一种提高拉乌尔菌2,5-呋喃二甲酸产量的方法与流程

文档序号:15457395发布日期:2018-09-15 01:28

本发明涉及一种提高拉乌尔菌2,5-呋喃二甲酸产量的方法,属于代谢工程技术领域。



背景技术:

2,5-呋喃二甲酸(2,5-Furandicarboxylic acid,FDCA)是一种重要的化工原料和有机合成的前体,可用来制备多种脂类呋喃或烷基取代衍生物,并且被美国能源部列为最有前景的12种平台化合物之一。此外,2,5-呋喃二甲酸还可以作为对苯二甲酸的替代物用来制造聚酯类的塑胶产品,具有广阔的应用前景。

目前,制备2,5-呋喃二甲酸的方法主要有化学合成法和生物转化法。化学合成法一般利用贵金属作为催化剂,需要高压、高温和有机溶剂等条件,从而造成较高的制造成本和严重环境污染问题。生物转化法一般以5-羟甲基糠醛为底物,利用酶或全细胞转化法生成2,5-呋喃二甲酸。与化学合成法相比,生物转化法具有条件温和、低毒和环保等优点。然而由于5-羟甲基糠醛对细胞的毒害作用,只有极少数的微生物可以降解该化合物。其中,解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica BF60)可以催化5-羟甲基糠醛生成2,5-呋喃二甲酸,具有较高的底物转化率及应用前景等优势。但是在催化过程中副产物2,5-呋喃二甲醇的生成限制了2,5-呋喃二甲酸的高效合成。

在解鸟氨酸拉乌尔菌催化5-羟甲基糠醛氧化的过程中,5-羟甲基糠醛会首先被还原为2,5-呋喃二甲醇,然后再被逐步氧化生成2,5-呋喃二甲酸。研究发现,在大肠杆菌或酵母中催化5-羟甲基糠醛还原的酶是胞内的多种非特异性氧化还原酶。在解鸟氨酸拉乌尔菌中也存在类似的氧化还原酶,将5-羟甲基糠醛还原为2,5-呋喃二甲醇。因此,本研究通过敲除解鸟氨酸拉乌尔菌中的五个5-羟甲基糠醛还原酶基因,降低副产物2,5-呋喃二甲醇的生成,从而提高2,5-呋喃二甲酸的产量。



技术实现要素:

本发明的目的是通过敲除五个5-羟甲基糠醛还原酶基因(akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA),减少副产物2,5-呋喃二甲醇的生成,进而提高2,5-呋喃二甲酸的产量。发明内容简单易操作,可广泛应用Raoultella属的各种菌株。

本发明的第一个目的是提供一种2,5-呋喃二甲酸产量提高的解鸟氨酸拉乌尔菌,是以解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)BF60(菌株已于论文Hossain,G.S.,Yuan,H.,Li,J.,Shin,H.D.,Wang,M.,Du,G.,Chen,J.,Liu,L.2017.Metabolic Engineering of Raoultella ornithinolytica BF60for Production of 2,5-Furandicarboxylic Acid from 5-Hydroxymethylfurfural.Appl Environ Microbiol,83(1),e02312-16.中公开)为出发菌株,敲除akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA中的至少3个基因。

在本发明的一种实施方式中,所述敲除是以Red重组系统进行敲除。

在本发明的一种实施方式中,所述敲除的具体步骤如下:

(1)以pKD13质粒为模板,分别设计含有目标基因akR、aldR、AdhP1、AdhP2或dkgA两侧同源片段的引物扩增出需敲除目的基因的打靶片段;

(2)将(1)中所获得的打靶片段电转化入含有氯霉素抗性基因的pKD46质粒的R.ornithinolytica BF60中,涂布含有卡那霉素抗性的平板,通过菌落PCR验证获得阳性克隆菌株。

(3)高温培养(2)中所获得的阳性克隆菌,丢失掉温敏型pKD46质粒,然后电转化入pCP20质粒,高温培养消除卡那霉素抗性基因标记,然后采用不同抗性平板筛选出同时丢失掉pCP20质粒和卡那霉素抗性基因标记的突变株,此突变株即为目标基因缺失的R.ornithinolytica。

(4)重复步骤(1)~(3),以敲除五个5-羟甲基糠醛还原酶基因(akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA)。

在本发明的一种实施方式中,所述的五个5-羟甲基糠醛还原酶基因中,醛酮还原酶编码基因akR如SEQ ID NO.1所示,醇脱氢酶编码基因aldR如SEQ ID NO.2所示,醇脱氢酶编码基因AdhP1如SEQ ID NO.3所示,醇脱氢酶编码基因AdhP2如SEQ ID NO.4所示,2,5-二脱氢葡萄糖酸还原酶编码基因dkgA如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供一种提高解鸟氨酸拉乌尔菌2,5-呋喃二甲酸产量的方法。

在本发明的一种实施方式中,所述方法具体步骤如下:

(1)以pKD13质粒为模板,分别设计含有目标基因akR、aldR、AdhP1、AdhP2或dkgA两侧同源片段的引物,扩增出需敲除目的基因的打靶片段;

(2)将(1)中所获得的打靶片段电转化入含有氯霉素抗性基因的pKD46质粒的R.ornithinolytica BF60中,涂布含有卡那霉素抗性的平板,通过菌落PCR验证获得阳性克隆菌株;

(3)高温培养(2)中所获得的阳性克隆菌,丢失掉温敏型pKD46质粒,然后电转化入pCP20质粒,高温培养消除卡那霉素抗性基因标记,然后采用不同抗性平板筛选出同时丢失掉pCP20质粒和卡那霉素抗性基因标记的突变株,此突变株即为目标基因缺失的R.ornithinolytica;

(4)重复步骤(1)~(3),以敲除五个5-羟甲基糠醛还原酶基因(akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA)。

本发明的第三个目的是提供应用所述重组R.ornithinolytica BF60生产2,5-呋喃二甲酸的方法。

在本发明的一种实施方式中,所述方法是以所述重组R.ornithinolytica BF60静息细胞为生物催化剂,以5-羟甲基糠醛为底物,在锥形瓶中进行催化生产2,5-呋喃二甲酸。

在本发明的一种实施方式中,所述重组R.ornithinolytica BF60按照1.5~5g细胞/g 5-羟甲基糠醛的用量进行催化反应。

在本发明的一种实施方式中,所述催化是在20~37℃下反应12~60h。

在本发明的一种实施方式中,所述重组R.ornithinolytica BF60按下述步骤培养获得:

(1)种子液培养:从平板挑取重组R.ornithinolytica BF60单菌落接种于液体LB培养基(胰蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L)中,30℃、220rpm培养12h;

(2)菌体培养:将种子液以1%(V/V)的接种量转接到TB培养基(胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、K2HPO4 12.5g/L、KH2PO4 2.3g/L、甘油4mL/L)中,30℃、220rpm培养24h。

本发明还提供所述重组R.ornithinolytica BF60在食品、生物、化工领域的应用。

有益效果:本发明通过同源重组的方法同时敲除了拉乌尔菌中的五个5-羟甲基糠醛还原酶基因(akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA),削弱了宿主菌由5-羟甲基糠醛还原为2,5-呋喃二甲醇的途径,从而减少了2,5-呋喃二甲醇的生成,促进了5-羟甲基糠醛转化生成2,5-呋喃二甲酸。在实施例生物催化过程中,同时敲除akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA基因的拉乌尔菌中2,5-呋喃二甲醇的含量比出发菌株降低了37.0%,同时2,5-呋喃二甲酸的含量增加了23.2%。

附图说明

图1基因敲除突变株PCR验证电泳图;其中,M:Marker;1、3、5、7:分别为aldR-dkgA、akR、AdhP1和AdhP2的原始基因;2:aldR-dkgA基因同时缺失并插入FRT位点后的片段;4:akR基因缺失并插入FRT位点后的片段;6:AdhP1基因缺失并插入FRT位点后的片段;8:AdhP2基因缺失并插入FRT位点后的片段。

图2不同5-羟甲基糠醛基因的缺失对改造R.ornithinolytica BF60后的菌株生物催化效率的影响;“Δ”表示敲除。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。

2,5-呋喃二甲醇的测定方法:高效液相色谱(HPLC)检测法:Agilent 1260,VWD检测器,检测波长230nm,YMC-Pack ODS-A色谱柱,柱温35℃,流速0.6ml/min,流动相:(A)纯水,(B)乙腈;梯度洗脱程序:0min,5%B;15min,100%B;20min,5%B;30min,5%B。

2,5-呋喃二甲酸的测定方法:高效液相色谱(HPLC)检测法:Agilent 1260,VWD检测器,检测波长268nm,Aminex HPX-87H色谱柱,柱温60℃,流速0.6ml/min,流动相10mM H2SO4。

实施例1本实施例说明利用Red重组系统敲除R.ornithinolytica BF60中akR基因的方法。

1)从平板上挑取R.ornithinolytica BF60的单克隆菌株接种于液体LB培养基中,30℃、220rpm培养至OD600=0.6时,制备电转化感受态。

2)将含有氯霉素抗性标记的pKD46质粒电转化入1)步骤中所述的感受态中,涂布氯霉素抗性平板并放入30℃培养箱培养12h。

3)挑取2)步骤平板中的单菌落,接入液体LB培养基(氯霉素抗性)中,30℃、220rpm培养至OD600=0.2时,加入L-阿拉伯糖(终浓度10mM)继续培养至OD600=0.6,再次制备电转化感受态。

4)以pKD13质粒为模板,设计两端带有akR基因两端同源片段的引物扩增出含有卡那霉素抗性基因标记的线性DNA打靶片段。引物序列为:

上游引物akR-D-F:GCCAGGCGCTAAAAAATCTCAAGATCCCGCGCGAAAACGTGGTGGTCGCCACCAAGGTGTTCGGTGAATTCTCCGTGGACCTGCAG

下游引物akR-D-R:CTGATGGAGCAGCCACGCGAGCGCGACCTGCGCGACCGTCGCGCCTTTGGCGTCCGCCACCTCGCGCGGTACCGAGCTCGGATCCG

以pKD13为模板进行PCR扩增,扩增反应条件:95℃预变性3min;95℃变性30s,55℃15s,72℃2min,循环31次;72℃5min;12℃保温。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后进行切胶回收,获得akR基因的打靶片段。

5)将步骤4)获得的打靶片段电转化入步骤3)中的感受态细胞中,涂布卡那霉素抗性的LB平板,30℃培养12h。然后挑取平板上的单菌落进行菌落PCR验证,筛选阳性克隆。

6)挑取步骤5)中的阳性克隆高温(40℃)培养,丢失掉温敏型pKD46质粒,然后再电转化入pCP20质粒,挑取阳性克隆菌,接入液体LB培养基高温(40℃)培养以诱导表达FLP重组酶的表达,从而消除掉步骤5)中引入到基因组中的卡那霉素抗性基因标记。

7)以R.ornithinolytica BF60出发菌株和R.ornithinolytica BF60_ΔakR基因组为模板进行PCR扩增验证,结果如图1所示。泳道3所示PCR条带1038bp和泳道4所示PCR条带640bp与理论一致,说明akR基因缺失菌株构建成功。

按照上述相同的策略对aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA进行敲除,其中用于扩增打靶序列的引物分别为:AldR-D-F:TCGTCATCTGGCCGGGATATCTTCTCCGCCGGCAGTTTTCTCTTATTGAGGTGATGAGCAGAATTCTCCGTGGACCTGCAG;AldR-D-R:TTAAACTCCTCTCCTTCGCATCCGATGACGCGAAGGAGAGGGCGTATCAGCAGGGGAGAAGGTACCGAGCTCGGATCCG;AdhP1-D-F:AAATCATTGGCCGCGTCGCGGCGCTGGGCAGCGCGGCGCAGGAGAAAGGGCTGAAGGTCGGAATTCTCCGTGGACCTGCAG;AdhP1-D-R:CGGATCAGGGTAAAGGCGGGTACCGGGAACGGCTTCATCACCGCGCCGACGGTATGGAATGGTACCGAGCTCGGATCCG;AdhP2-D-F:CCCTGCGTGCCGGGGCATGAAATCGTCGGCCGGGTGACCGCCGTCGGCGAACACGTCTCCGAATTCTCCGTGGACCTGCAG;AdhP2-D-R:CGCCAATCATCGACCCGGCAATCGACCGACGACGAAATATCAGGTTAAACACTTCCGGCGGGTACCGAGCTCGGATCCG;DkgA-D-F:ATGACACATCCAACCGTGATAAAACTGCACGACGGCAACCTGATGCCACAGCTGGGCCTCGGCGTGAATTCTCCGTGGACCTGCAG;DkgA-D-R:TTAGCCGCCAAACTGGTCAGGATCTGGCCCGAGGCGCTTGTTGATATCCAGCTTCGCCATTGCTCGGTACCGAGCTCGGATCCG。基因敲除菌株的电泳图如图1所示,泳道1所示PCR条带2364bp和泳道2所示PCR条带350bp与理论一致,说明aldR和dkgA基因同时缺失的菌株构建成功;泳道5所示PCR条带1020bp和泳道6所示PCR条带602bp与理论一致,说明AdhP1基因缺失菌株构建成功;泳道7所示PCR条带1050bp和泳道8所示PCR条带554bp与理论一致,说明AdhP2基因缺失菌株构建成功。

实施例2应用同时敲除5个5-羟甲基糠醛还原酶的重组R.ornithinolytica BF60-xiv进行2,5-呋喃二甲酸的生产。

种子液培养:从平板挑取BF60-xiv菌株的单菌落接种于液体LB培养基中,30℃、220rpm培养12h。

菌体培养:将种子液以1%(V/V)的接种量转接到TB培养基中,30℃、220rpm培养24h。

生物催化:将上一步获得的菌体进行离心收集(4℃、6000rpm、10min),用50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)洗涤菌体两次,随后用同样的缓冲液重悬菌体至OD600=100。然后加入100mM底物5-羟甲基糠醛,进行生物催化反应生产2,5-呋喃二甲酸。

催化48h后取样进行HPLC分析。催化结果表明,BF60-xiv菌株的2,5-呋喃二甲酸产量可以达到62.3mM,比原始菌株提高了23.2%。同时,2,5-呋喃二甲醇含量为25.2mM,比原始菌株降低了37.0%。

采用上述相同方法对akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA基因的单敲除及组合敲除的重组菌进行催化反应,结果如图2所示。从图中结果可以看出,在单个基因缺失的突变株中,只有aldR基因缺失的突变株中2,5-呋喃二甲醇的含量有明显的降低,同时2,5-呋喃二甲酸的含量有了一定的提高。而对于多个基因的组合缺失突变株,2,5-呋喃二甲醇的含量均有一定的降低,同时2,5-呋喃二甲酸的含量也有不同程度的提高。当5个基因同时缺失时,2,5-呋喃二甲醇的含量最低,同时2,5-呋喃二甲酸的含量达到最高值。由于在R.ornithinolytica BF60菌株中,催化5-羟甲基糠醛还原为2,5-呋喃二甲醇的akR、aldR、AdhP1、AdhP2和dkgA基因是协同作用的。因此,单个基因的缺失并不能显著降低2,5-呋喃二甲醇的生成,只有多个基因同时缺失时才可以降低2,5-呋喃二甲醇的含量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高拉乌尔菌2,5-呋喃二甲酸产量的方法

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 1038

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<213> 人工序列

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atgacctttg gcggtgaaga ggggatgtgg ggcaaaattg gccagctgcg ccaggcggaa 120

gccgagcagc tggtgggcag cgccctggat gccggcatta actttatcga caccgcaaac 180

gtctattcgg aagggcgttc ggaagagata accggccagg cgctaaaaaa tctcaagatc 240

ccgcgcgaaa acgtggtggt cgccaccaag gtgttcggtg aaaccggcac cgccggcgtt 300

aactcccgcg gtagctcccg ctatcacatt ctcagcagcg tcaaagagag cctgcggcgc 360

ctgcagctcg atcatatcga tctctaccag ctgcacggct tcgatccggc gacgcccgtc 420

gaagagaccc tctacgccct ggataccctg gtccgtcagg ggcacgtccg ctatatcggc 480

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ctggcccgct ttgcctccct gcaggcttac tacaccatcg ccgggcgcga cctcgagcgc 600

gagctggtgc cgatgatgca gagcgaaggg ctggggctaa tggtctggag cccgctggcg 660

ggcggattgc tgagcggcaa atacacccgc gacggccagg gagaagcggg cggtcgccgg 720

ctggaatttg atttcccgcc ggtgaataag gatcgcgcct ttgattgcgt ggacgcgatg 780

cgcgaggtgg cggacgccaa aggcgcgacg gtcgcgcagg tcgcgctcgc gtggctgctc 840

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<400> 8

tcgtcatctg gccgggatat cttctccgcc ggcagttttc tcttattgag gtgatgagca 60

gaattctccg tggacctgca g 81

<210> 9

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttaaactcct ctccttcgca tccgatgacg cgaaggagag ggcgtatcag caggggagaa 60

ggtaccgagc tcggatccg 79

<210> 10

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaatcattgg ccgcgtcgcg gcgctgggca gcgcggcgca ggagaaaggg ctgaaggtcg 60

gaattctccg tggacctgca g 81

<210> 11

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cggatcaggg taaaggcggg taccgggaac ggcttcatca ccgcgccgac ggtatggaat 60

ggtaccgagc tcggatccg 79

<210> 12

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccctgcgtgc cggggcatga aatcgtcggc cgggtgaccg ccgtcggcga acacgtctcc 60

gaattctccg tggacctgca g 81

<210> 13

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgccaatcat cgacccggca atcgaccgac gacgaaatat caggttaaac acttccggcg 60

ggtaccgagc tcggatccg 79

<210> 14

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgacacatc caaccgtgat aaaactgcac gacggcaacc tgatgccaca gctgggcctc 60

ggcgtgaatt ctccgtggac ctgcag 86

<210> 15

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttagccgcca aactggtcag gatctggccc gaggcgcttg ttgatatcca gcttcgccat 60

tgctcggtac cgagctcgga tccg 84

再多了解一些
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