一种寨卡病毒一步法荧光rt-PCR检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物检测领域，特别涉及一种寨卡病毒一步法荧光rt-pcr检测方法及试剂盒。

背景技术：

寨卡病毒(zikv)是蚊子传播的黄病毒，其首先于1947年在乌干达从发热的恒河猴中分离，并且与其他全球相关的节肢动物传播的人类病原体相关，包括登革热(denv)，黄热病(yfv)，西尼罗河(wnv)，日本脑炎(jev)和蜱传脑炎病毒。在过去十年中，zikv感染曾在密克罗尼西亚，法属波利尼西亚、南美洲和中美洲引起大流行病。在大多数情况下，zikv感染导致与皮疹和结膜炎相关的自限性发热性疾病，但也可能导致严重的神经系统疾病包括格林-巴利综合征和脑膜脑炎。尤其孕妇感染值得关注，因为它与严重的胎儿畸形异常有关，包括小头症，自发流产和胎盘功能不全的子宫内生长限制。

该病毒是全长不分节段单股正链ssrna(+)病毒，包含两个侧翼非编码区5’ncr和3’ncr。基因组5’端具有典型的甲基化帽子结构用于细胞翻译，3’末端非多聚腺苷酸化而形成环状结构。病毒颗粒rna具有传染性，同时兼具基因组rna和病毒信使rna功能，通过宿主和病毒蛋白酶共同翻译和翻译后处理为多聚体蛋白。目前针对寨卡病毒的实验室诊断方法有病原学方法、血清学方法和针对病毒核酸的检测技术。

传统的病原学方法主要通过细胞培养进行病毒的分离，耗时耗力，而且寨卡病毒的毒血症持续时间短，较难采集到合适的样品。血清学检测方法，包括elisa，免疫荧光、中和试验等，也被广泛的应用于寨卡病毒的实验室检测。但病毒特异性igm和中和抗体出现较晚，约发病后1周末期才可检出，同时黄病毒间交叉反应常见难以鉴别。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于检测寨卡病毒的遗传标记物。

本发明的第二目的在于提供用于检测寨卡病毒的特异性引物对和探针。

本发明的第三目的在于提供所述的特异性引物对和/或探针的应用。

本发明的第四目的在于提供用于检测寨卡病毒的试剂盒。

本发明的第五目的在于提供基于所述的特异性引物对和/或探针的寨卡病毒一步法荧光rt-pcr检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于检测寨卡病毒的遗传标记物，其核苷酸序列如seqidno.4所示。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测寨卡病毒的遗传标记物。

所述的用于检测寨卡病毒的遗传标记物在制备检测寨卡病毒试剂盒中的应用。

本发明根据该保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。所述的用于检测寨卡病毒的特异性引物对为：

上游引物序列为：5’-ggttctcatcaatggttttgct-3’；(如seqidno.1所示)

下游引物序列为：5’-tggaacaaccatcgctcgta-3’。(如seqidno.2所示)

与所述的特异性引物对配合使用的荧光探针，其序列为5’-tggcctggttggca-3’(如seqidno.3所示)，在所述的序列的5’端标记荧光报告基团，在其3’端标记荧光淬灭基团。

所述的荧光报告基团可为fam、tet、vic、hex、rox、tamra、cy3、cy3.5、cy5和cy5.5中的至少一种；所述的荧光淬灭基团可为mgb和bhq中的至少一种。

所述的特异性引物对和/或探针在制备检测寨卡病毒试剂盒中的应用。

一种检测寨卡病毒试剂盒，含有所述的特异性引物对。

所述的检测寨卡病毒试剂盒，还包含所述的荧光探针。

所述的检测寨卡病毒试剂盒，还可以包括阳性标准品、阴性质控品、rt-pcr反应液，反转录酶，pcr酶、荧光信号校正试剂中的至少一种。

所述的阳性标准品为插入所述的用于检测寨卡病毒的遗传标记物的载体质粒。

所述的阴性质控品可为无菌depc水。

所述的rt-pcr反应液由datp、dutp、dgtp、dctp四种核苷酸、含有镁离子的缓冲液构成。

所述的荧光信号校正试剂，例如roxreferencedyeordyeii(50×)，可用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

一种寨卡病毒一步法荧光rt-pcr检测方法，利用如seqidno.1、seqidno.2所示的特异性引物对和seqidno.3所示的荧光探针进行实时荧光定量pcr，检测待测样本中的寨卡病毒。

所述的实时荧光定量pcr的最佳反应条件为：42℃反转录5min，95℃，预变性10s；95℃变性5s，60℃荧光检测34s，40个循环。

pcr反应体系中，引物的终浓度优选为0.1～1μm，进一步优选为0.2μm；荧光探针的终浓度优选为0.1～0.5μm，进一步优选为0.3μm。

样品扩增曲线ct值＜34为寨卡病毒阳性；样品ct值＞34为寨卡病毒阴性，阳性样品根据标准曲线可以计算出寨卡病拷贝数。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本次发明建立了一种快速准确敏感的荧光定量pcr检测方法，提取病毒rna可在0.5小时内完成，qpcr可在1.5小时内实现，整个检测方法耗时不到2小时，进一步更好地支持我国的寨卡病毒防控工作。

(2)本发明可消除寨卡病毒和其他黄病毒在血清学检测上的交叉反应的影响，具有良好的特异性。

(3)本发明的一步法荧光定量pcr反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。

(4)本发明建立的荧光定量pcr寨卡检测方法具有广谱性，涵盖寨卡病毒亚洲株系和非洲株系两大亚型；亦可用于临床血清等样品的检测，适应性广泛。

(5)本发明所提供的一步法荧光rt-pcr检测方法可以检测出寨卡病毒的最低拷贝数为20copies/ml，具有非常好的灵敏度。

附图说明

图1为实施例1中引物的染料法扩增曲线结果分析图；其中，横坐标cycle表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

图2为实施例1中引物的染料法溶解曲线结果分析图；其中，横坐标temperature表示pcr反应的溶解温度tm值，纵坐标为荧光强度的二阶负导数。

图3为实施例2的质粒标准品扩增曲线结果分析图；图中，s1～s7分别表示浓度为2.0×10⁷copies/ml、2.0×10⁶copies/ml、2.0×10⁵copies/ml、2.0×10⁴copies/ml、2.0×10³copies/ml、2.0×10²copies/ml、2.0×10¹copies/ml的质粒标准品的扩增曲线，横坐标cycle表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

图4为实施例2的质粒标准品的标准曲线结果分析图；其中，横坐标表示质粒拷贝浓度的对数值，纵坐标ct表示荧光阈值。

图5为实施例4检测寨卡病毒亚洲型扩增曲线结果分析图；其中，a为寨卡病毒亚洲型毒株检测样本，b为阳性质控品，横坐标cycle表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

图6为实施例5检测寨卡病毒非洲型扩增曲线结果分析图；其中，a为寨卡病毒非洲型毒株检测样本，b为阳性质控品，横坐标cycle表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

图7为实施例6中检测寨卡病毒患者血清的扩增曲线结果分析图；其中，a为一病人患者检测样本，b为另一患者检测样本，c为阳性质控品。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1寨卡病毒保守序列的选择与特异性引物和探针设计

通过ncbi数据库中获得有全基因组序列的寨卡病毒毒株，去掉同源性近的毒株，选择有地区代表性的寨卡病毒毒株，利用clustalw程序进行比对获得保守序列。选择无二级结构且高度保守的区段(其核苷酸序列如seqidno.4所示)，利用primerexpress设计软件设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，其中探针5’端设计有荧光报告基团fam，3’端基团为mgb。本次实验设计了多对引物、探针，最终筛选最优引物、探针序列组合如下：

上游引物：ggttctcatcaatggttttgct；(seqidno.1)

下游引物：tggaacaaccatcgctcgta；(seqidno.2)

探针：fam-tggcctggttggca-mgb。(seqidno.3)

利用寨卡病毒(ku955589.1，由广州省疾病预防控制中心提供)细胞培养液检测本发明最优引物的特异性。

1.提取病毒rna

根据试剂厂商说明书，采用trizol(购自takara，货号9109)核酸提取法提取寨卡病毒(ku955589.1)细胞培养液中zikv病毒核酸。

取适量含有病毒的组织或培养细胞，加入适量的rnaisoplus后匀浆，室温静置5分钟，12,000g，4℃离心5分钟，上清转移至新的1.5ml离心管中。加入1/5rnaisoplus体积量的氯仿，振荡混匀，4室温静置5分钟，在4℃下12,000g离心15分钟。将上清液转移至新的离心管中，加入0.5～1倍rnaisoplus体积量的异丙醇，室温静置10分钟，12,000g4℃离心10分钟。再用与rnaisoplus等量的75％乙醇清洗沉淀，7,500g℃离心5分钟。弃上清保留沉淀，干燥(不可加热干燥)，溶解于适量的depc处理水中，备用。

2.反转录cdna

将提取的病毒rna，采用随机引物pcr法(购自takara，rr047a)，反转录为cdna.

(1)去除基因组dna反应

按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制mastermix，然后再分装到每个反应管中，最后加入rna样品。

表1去除基因组dna反应体系

备注：^*1:20μl反转录反应体系中，sybrgreenqpcr法最多可使用1μg的病毒rna。

(2)反转录反应

反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配置mastermix，然后再分装10μl到每个反应管中*3。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

表2反转录反应体系

反应条件如下：37℃反转录15min^*3，85℃变性5sec，4℃保存。*4

备注：

*2:反转录体系可以根据需要相应扩大。

*3:pcr反应有非特异性扩增时，将温度升到50℃会有所改善。

*4:合成的cdna需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。

(3)引物特异性检测

将寨卡病毒rna反转录的cdna作为模板，使用了改良后的takaraextaqhs(takara，rr820a)进行pcr扩增，通过检测反应液中sybrgreeni的荧光强度，监控最优引物的特异性。

按下列组份配制pcr反应液(反应液配制请在冰上进行)。考虑到吸取误差，配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的10％。

表3反应体系

*1：引物的终浓度优选为0.1～1μm。(图1和图2为引物终浓度为0.2μm的结果)

*2：在25μl的反应体系中，dna模板的添加量通常在100ng以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的dna模板添加量。

上机检测：选用的荧光定量pcr仪(型号为bio-radcfx96实时荧光定量pcr仪)，反应条件如下：

step1:95℃30秒；

step2:pcr反应goto:39(40个循环)95℃5秒；

60℃30秒

step3:meltcurve

qpcr(sybrgreeni)引物调试结果显示：本发明的引物对扩增曲线良好，可以扩增寨卡病毒片段(见图1)。由图2可知，所述的引物在60℃时溶解曲线单峰(见图2)，表明无非特异扩增。

实施例2寨卡病毒检测标准曲线制作

本实施例利用寨卡病毒原液和合成的含检测靶基因的核酸片段的质粒标准品，对本发明中一步法荧光rt-pcr检测方法的引物和探针的敏感性进行评估。

1.质粒标准品的获得

质粒标准品是通过将合成的寨卡病毒基因目的片段dna(见seqidno.4)t/a克隆法连入载体ptg19-t中而获得，挑取8个克隆，摇菌提质粒测序验证，选取测序结果正确的质粒作为质粒标准品原液。用紫外分光光度法检测质粒浓度，标准品的拷贝数根据如下计算公式确定：(ng/μl)×10^-9×6.02×10²³/(bp×660)＝copies/μl(其中：6.02×10²³为摩尔常数，660为碱基(agct)平均分子量)。然后对标准品稀释，具体为将质粒标准品原液以10倍梯度稀释为2.0×10¹～2.0×10⁷copies/ml，共7个浓度梯度分别检测，各3个重复。

2.利用质粒标准品制作标准曲线

采用一步探针法进行realtimeonesteprt-pcr(takara，rr064a)对探针(seqidno.3)的荧光信号进行监测。

其原理为：探针(seqidno.3)使用5’端带有荧光物质(fam)，3’端带有淬灭物质(mgb)修饰的寡核苷酸进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。当pcr反应液中加入荧光探针后，在pcr反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在pcr反应的延伸过程中，taqdna聚合酶的5→3’核酸外切酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测pcr产物扩增量的目的。

按表4组份配制rt-pcr反应液(反应液配制请在冰上进行)。

表4rt-pcr反应体系

备注：

*1：引物的终浓度优选为0.1～1μm。(图3和图4是引物终浓度为0.2μm的结果)

*2：探针的终浓度优选为0.1～0.5μm。(图3和图4是探针终浓度为0.3μm的结果)

*3用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

*4实际操作中可以根据仪器推荐反应体系进行调整总体系。

反应条件如下：

stage1：reps:1

42℃，5min

95℃，10sec

stage2:reps:40

95℃，5sec

60℃，34sec

结果如图3和图4所示。将质粒标准品10倍连续稀释，共7个浓度梯度，图3为各浓度的质粒标准品扩增曲线。其标准曲线(见图4)由ct值和质粒拷贝浓度进行拟合获得，标准曲线的线性关系为y＝-3.3214x+34，r²＝0.99827，表明本发明在2.0×10⁷～2.0×10¹copies/ml之间具有良好的线性关系，(其中y为ct值即循环阈值，x为质粒标准品拷贝数以10为底数的对数，r为相关系数)。检测限约为20copies/ml。

结果判读：样品扩增曲线ct值＜34为寨卡病毒阳性；样品ct值＞34为寨卡病毒阴性，阳性样品根据标准曲线可以计算出寨卡病拷贝数。

ct值的定为：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

荧光域值定义为：pcr反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

实施例3试剂盒的建立与具体操作

1.试剂盒组成

按照下列组成配制用于检测寨卡病毒的试剂盒：实施例1的上游引物、下游引物、荧光探针、阳性标准品(即实施例2制得的质粒标准品)、阴性质控品rt-pcr反应液，反转录酶，pcr酶。rt-pcr反应液由datp、dutp、dgtp、dctp四种核苷酸、含有镁离子的缓冲液构成。所述的阴性质控品为无菌depc水。

2.检测步骤

(1)pcr反应

以待测样品(病毒rna)为模板，按照表5配制rt-pcr反应体系

表5rt-pcr反应体系

备注：

*1：引物的终浓度优选为0.1～1μm，进一步优选为0.2μm。

*2：探针的终浓度优选为0.1～0.5μm，进一步优选为0.3μm。

*3实际操作中可以根据仪器推荐反应体系进行调整总体系。

rt-pcr反应体系还可以包括荧光信号校正试剂，例如roxreferencedyeordyeii(50×)，可用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

pcr的反应条件为：42℃反转录5min，95℃，预变性10s；95℃变性5s，60℃荧光检测34s，40个循环。

(2)结果判读：样品扩增曲线ct值＜34为寨卡病毒阳性；样品ct值＞34为寨卡病毒阴性，阳性样品根据标准曲线可以计算出寨卡病拷贝数。

实施例4检测寨卡病毒亚洲型及特异性试验

利用寨卡病毒亚洲型(ku955589.1)细胞培养液检测本发明最优引物的特异性。

1.提取病毒rna

根据试剂厂商说明书，采用trizol(takara，9109)核酸提取法提取寨卡病毒(ku955589.1)细胞培养液中zikv病毒核酸。其中阳性质控品粉末简短离心后，溶于0.5ml无菌depc水中。阳性质控品病毒rna的提取方法同上。所述的阳性质控品为登革1型毒株(km204119)、登革2型毒株(kf479233)、登革3型毒株(ay744683)、登革4型毒株(kj596658)，日本乙型脑膜炎病毒株(kf667322)以及甲型流感病毒株(a/fm/1/4/)灭活毒株的混合物(以上病毒由暨南大学病原微生物与免疫学系提供)。

具体步骤参见实施例1的“1.提取病毒rna”。

2.采用实施例3构建的检测方法，即一步探针法进行realtimeonesteprt-pcr(takara，rr064a)对探针(seqidno.3)的荧光信号进行监测。

按表6配制rt-pcr反应液(反应液配制请在冰上进行)。

表6rt-pcr反应体系

备注：

*1引物的终浓度优选为0.1～1μm。(图5是引物终浓度为0.2μm的结果)

*2探针的终浓度优选为0.1～0.5μm。(图5是探针终浓度为0.3μm的结果)

*3用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。

*4实际操作中可以根据仪器推荐反应体系进行调整总体系。

反应条件如下：

stage1：reps:1

42℃，5min

95℃，10sec

stage2:reps:40

95℃，5sec

60℃，34sec

扩增曲线结果如图5所示，a为寨卡病毒亚洲型毒株检测样本，b为阳性质控品。a的ct值均小于34；而阳性质控品的ct值均大于34。由此可见，本发明适用于寨卡病毒亚洲型毒株的检测，且不与黄热病毒属其它病毒产生交叉反应，不与其他类型病毒和细胞基质产生交叉反应，表现了良好的特异性。

实施例5检测寨卡病毒非洲型及特异性试验

利用寨卡病毒非洲型(dq859059)(由暨南大学病原微生物与免疫学系提供)细胞培养液检测本发明最优引物的特异性。

1.提取病毒rna

根据试剂厂商说明书，采用trizol(takara，9109)核酸提取法提取寨卡病毒(dq859059)细胞培养液中zikv病毒核酸。其中阳性质控品(同实施例4)粉末简短离心后，溶于0.5ml无菌depc水中。

具体步骤同实施例1的“1.提取病毒rna”。

2采用一步探针法进行realtimeonesteprt-pcr(takara，rr064a)对探针(seqidno.3)的荧光信号进行监测。

按表5组份配制rt-pcr反应液(反应液配制请在冰上进行)。

反应条件同实施例4。

扩增曲线结果如图6所示，a为寨卡病毒非洲型毒株检测样本，b阳性质控品。a的ct值均小于34；而阳性质控品的ct值均大于34。由此可见，本发明适用于寨卡病毒非洲型毒株的检测，且不与黄热病毒属其它病毒产生交叉反应，不与其他类型病毒和细胞基质产生交叉反应，表现了良好的特异性。

实施例6适用性试验

选取两例寨卡病毒病人分离血清样本(寨卡病人确诊患者血清由广东省疾病控制中心提供)，根据实施例3的方法进行寨卡病毒检测，验证试剂盒适用性。

1.提取病毒rna

根据试剂厂商说明书，采用trizol(takara，9109)核酸提取法提取寨卡病人血清中zikv病毒核酸。其中阳性质控品(同实施例4)粉末简短离心后，溶于0.5ml无菌depc水中。具体步骤同实施例1的“1.提取病毒rna”。

2.采用一步探针法进行realtimeonesteprt-pcr(takara，rr064a)对探针(seqidno.3)的荧光信号进行监测。

按表5组份配制rt-pcr反应液(反应液配制请在冰上进行)。

反应条件同实施例4。

扩增曲线结果如图7所示，a为一病人病毒毒株检测样本，b为另一病人病毒毒株检测样本，c为阳性质控品。a和b的ct值均小于34，判定为阳性，而阳性质控品的ct值均大于34。由此可见，本发明可检测临床血样，具有良好的适用性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>暨南大学

<120>一种寨卡病毒一步法荧光rt-pcr检测方法及试剂盒

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>上游引物核苷酸序列

<400>1

ggttctcatcaatggttttgct22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>下游引物核苷酸序列

<400>2

tggaacaaccatcgctcgta20

<210>3

<211>14

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>探针核苷酸序列

<400>3

tggcctggttggca14

<210>4

<211>368

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>寨卡病毒基因目的片段核苷酸序列

<400>4

tggccttggcctcgtgtcttttgcaaactgcgatctccgccttggaaggcgacctgatgg60

ttctcatcaatggttttgctttggcctggttggcaatacgagcgatggttgttccacgca120

ctgataacatcaccttggcaatcctggctgctctgacaccactggcccggggcacactgc180

ttgtggcgtggagagcaggccttgctacttgcggggggtttatgctcctctctctgaagg240

gaaaaggcagtgtgaagaagaacttaccatttgtcatggccctgggactaaccgctgtga300

ggctggtcgaccccatcaacgtggtgggactgctgttgctcacaaggagtgggaagcgga360

gctggccc368