时有所差别。更重要的是，在利用碳酸氢盐为无机碳源时，培养基中各种元素对盐生杜氏藻细胞生长和β-胡萝卜素积累影响与利用气体二氧化碳时均有不同。所以，需要针对碳酸氢钠为碳源的情况专门优化培养基中各种元素的浓度，而不能沿用采用二氧化碳为碳源时的浓度。
技术实现要素：
针对以上这些问题，本发明公开了一种在利用碳酸氢盐为碳源培养杜氏藻时的培养基配方，技术方案为，利用碳酸氢盐作为碳源，并优化其使用浓度，提高碳供给和ph缓冲作用，但避免过高碳酸氢盐浓度带来的负面影响。提供优化浓度的钙镁离子，以防止细胞培养过程中发生碳酸钙和碳酸镁沉淀。另外，针对碳酸氢盐培养过程专门优化微量元素的浓度，而不是照搬二氧化碳培养过程，因为在利用不同碳源时，细胞生长需求是不一样的。利用此技术，可以降低微藻培养成本，更高效培养杜氏藻和生产胡萝卜素。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明公开了一种利用碳酸氢钠作为碳源的杜氏藻培养基，其可以利用碳酸氢钠作为唯一碳源，利用碳酸氢钠提供碳源实现杜氏藻培养。其中碳酸氢钠的浓度为25-500mmol/l，进一步优选的碳酸氢钠的浓度100-300mmol/l，再优选碳酸氢钠的浓度为100-200mmol/l，最优选碳酸氢钠的浓度为200mmol/l。本发明利用碳酸氢钠作为碳源的同时，同时利用碳酸氢钠提高培养系统中的ph缓冲能力，使得培养系统中的值保持在合理范围内，以提高杜氏藻的生长速率：
对于上文所述的技术方案中，利用碳酸氢钠作为碳源的杜氏藻培养基，优选的情况下，所述培养基钙离子浓度为0.1-3.0mmol/l；镁离子浓度为0.05-5.0mmol/l。
对于上文所述的技术方案中，利用碳酸氢钠作为碳源的杜氏藻培养基，优选的情况下，其中钙离子的浓度为0.1-1.8mmol/l，镁离子浓度为0.1-3.0mmol/l；最优选钙离子浓度为0.3mmol/l，最优选镁离子浓度为0.6mmol/l。
对于上文所述的技术方案，利用碳酸氢钠作为碳源的杜氏藻培养基，优选的情况下，所述培养基成分和浓度分别为：nacl0.5-3.0mol/l,nahco3100-300mmol/l，kno310-100mmol/l，k2hpo40.13-0.26mmol/l。进一步优选的浓度分别为：nacl1.5-2.0mol/l,nahco3100-200mmol/l，kno350-80mmol/l，k2hpo40.15-0.20mmol/l
对于上文所述的技术方案中，利用碳酸氢钠作为碳源的杜氏藻培养基，优选的情况下，还包括显著性影响杜氏藻生长的微量元素，其浓度为：fe2+2.7-4.9mg/l,co2+0.19-0.38mg/l,navo30.09-0.18mg/l。进一步优选的浓度分别为：fe2+2.7-3.5mg/l,co2+0.19-0.30mg/l,navo30.12-0.15mg/l。
对于上文所述的技术方案中，利用碳酸氢钠作为碳源的杜氏藻培养基，优选的情况下，还包括下述微量元素，其浓度分别为：na2edta0.02mmol/l，h3bo35.72-11.44mg/l，znso4·7h2o0.14-0.28mg/l，cuso4·5h2o0.13-0.25mg/l，mncl2·4h2o0.99-1.98mg/l，namoo4·2h2o0.24-0.48mg/l。进一步优选的浓度分别为：na2edta0.02mmol/l，h3bo38.58-11.44mg/l，znso4·7h2o0.14-0.21mg/l，cuso4·5h2o0.13-0.20mg/l，mncl2·4h2o1.49-1.98mg/l，namoo4·2h2o0.24-0.48mg/l
本发明的另一方面在于公开了利用上文所述的培养基，在杜氏藻培养以及生产β-胡萝卜素方面的应用。本发明提供的是微藻培养方法、利用碳酸氢钠作为碳源进行生物量积累和β-胡萝卜素积累的培养方法。
本发明上文所述的培养基广泛适用于任何一种杜氏藻。本发明实施例中，具体选用的杜氏藻(dunaliellasalina)，这种微藻对于高浓度的钠盐具有良好的耐受性。
本发明上文所述的应用，还包括利用上文所述的人工海水培养基培养杜氏藻的步骤，其培养的条件为25-28℃，光照强度为3000～12000lux，光照时间为12h/天，平板反应器摇床晃动培养，摇床转速50rpm。
依据本发明实施例的数据证实，在碳酸氢钠为200mmol/l,钙离子为0.3mmol/l,镁离子浓度为0.6mmol/l、fe2+浓度为2.7mg/l,co2+浓度为0.38mg/l,navo3浓度为0.18mg/l的最佳培养条件下培养盐生杜氏藻，可以获得生物量达到0.71g/l，还可以积累含量高达4.52％的β-胡萝卜素，这证明了可以有效地利用碳酸氢钠为碳源培养杜氏藻生产β-胡萝卜素。
有益效果：
1、本培养方法采用200mmol/l的碳酸氢钠作为碳源，被证明是杜氏藻可以耐受的范围，这个范围不仅可以提供充足碳源，还可以起到很好的ph缓冲作用，ph不会上升至过高范围，避免了ph过高引起的微藻细胞死亡。
2、本发明提供了优化的钙镁离子浓度，避免了以碳酸氢盐为碳源时由于ph上升引起的碳酸钙和碳酸镁沉淀。
3、利用本发明中碳酸氢盐体系作为杜氏藻碳源的同时，体系中其他营养成分也会发生相应的改变，所以对培养体系中的微量元素也进行了优化，找到了碳酸氢盐体系中的最适微量元素浓度。
4、本发明提供的杜氏藻培养方法，利用碳酸氢盐作为碳源，一方面提供杜氏藻生长所需要的碳源，同时避免鼓泡式提供碳源方式所带来的通气系统复杂而导致的反应器制作困难和高成本，也能避免通气的高能耗问题。
附图说明
图1不同碳酸氢钠浓度下盐生杜氏藻的ph变化曲线；
图2不同碳酸氢钠浓度下盐生杜氏藻的细胞数变化曲线；
图3不同碳酸氢钠浓度下盐生杜氏藻干重和β-胡萝卜素含量变化曲线；
图4不同钙镁离子浓度下盐生杜氏藻细胞数变化曲线；
图5不同钙镁离子浓度下盐生杜氏藻干重和β-胡萝卜素含量变化曲胡萝卜素线；
图6不同微量元素对盐生杜氏藻干重和胡萝卜素含量影响的响应面分析；其中，图6a为微量元素对盐生杜氏藻干重影响的响应面分析图；图6b为微量元素对盐生杜氏藻胡萝卜素影响的响应面分析图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步进行说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
下述实施例1～6中所使用的检测方法如下：
将处于对数生长的盐生杜氏藻藻种(dunaliellasalina)以4000-8000r/min离心5-10min，弃原培养液，置于配制好的培养基中，封口后置入智能光照培养箱中进行培养，测定盐生杜氏藻细胞培养液的ph,细胞密度，干重及β-胡萝卜素的含量。
测定盐生杜氏藻细胞的密度方法为自培养日开始每天做一次细胞计数。所述的细胞计数的具体方法：取盐藻藻液10-20μl，加1-2μl碘化钾固定，滴入血球计数板上，在显微镜下镜检计数。
所述的藻细胞干重的测量方法为：准确量取藻液40ml，10000rpm离心10分钟收集藻细胞，量取10g/l的氯化钠水溶液40ml清洗收集的藻细胞，重复三次。最后收集的藻细胞加入5ml的氯化钠水溶液中，于105℃下烘干至质量恒定，用精密分析天平称量藻细胞质量，并计算微藻的干重。
所述的测定β-胡萝卜素的含量是从盐生杜氏藻培养第1-7d时取样测定。所述的β-胡萝卜素含量测定方法为：用1ml丙酮提取10mg干生物质，涡旋振荡20s，超声破碎5min，然后以10000rpm离心10min。提取重复两次直至无色。然后用丙酮定容至5ml。提取物通过0.45μm孔径(ptfe)膜注射器过滤器(1.7cm2)过滤。所有提取物均使用带有防光的螺帽的琥珀色玻璃瓶进行处理，以避免类胡萝卜素降解。高效液相色谱(hplc，agilent，1100)用于β-胡萝卜素分析。流动相由10％乙腈，90％甲醇组成。流速为1ml/min，检测波长为452nm。另外，β-胡萝卜素的标准是从sigma购买的。
所述的丙酮溶液浓度为90-100％，丙酮溶液的加入量为5ml。
实施例1盐生杜氏藻的培养及添加不同浓度nahco3对盐生杜氏藻ph的影响
配置添加不同浓度nahco3的人工海水培养基，其浓度分别设置为25、50、100、200、300、500mmol/l，将盐生杜氏藻按照20*104cell/ml的密度接种于人工海水培养基中，于25℃，光照强度为10000lux，光源为led光源，光照时间为12h/天的条件下对盐生杜氏藻进行培养，以检测不同浓度nahco3对盐生杜氏藻生长ph的影响。
每天检测培养基ph的变化,如图1所示，经结果分析，nahco3添加浓度为500mmol/l时，盐藻培养基中的ph在第7d最低，为9.7；nahco3添加浓度为25mmol/l条件下，盐藻培养基中的ph在第7d最高，可达10.3。通过实验我们发现，nahco3浓度越高，对ph的缓冲效果越好，在本次实验中，500mmol/l的nahco3浓度对ph的缓冲效果最好，培养7d后ph值没有超过10。
实施例2添加不同浓度nahco3对盐生杜氏藻细胞生物量和β-胡萝卜素积累的影响
配置添加不同浓度nahco3的人工海水培养基，其浓度分别设置为25、50、100、200、300、500mmol/l，将盐生杜氏藻按照20*104cell/ml的密度接种于人工海水培养基中，于25℃，光照强度为10000lux，光源为led光源，光照时间为12h/天的条件下对盐生杜氏藻进行培养，以检测不同浓度nahco3对盐生杜氏藻生物量积累的影响。
每天检测藻细胞数量和干重的变化,如图2所示，经结果分析，nahco3添加浓度为200mmol/l时，盐藻细胞第7d细胞数最高，为150万cell/ml；如图3所示，nahco3添加浓度为100mmol/l条件下，培养7天后细胞干重最高，为0.65g/l,nahco3添加浓度为200mmol/l条件下，培养7天后细胞干重为0.62g/l,结果说明nahco3添加浓度为200mmol/l和100mmol/l条件下，对盐生杜氏藻细胞生物量积累没有显著性差异。
每天取样检测盐生杜氏藻细胞中β-胡萝卜素的变化,如图3所示，经结果分析，nahco3添加浓度为200mmol/l时，盐藻培养基中的β-胡萝卜素在第7d最高，为4.2％；nahco3添加浓度为25mmol/l条件下，盐藻培养基中的β-胡萝卜素在第7d最低，结果说明在盐生杜氏藻培养基中添加nahco3，可以提高藻细胞中β-胡萝卜素的积累。
实施例3添加不同浓度ca2+，mg2+对盐生杜氏藻生物量和β-胡萝卜素积累的影响
配置添加不同浓度ca2+，mg2+的人工海水培养基，将盐生杜氏藻按照20万cell/ml的密度接种于人工海水培养基中，于25℃，光照强度为10000lux，光源为led光源，光照时间为12h/天的条件下对盐生杜氏藻进行培养，以检测不同浓度ca2+，mg2+对盐生杜氏藻生物量β-胡萝卜素积累的影响。
每天检测藻细胞数量和干重的变化,如图4,5所示，经结果分析，ca2+，mg2+添加浓度越高，藻细胞细胞数越高，细胞干重最高，但是差别不显著，结果说明ca2+添加浓度为3.0mmol/l时，mg2+添加浓度为5.0mmol/l时，盐生杜氏藻积累生物量最高。但是通过实验结果我们发现，当ca2+浓度高于1.2mmol/l，mg2+添加浓度高于3.0mmol/l时，在培养过程中，培养基中会产生絮状沉淀。
每天取样检测藻细胞β-胡萝卜素的变化,如图5所示，经结果分析，ca2+，mg2+添加浓度越高，藻细胞β-胡萝卜素越低，细胞干重越高，但是差别不显著，结果说明ca2+添加浓度为0.3mmol/l时，mg2+添加浓度为0.6mmol/l时，盐生杜氏藻积累β-胡萝卜素含量最高。
通过对不同浓度下ca2+，mg2+对盐生杜氏藻生物量和β-胡萝卜素影响的探究，结果表明，最适的ca2+添加浓度为0.3mmol/l时，mg2+添加浓度为0.6mmol/l，在此浓度条件下，培养基中不会产生沉淀，同时，在不影响生物量的情况下，还可以积累高含量的β-胡萝卜素，在实际生产中，不仅节约了生产成本，而且有利于β-胡萝卜素的积累。
实施例4微量元素(铁、钴、偏凡酸钠)对盐生杜氏藻生物量和β-胡萝卜素积累的影响
通过中心合成实验(centralcompositedesign)对铁、钴、偏凡酸钠设置不同的浓度，配置添加不同浓度铁、钴、偏凡酸钠的人工海水培养基，将盐生杜氏藻按照20万cell/ml的密度接种于人工海水培养基中，于25℃，光照强度为10000lux，光源为led光源，光照时间为12h/天的条件下对盐生杜氏藻进行培养，以检测不同浓度铁、钴、偏凡酸钠对盐生杜氏藻生物量和β-胡萝卜素积累的影响。
每天取样检测藻细胞干重和β-胡萝卜素的变化,如图6所示，经结果分析，fe2+和co2+是盐生杜氏藻细胞干重和β-胡萝卜素积累过程中的显著性影响因子(p＜0.1)，fe2+对藻细胞干重积累呈负相关关系，fe2+越低，细胞干重越低，藻细胞β-胡萝卜素越低；co2+与藻细胞干重呈负相关关系，但是与藻细胞中的β-胡萝卜素积累呈正相关关系。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。