一种通过利用合成双链DNA来诱导调节性T细胞的方法与流程

文档序号:15457440发布日期:2018-09-15 01:29

本发明属于生物医学技术领域,具体涉及一种通过利用合成双链DNA来诱导调节性T细胞的方法。



背景技术:

调节性T细胞(Regulatory cell,Treg)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群,可分为天然产生的自然调节性T细胞(nTreg)和诱导产生的适应性调节性T细胞(iTreg),是机体维持自身耐受的重要组成部分,由胸腺或由外周活化的细胞发展而来。其中,转录因子Foxp3是Treg的特征性标记,Foxp3作为一个转录调控因子,通过直接调控多种基因来调节Treg的活性,在Treg细胞发育过程和功能起着关键的作用。

Treg与自身免疫疾病和器官移植的免疫排斥反应等有密切的关系,研究已经证实了Treg可用于上述免疫相关疾病的治疗,通过体外扩增Treg再回输到患者体内可以改善疾病的进展。然而体内存在的Treg数量很少,仅占正常人外周血CD4+T细胞中的5%~10%。因此,建立一种体外大量诱导产生Treg的方法,从而获得足够数量的Treg用于免疫相关疾病的治疗,具有非常重大的临床意义。



技术实现要素:

基于此,本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种双链DNA,其在体外没有免疫原性、不会损伤白细胞,可以诱导调节性T细胞,具有免疫抑制功能。

为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种双链DNA,其中一条链的碱基序列为:5’-ctcgaggg-3’,且第二个C碱基为甲基化的。

优选地,所述双链DNA可组成分子量为10~50000MW的生物性双链DNA寡聚体,所述生物性双链DNA寡聚体命名为Metvax。

所述双链DNA在体外没有免疫原性、不会损伤白细胞;且在体外可以抑制抗原、丝裂霉素和自身抗原诱导的T细胞增生,并且这个抑制作用成剂量依赖性。

本发明的另一目的,在于提供所述双链DNA在诱导调节性T细胞中的应用。

本发明的又一目的,在于提供一种诱导调节性T细胞的方法。

本发明所述调节性T细胞是指具有CD4+FoxP3+免疫表型的调节性T细胞。

为实现上述目的,本发明采用的技术方案为,一种诱导调节性T细胞的方法,包括以下步骤:

(1)获得人初始CD4+T细胞;

(2)将步骤(1)获得的人初始CD4+T细胞与人抗CD3/CD28抗体、TGF-β、IL-2和所述的双链DNA进行共培养;

(3)步骤(2)中培养体系培养3天后,更新含所述双链DNA的培养液;

(4)步骤(3)中的培养体系继续培养至少5天,即获得诱导产生的调节性T细胞。

优选地,所述步骤(1)中利用磁珠分选或流式细胞术分选的方法从人外周血中获得人初始CD4+T细胞。

优选地,所述步骤(2)中双链DNA在培养体系中的浓度为1-100ug/mL。

本申请发明人发现,在IL-2与TGF-β的存在下,可以加强双链DNA对调节性T细胞的诱导作用。

根据本发明提供的诱导调节性T细胞的方法制备得到的调节性T细胞可用于制备治疗非感染性炎症、感染后炎症性疾病、呼吸道过敏性疾病、胃肠道过敏性疾病、皮肤过敏性疾病、自身免疫疾病、移植物抗宿主反应或移植排斥反应的药物。

根据本发明提供的诱导调节性T细胞的方法制备得到的调节性T细胞可回输入缘由调节性T细胞数目减少或者功能缺失而致病的患者体内来纠正患者体内的调节性T细胞数目及功能的失衡。

本发明的又一目的,在于提供所述双链DNA在制备治疗非感染性炎症、感染后炎症性疾病、呼吸道过敏性疾病、胃肠道过敏性疾病、皮肤过敏性疾病、自身免疫疾病、移植物抗宿主反应或移植排斥反应的药物中的用途。

优选的,所述药物中还可以包含维甲酸、雷帕霉素或丁酸钠脂肪酸。

优选地,所述疾病包括系统性红斑狼疮、皮肌炎、类风湿性关节炎、脉管炎、多发性硬化症、帕金森疾病、阿尔茨海默病、创伤导致的痴呆、淀粉样变性及CAIDs-童年、海湾战争疾病,硅或疫苗引起的疾病、ICIS和IRAES等。

优选的,所述双链DNA可以通过呼吸道吸入,口服,或者经血管、肌肉注射等途径使用,且在体外表现为无抗原性。

优选的,所述双链DNA的免疫抑制功能可以通过抗-IL-6抗体、溴麦角隐亭、维生素D及其他激素来改善。

本发明的又一目的,在于提供一种药物,所述药物含有所述双链DNA和药物学可接受的载体。

相对于现有技术,本发明的有益效果为:本发明提供的双链DNA在体外没有免疫原性、不会损伤白细胞,可以诱导调节性T细胞,从而发挥免疫抑制功能,可有效用于非感染性炎症及感染后炎症性疾病,呼吸道、胃肠道及皮肤的过敏性疾病和自身免疫疾病等免疫相关疾病的治疗。

附图说明

图1为本发明双链DNA的序列图。

图2为本发明双链DNA与对照物诱导调节性T细胞的结果对比图,其中Foxp3+/CD4+代表同时表达FoxP3和CD4的细胞,DNA-1代表本发明双链DNA,DNA-4代表对照组双链DNA。

图3为使用不同浓度本发明双链DNA诱导调节性T细胞的结果图,其中Foxp3+/CD4+代表同时表达FoxP3和CD4的细胞。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明所述双链DNA序列如图1所示,碱基与相邻碱基是由磷酸二酯键连接,碱基对由氢键相连,且第二个C碱基为甲基化的。

实施例2

为了研究本发明双链DNA对CD4+FoxP3+T调节性T细胞的诱导效率,本实施例对本发明双链DNA与对照双链DNA诱导产生CD4+FoxP3+调节性T细胞的效果进了比较,所述对照双链DNA与本发明双链DNA的区别在于其第二个C碱基没有发生甲基化。

(一)实验设计

为了研究本发明所述双链DNA可以诱导调节性T细胞的效果,设置实验组和对照组,具体如表1所示:

表1实验设计

(二)实验方法

一种诱导调节性T细胞的方法,包括以下步骤:

(1)取正常人外周血,分离单个核细胞后,利用磁珠分选(MASC)技术或流式细胞术分选获得人初始CD4+T细胞;

(2)将步骤(1)获得的人初始CD4+T细胞与人抗CD3/CD28抗体、TGF-β和IL-2共培养,实验组和对照组在培养初始阶段即分别加入表1中的诱导物;

(3)步骤(2)中培养体系培养3天后,更换培养液(培养液分别含相同浓度的实验组和对照组诱导物);

(4)步骤(3)中的培养体系继续培养至第5天,收集细胞,利用流式细胞术检测培养体系中的调节性T细胞比例。

(三)实验结果

实验结果如图2所示,由图2可知,换液后继续培养至第五天,实验组培养体系中(含本发明双链DNA)的CD4+Foxp3+调节性T细胞的比例明显高于对照组(含对照组双链DNA),差异具有统计学意义。说明本发明提供的第二个C碱基为甲基化的双链DNA诱导产生CD4+Foxp3+调节性T细胞的效果更好。

实施例3一种诱导调节性T细胞的方法

本发明提供的一种诱导调节性T细胞的方法,包括以下步骤:

(1)取正常人外周血,分离单个核细胞后,利用磁珠分选(MASC)技术或流式细胞术分选获得人初始CD4+T细胞;

(2)将步骤(1)获得的人初始CD4+T细胞与人抗CD3/CD28抗体、TGF-β和IL-2共培养,在培养初始阶段即加入本发明所述双链DNA,使其在培养体系中的浓度分别为0ug/mL、10ug/mL、50ug/mL和100ug/mL;

(3)步骤(2)中培养体系培养3天后,更换含相同浓度的所述双链DNA的培养液;

(4)步骤(3)中的培养体系继续培养至第5天,即获得诱导产生的调节性T细胞。

本发明方法诱导调节性T细胞的结果如图3所示,由图3可知,本发明提供的双链DNA使用量为1~100ug/mL时均可成功诱导调节性T细胞,并且这种诱导作用存在剂量依赖性。当双链DNA使用量为100ug/mL时,利用发明诱导方法可获得高达55%的CD4+FoxP3+调节性T细胞。

本发明申请人利用上述诱导方法对系统性红斑狼疮患者外周血中的初始CD4+T细胞进行诱导,同样可以成功诱导CD4+FoxP3+调节性T细胞的形成,结果与正常人外周血中的初始CD4+T细胞的诱导结果相似,具体数据省略。

最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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