本发明涉及适用于评价卷烟烟气冷凝物遗传毒性的tk基因突变测试方法、致突变强度确定方法，属于卷烟危害评价技术领域。
背景技术：
卷烟烟气含有近5315种化合物，目前已确定有158种对人或实验动物有毒性作用，如何评价卷烟烟气的危害一直是国内外相关研究人员的攻克方向。2004年，国际烟草科学研究合作中心(cooperationcenterforscientificresearchrelationtotobacco，coresta)烟草烟气体外毒性测试工作组推荐了三项体外毒性试验来评价卷烟烟气的危害，分别是细胞毒性试验、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(ames试验)和体外微核试验。
随着卷烟烟气危害性研究的深入，以及食品、食品添加剂、食品接触材料等安全性评价的发展，coresta烟草烟气体外毒性测试工作组多次提出了扩展原有三项体外毒性试验的计划。目前，国内外食品、食品添加剂、食品接触材料用物质均将l5178ytk+/-3.7.2c小鼠淋巴瘤细胞(以下简称l5178y细胞)的胸苷激酶位点(tk)突变检测试验(mouselymphomaassay，mla)作为推荐或法定的遗传毒性试验之一，如《硫芥诱导l5178y细胞tk基因突变的研究，李奇慧，第三军医大，200408》中采用了l5178y细胞tk基因突变来检测硫芥的致突变作用，其中也计算了pe0、pe2、rsg、rtg等值，最终得出结论，硫芥能诱发小鼠淋巴瘤l5178y3.7.2c-tk+/-细胞tk基因突变，有明确的致突变性；《马兜铃酸诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究，徐斌，上海交通大学，200704》中也公开了该种方法可用于中药中成分的检测。同时，人用药品注册技术国际协调会议认为mla比ames试验或体外微核试验能检测更为广泛的遗传物质变异，同时，coresta也将mla做为扩展的首选试验。
虽然国内有食品、食品添加剂、食品接触材料用物质相关的mla方法，但卷烟烟气与食品、食品添加剂、食品接触材料用物质差别较大，无法直接拿来使用，如烟气易陈化、表现毒性的剂量范围较窄，因此建立适用于卷烟烟气的mla尤为迫切。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种适用于评价卷烟烟气冷凝物致突变作用的体外遗传毒性测试方法，可以检测烟气冷凝物的致突变作用。
本发明还提供了一种卷烟烟气冷凝物的致突变强度确定方法，该方法能够对卷烟烟气的致突变作用进行定量评价。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种适用于评价卷烟烟气冷凝物致突变作用的体外遗传毒性测试方法，包括如下步骤：收集卷烟烟气冷凝物，制备得到系列浓度的卷烟烟气冷凝物溶液；采用加入所述卷烟烟气冷凝物溶液的细胞培养基染毒处理受试细胞，然后计算卷烟烟气冷凝物的抗性突变频率tmf，根据tmf值判断卷烟烟气冷凝物是否有tk基因的致突变作用。
本发明的适用于评价卷烟烟气冷凝物致突变作用的体外遗传毒性测试方法，将卷烟烟气制备成卷烟烟气冷凝物溶液，能够较为方便的加入到细胞培养基中，直接地与受试细胞进行作用，能够准确的体现卷烟烟气冷凝物的致突变作用。克服了现有技术中卷烟毒性检测过程中遗传毒性终点少、烟气易陈化、表现毒性的剂量范围较窄的问题。
在评价卷烟烟气毒性时，将卷烟烟气制备成卷烟烟气冷凝物溶液，以方便对于细胞的处理，吸烟机抽吸温湿度平衡后的卷烟，收集滤片，用二甲基亚砜萃取得到卷烟烟气冷凝物溶液。具体的包括：吸烟机抽吸温湿度平衡后卷烟，收集滤片，用二甲基亚砜(dmso)萃取csc。根据细胞毒性的相对存活率来确定试验剂量，一般是在相对存活率为溶剂对照组的20％～80％范围内，用细胞培养基稀释csc，设置3～6个非0剂量水平。
所述卷烟烟气冷凝物溶液中烟气冷凝物的浓度分别为20、40、80、100、150μg/ml。与药品、食品等相比，卷烟烟气表现出毒性的剂量范围较窄，因此设置5个非0剂量。
所述细胞培养基中卷烟烟气冷凝物溶液的体积为0.5-1.5％，该加入量不会影响细胞正常生长。所述染毒处理的时间为2.5-3.5h。
优选的，所述受试细胞为小鼠淋巴瘤l5178y细胞。所述l5178y细胞为清除tk-/-基因型自发突变的细胞。本发明采用thmg对自发突变的tk-/-基因型细胞进行清除，以避免细胞的自发突变对于实验结果的影响。更为具体的方法为：用含3g/ml胸苷，5g/ml次黄嘌呤，0.1g/ml氨甲碟呤和7.5g/ml甘氨酸的thmg培养基处理细胞20-28小时，离心、洗涤后在不含氨甲碟呤的thg培养基中培养2.5-3.5天。
所述染毒处理时另外加入终浓度为1-1.5％的s9。卷烟烟气的有害成分中有很多间接致突变物，在进行遗传毒性评价时，需加入代谢活化系统s9，更为优选的，s9的终浓度为1.25％。
在所述染毒处理时另外设置阳性对照组和溶剂对照组，所述阳性对照组加入环磷酰胺，所述溶剂对照组加入dmso。
作为溶剂对照的dmso溶液中dmso的终浓度为15μg/ml。作为阳性对照的环磷酰胺溶液中环磷酰胺的终浓度为3μg/ml。可以根据tmf值与溶剂对照组的差异和剂量-反应关系来判断csc是否有致突变作用。
所述致突变作用的判断为：烟气冷凝物一个以上剂量组的tmf显著高于dmso溶剂对照组，或是溶剂对照组的3倍以上，并有剂量反应关系则为致突变阳性；卷烟烟气冷凝物各剂量组未见突变频率增加则为致突变阴性。可疑结果的判定：(1)虽有一个以上的受试物浓度组的tmf与溶剂对照比较有显著差异，但无剂量反应关系；(2)仅在相对存活率达20％左右的高剂量情况下出现阳性。
一种卷烟烟气冷凝物的致突变强度确定方法，包括如下步骤：收集卷烟烟气冷凝物，制备得到系列浓度的卷烟烟气冷凝物溶液；采用加入所述卷烟烟气冷凝物溶液的细胞培养基染毒处理受试细胞，然后计算卷烟烟气冷凝物的抗性突变频率tmf，选出致突变阳性的卷烟烟气冷凝物，将所述致突变阳性的卷烟烟气冷凝物的剂量与tmf值进行线性拟合，所得直线的斜率即为致突变强度。
在有致突变阳性作用时，将卷烟烟气各剂量的tmf绘制剂量–反应关系曲线，直线部分的斜率即为致突变强度。直线部分的选择依据spss17.0统计分析，首先对剂量–反应关系曲线进行一元二次(一元二次方程为
所述卷烟烟气冷凝物溶液的制备包括：吸烟机抽吸温湿度平衡后卷烟，收集滤片，用二甲基亚砜萃取得到卷烟烟气冷凝物溶液。
在所述染毒处理时另外设置阳性对照组和溶剂对照组，所述阳性对照组加入环磷酰胺，所述溶剂对照组加入二甲基亚砜。
所述致突变阳性的判断为：卷烟烟气冷凝物一个以上剂量组的tmf显著高于二甲基亚砜溶剂组，或是溶剂对照组的3倍以上，并有剂量反应关系则为致突变阳性。卷烟烟气冷凝物各剂量组未见突变频率增加则为致突变阴性。
本发明中卷烟烟气冷凝物的致突变强度确定方法中的抗性突变频率tmf的获得方法同上述的卷烟烟气冷凝物的致突变强度确定方法。
所述受试细胞为l5178y细胞。所述染毒处理时另外加入终浓度为1-1.5％的s9。
本发明的卷烟烟气冷凝物的致突变强度确定方法，采用卷烟烟气冷凝物直接对受试细胞进行处理，卷烟烟气的tk基因的致突变能力采用致突变强度(诱变强度)mp(mutagenicpotency，mp)表示，mp为剂量-反应关系曲线线性拟合的斜率，可采用单位卷烟烟气冷凝物的抗性突变频率。具体的，在步骤5)中对不同剂量的卷烟烟气冷凝物的tmf进行线性拟合，所得直线的斜率即为诱变强度。在进行不同卷烟致突变能力比较时，可直接比较mp大小，可简单方便的对不同种类卷烟的tk基因致突变遗传毒性进行横向的比较。本发明采用mp来定量表达卷烟烟气的tk基因致突变能力，可通过比较不同卷烟的mp来比较其致突变能力。
本发明的卷烟烟气冷凝物的致突变强度确定方法，采用微孔板法检测卷烟烟气冷凝物对l5178y细胞tk基因致突变作用，可简单快捷的判断卷烟烟气的毒性作用，能够适用于市场上的卷烟，并可以对卷烟烟气的遗传毒性进行定量的判断，能够实现不同种类卷烟毒性之间的横向比较，应用范围广。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
以下实施例中涉及的试剂除了明确指出的外，均为市售的商品。
实施例1
本实施例对某卷烟1#进行l5178y细胞的tk基因致突变试验。
适用于评价卷烟烟气冷凝物(csc)致突变作用的体外遗传毒性测试方法，具体的包括如下步骤：
1、细胞培养条件
采用的l5178y细胞为悬浮生长细胞，采用含10％马血清和适量抗菌素的rpmi1640培养基(96孔板培养时采用含20％马血清的培养基)，5％co2、37℃、饱和湿度条件下常规悬浮培养。
在正式实验前，清除自发突变的tk-/-基因型细胞。方法是采用含3g/ml胸苷，5g/ml次黄嘌呤，0.1g/ml氨甲碟呤和7.5g/ml甘氨酸的thmg培养基处理细胞24小时，离心、洗涤后在不含氨甲碟呤的thg培养基中培养3天。
2、卷烟烟气冷凝物制备和剂量设置
采用iso4387抽吸方法(抽吸容量35ml，每口抽吸2s，每30s抽吸一口)于转盘吸烟机抽吸参比卷烟20支，抽吸结束后，用dmso以10mg/ml萃取滤片上的csc，-80℃保存待用。
吸烟机抽吸温湿度平衡后卷烟，收集滤片，用二甲基亚砜(dmso)萃取csc。根据细胞毒性的相对存活率来确定试验剂量，一般是在相对存活率为溶剂对照组的20％～80％范围内，用细胞培养基稀释csc，设置3-6个非0剂量水平。
本实施例中设置5个csc受试物的剂量，分别为20、40、80、100、150μg/ml。按受试物处理和表达培养进行具体的突变试验。
3、代谢活化系统s9浓度
卷烟烟气的有害成分中有很多间接致突变物，在进行遗传毒性评价时，需加入代谢活化系统s9，试验确定了s9的终浓度为1.25％。
4、对照设置
设置终浓度15μg/ml的dmso为溶剂对照组，终浓度为3μg/ml的环磷酰胺(cp)为阳性对照组。
5、受试物处理
取生长良好的l5178y细胞，调整细胞密度为5×105/ml，按1％体积加入受试物csc(阳性对照组加入环磷酰胺，阴性对照组加入dmso)，37℃震摇处理3小时。800～1000转/分钟，离心4～6分钟后，弃上清液，用不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重悬细胞于含10％马血清的培养基中。
6、表达培养
6.1第0天平板接种效率(pe0)的测定：
按8个细胞/ml，接种96孔板(每孔加0.2ml，即平均1.6个细胞/孔)，每个剂量作1～2块板，37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养12天，计数每块平板有集落生长的孔数，计算pe0。
式中ew为无集落生长的孔数，tw为总孔数，1.6为每孔接种细胞数。
6.2表达培养2天平板接种效率(pe2)的测定：
将细胞悬液调整细胞密度为2×105/ml，作48小时表达培养(每天计数细胞密度并保持密度在106/ml以下)，计算相对悬浮生长(rsg)和相对总生长(rtg)。
rtg＝rsg×rs2×100％，式中rs2为第2天的相对存活率。
然后按照6.1方法接种96孔板，培养12天后，计算pe2。
式中ew为无集落生长的孔数，tw为总孔数，1.6为每孔接种细胞数。
6.3tft抗性突变频率(tmf)测定：
48小时表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×104/ml，加入终浓度为3g/ml的三氟胸苷(tft)，混匀，按6.1方法接种96孔板(每孔加0.2ml)，每个剂量作2块板培养12天后，计数有突变集落生长的孔数。
突变集落按大集落(lc：直径≥1/4孔径，密度低)和小集落(sc：直径＜1/4孔径，密度高)分别计数，极小集落可再继续培养3天后计数。
式中ew为无集落生长的孔数，tw为总孔数，n为每孔接种细胞数(2000)，pe2为表达培养2天的平板效率。
7、结果判定
该种卷烟的检测数值如表1所示，从表中可以看出阳性对照cp的tmf显著高于溶剂对照组(p<0.01)，csc处理组150μg/ml的tmf高于溶剂对照组3倍(即显著高于溶剂对照组(p<0.05))，并且随着csc剂量的增加，tmf呈上升趋势，呈现剂量反应关系，表明卷烟烟气对l5158y的tk基因有致突变作用。
表1卷烟1#的tk致突变频率测定结果
本实施例中卷烟烟气冷凝物致突变强度确定方法，染毒时各孔的csc溶液为0.2ml，各剂量所含csc总量分别为0、4、8、16、20和30μg。
对剂量–反应关系曲线进行一元二次(一元二次方程为
实施例2
本实施例中的适用于评价卷烟烟气冷凝物致突变作用的体外遗传毒性测试方法及致突变强度确定方法同实施例1。所采用的受试卷烟为另一卷烟2#。
结果如表2所示：csc处理组80μg/ml的tmf高于溶剂对照组3倍，并且随着csc剂量的增加，tmf呈上升趋势，呈现剂量反应关系，表明该卷烟烟气对l5158y的tk基因有致突变作用。
表2卷烟2#的tk致突变频率测定结果
接种96孔板时每孔加0.2ml受试物，对剂量–反应关系曲线进行一元二次(一元二次方程为
试验例
比较卷烟1#和卷烟2#的致突变强度，发现卷烟2#的致突变作用更强，遗传毒性更强。采用本发明的卷烟烟气冷凝物致突变强度确定方法，能够对卷烟的tk基因致突变性进行定量的分析，并能较为方便的比较各个卷烟之间的tk基因致突变强度。