本发明属于生物技术领域，具体涉及利用基因工程手段，高效创制低木质素含量紫花苜蓿的方法。
背景技术：
紫花苜蓿(medicagosatival.)是我国种植面积最大的人工牧草，由于其产草量高，适口性好，营养价值列牧草之首，又被称为“牧草为王”。紫花苜蓿不仅含有蛋白质、矿物质和维生素等重要的营养成分，还含有动物所需的必需氨基酸、微量元素和未知生长因子。在相同的土地上，紫花苜蓿比禾本科牧草所收获的可消化蛋白质高2.5倍，矿物质高6倍左右，可消化养分高2倍左右。与其它粮食作物相比，紫花苜蓿单位面积营养物质的产量也较高。另外，紫花苜蓿还在土壤改良、水土保持及生态环境保护等方面发挥着重要而积极的作用。紫花苜蓿在中国、美国、澳大利亚等国家广泛种植，目前在我国的种植面积在2千万亩，居世界第四。改良紫花苜蓿的品种，提高其营养价值，对我国乃至世界的畜牧业具有重要的意义。
紫花苜蓿进入牛和羊的肠胃后，由于牧草的特性而存在消化不完全的现象，从而影响了牲畜对营养物质的吸收。造成这一现象的主要原因是植物细胞壁中存在过量的木质素。木质素是组成植物细胞壁的重要化学成分，位于纤维素和半纤维素之间，能够增强植物体的机械强度，增强植物的抗压性和支撑力、利于疏导组织水分运输、抵御病虫害的侵袭等，对植物的正常生长具有重要的作用。但是，木质素本身很难被动物消化；而且，由于木质素的存在，还妨碍了其他营养成分如纤维素、半纤维素的利用。研究表明，牲畜对苜蓿干物质的消化率与木质素含量具有显著的负相关，饲料中所含的木质素是影响饲料消化率的限制因子。如果降低饲料细胞壁中木质素含量，使木质化细胞易被消化，则能显著提高饲料的可消化性和利用率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从种子开始，通过植物细胞工程手段，获得含反义4cl1基因低木质素含量紫花苜蓿的方法，通过该方法能100％获得木质素含量降低10％以上的紫花苜蓿材料。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种利用基因工程手段高效创制低木质素含量紫花苜蓿的方法，包括如下步骤：
1)获得紫花苜蓿无菌苗：紫花苜蓿种子经0.1％的hgcl2灭菌后，播种在湿润的无菌滤纸上，25℃，暗培养，直至发芽，得紫花苜蓿无菌苗。
2)预培养：取紫花苜蓿无菌苗的子叶，切成0.2cm2～0.3cm2小块，接种于预培培养基上，25℃，暗培养1d。
优选的，所述的预培培养基为：以ms培养基为基本培养基，添加4mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)，按重量百分比添加3％的蔗糖和0.7％的琼脂，调ph至5.8。
3)侵染：将内含反义表达载体p2300-ubi-4fan-4cl的农杆菌lba4404的菌液于3000r/min离心10min，收集菌体，用侵染培养基重悬菌体；将步骤2)预培养1d的子叶转入菌体与侵染培养基的混合物中，120r/min，震荡处理20min，获得侵染子叶。
所述的内含反义表达载体p2300-ubi-4fan-4cl的农杆菌lba4404的制备方法为：提取紫穗槐总dna，以紫穗槐的总dna为模板，以特异性引物进行pcr扩增，获得紫穗槐4cl1基因片段，将4cl1基因片段与表达载体p2300-ubi-4fan连接，构建重组表达载体p2300-ubi-4fan-4cl。冻融法将重组表达载体p2300-ubi-4fan-4cl转化到农杆菌lba4404中。
所述的特异性引物的序列为：
5’末端引物序列(5’to3’)：tcgcctatgactgggcacaacaga
3’末端引物序列(5’to3’)：aagaaggcgatagaaggcgatgcg
所述的侵染培养基是：以ms培养基为基本培养基，添加2mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、0.2mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)、200mg/l乙酰丁香酮(as)，按重量百分比添加3％的蔗糖，调节ph至5.8。
4)共培养：将浸染子叶转入共培培养基上，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下，光照培养3d，得共培养后的浸染子叶。
优选的，所述的共培培养基是：以ms培养基为基本培养基，添加2mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、0.2mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)、200mg/l乙酰丁香酮(as)，按重量百分比添加3％的蔗糖和0.7％的琼脂，调节ph至5.8。
5)愈伤组织的诱导：将共培养后的浸染子叶接种于愈伤组织诱导培养基上，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下光照培养，诱导愈伤组织的形成。
优选的，所述的愈伤组织诱导培养基是：以ms培养基为基本培养基，添加2mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、0.2mg/l6-苄基腺嘌呤(6-ba)、100mg/l硫酸卡那霉素(kan)、400mg/l头孢霉素(cef)，按重量百分比添加3％的蔗糖和0.7％的琼脂，调节ph至5.8。
6)不定芽的分化：将形成的愈伤组织切成0.2cm2～0.3cm2，转入分化培养基，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下光照培养，每28d继代一次。
所述的分化培养基是：以ms培养基为基本培养基，添加0.2mg/l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、2mg/l6-糠氨基嘌呤(kt)、100mg/l硫酸卡那霉素(kan)、300mg/l头孢霉素(cef)，按重量百分比添加3％的蔗糖和0.7％的琼脂，调节ph至5.8。
7)生根诱导：当不定芽长至2cm～3cm时，从基部切下，转入生根培养基中生根，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下光照培养。
优选的，所述的生根培养基是：以ms培养基为基本培养基，添加0.5mg/lα-萘乙酸(naa)，按重量百分比添加3％的蔗糖和0.7％的琼脂，调节ph至5.8。
8)当生根苗的根长至2～3cm时，打开瓶口炼苗，然后移栽到混合好的基质中。
优选的，所述的基质是：按重量比，栽培土：草炭：蛭石＝1：2：1的混合。
本发明的有益效果是：
1、本发明，所用的农杆菌菌株为lba4404，内含由本实验室构建的表达载体p2300-ubi-4fan-4cl，结构如图1所示。载体中目的基因4cl1来源于紫穗槐，将扩增出来的4cl1基因片段反向插入载体p2300-ubi-4fan，构建重组质粒p2300-ubi-4fan-4cl，用冻融法将p2300-ubi-4fan-4cl转入农杆菌lba4404，鉴定正确的农杆菌分装于冻存管中，于-80℃冰箱保存。活化后的菌株接种到含有125mg/l硫酸链霉素(str)和100mg/l硫酸卡那霉素(kan)的yep液体培养基中，28℃，200r/min，进行扩大培养，待菌液od600值为0.5～0.6时用于浸染。
2、采用本发明的方法，对再生植株进行分子鉴定、木质素含量测定，以外观、株高、单株重为指标，比较转基因与野生型材料在生长势方面的差异，以生长势与野生型无显著差异的转基因植株为最终获得的生长正常的低木质素含量植株。
3、采用本方法能在55d-60d内，100％获得木质素含量降低10％以上的转基因紫花苜蓿，从中选择的生长发育正常的材料可用作紫花苜蓿品质育种。本发明为快速、高效培育优质苜蓿种质资源提供了可行的手段。
附图说明
图1是重组表达载体p2300-ubi-4fan-4cl的结构图。
具体实施方式
实施例1一种利用基因工程手段高效创制低木质素含量紫花苜蓿的方法
(一)方法如下：
1)菌液的准备
①p2300-ubi-4fan-4cl的构建及转入农杆菌的方法
提取紫穗槐总dna，以紫穗槐的总dna为模板，以特异性引物进行pcr扩增，扩增出紫穗槐4cl1基因片段，将紫穗槐4cl1基因片段与表达载体p2300-ubi-4fan连接构建重组表达载体p2300-ubi-4fan-4cl，将重组表达载体p2300-ubi-4fan-4cl用冻融法转化到农杆菌lba4404中，将鉴定正确的农杆菌分装于冻存管中，于-80℃冰箱保存。所述的特异性引物的序列为：
5’末端引物序列(5’to3’)：tcgcctatgactgggcacaacaga
3’末端引物序列(5’to3’)：aagaaggcgatagaaggcgatgcg
②将含有p2300-ubi-4fan-4cl的农杆菌lba4404菌株接种到含有125mg/l硫酸链霉素(str)和100mg/l硫酸卡那霉素(kan)的yep液体培养基，28℃，200r/min，进行扩大培养，待菌液od600值为0.5时用于浸染。
2)无菌苗的获得
挑选颗粒饱满的紫花苜蓿(品种：“甘农4号”)种子，用0.1％的hgcl2灭菌10min，无菌水洗3次，播种在湿润的无菌滤纸上，25℃，暗培养，直至发芽，获得紫花苜蓿无菌苗。
3)预培养
取紫花苜蓿无菌苗的子叶，切成0.2cm2～0.3cm2小块，接种于预培培养基上，25℃，暗培养1d。
预培培养基为：ms+4mg/l2,4-d+3％蔗糖+0.7％琼脂，调ph至5.8。
4)侵染
将od600值为0.5的内含反义表达载体p2300-ubi-4fan-4cl的农杆菌lba4404的菌液转入灭菌的50ml的离心管中，于3000r/min离心10min，收集菌体，用侵染培养基重悬菌体。将步骤3)预培养的子叶转入菌体与侵染培养基的混合物中，25℃，120r/min震荡，使子叶与农杆菌充分接触。震荡处理20min后取出侵染子叶，置于铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干子叶表面的多余的菌液。
侵染培养基为：ms+2mg/l2,4-d+0.2mg/l6-ba+200mg/las+3％蔗糖，调节ph至5.8。
5)共培养
将浸染子叶，转入不加抗生素的共培培养基上，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下，光照培养3d，得共培养后的浸染子叶。
共培培养基是：ms+2mg/l2,4-d+0.2mg/l6-ba+200mg/las+3％蔗糖+0.7％琼脂，调节ph至5.8。
6)愈伤组织的诱导
将共培养后的浸染子叶接种于愈伤组织诱导培养基上，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下光照培养，诱导愈伤组织的形成，培养15d后形成了黄绿色的愈伤组织。
愈伤组织诱导培养基为：ms+2mg/l2,4-d+0.2mg/l6-ba+100mg/lkan+400mg/lcef+3％蔗糖+0.7％琼脂，调节ph至5.8。
7)不定芽的分化
愈伤组织形成后，将愈伤组织切成0.2cm2～0.3cm2，转入分化培养基，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下光照培养。每28d继代一次，培养20d后开始形成绿色的芽点；30d后不定芽伸长至2cm左右。
分化培养基为：ms+0.2mg/l2,4-d+2mg/lkt+100mg/lkan+300mg/lcef+3％蔗糖+0.7％琼脂，调节ph至5.8。
8)生根诱导
不定芽长至2cm～3cm时，从其基部切下，转入生根培养基生根，25℃、12h/日、光照度30umol/m2·s下光照培养。优选的，所述的生根培养基是：ms+0.5mg/lnaa+3％蔗糖+0.7％琼脂，调节ph至5.8。
9)炼苗及移栽
当生根苗的根长至2～3cm时，打开瓶口炼苗2～3d，然后移栽到混合好的基质。
基质是：按重量比，栽培土：草炭：蛭石＝1：2：1的混合。
(二)再生植株的分子检测
分别以上述(一)获得转基因紫花苜蓿植株基因组dna、野生型紫花苜蓿基因组dna和质粒p2300-ubi-4fan-4cl为模板进行pcr反应。
对转化的紫花苜蓿进行pcr检测及目的条带测序，结果表明，采用(一)中移栽成活的10株转基因紫花苜蓿植株中均扩增出反义4cl1片段，成活植株100％为转化株。
木质素含量检测表明，10株转基因植株的木质素含量均减低10％以上。