本发明属于生物技术领域，涉及一种环二肽合成酶及其应用。
背景技术：
环二肽(2,5-diketopiperazines,dkps)及其衍生物具有抗细菌、真菌、病毒的功能，有些环二肽还能促进植物生长。如铜绿假单胞菌pao1菌株产生的3种环二肽就具有促生活性。有一些种类的环二肽及其衍生物还能作为一种群体感应的新的信号分子，能与luxr类蛋白互作，从而参与细菌种间甚至不同种生物间的信号传导，调控相关基因表达。lactobacillusreuterirc-14产生的2种环二肽能作用于金黄葡萄球菌(staphylococcusaureus)mn8菌株的qs系统，从而抑制其致病性。假单胞菌株pao1产生3种环二肽也具有qs信号分子的功能。环二肽及其衍生物由于具有多种生物学活性，并且其环状结构的稳定性，这类物质已经成为了新药创制的重要研究对象。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种环二肽合成酶。
本发明的另一目的是提供该环二肽合成酶的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种合成环-l-谷氨酸-l-亮氨酸的环二肽合成酶，选自：
(1)为具有seqidno.2所示氨基酸序列的多肽；
(2)为seqidno.2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有天冬氨酸转氨酶活性的多肽；或者其多肽的活性片段、类似物或衍生物；
(3)与seqidno.2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
本发明所述的环二肽合成酶，优选：
(1)为具有seqidno.2所示氨基酸序列的多肽；
(2)在seqidno.2所示氨基酸序列的基础上第102位氨基酸残基由r变为a的多肽。
本发明所述的环二肽合成酶的编码基因序列。
本发明所述的编码基因序列优选seqidno.2所示的氨基酸序列的编码基因序列，进一步优选如seqidno.1所示。
本发明所述的编码基因序列，优选在seqidno.2所示氨基酸序列的基础上第102位氨基酸残基由r变为a的多肽的编码基因序列，进一步优选如seqidno.19所示的基因序列。
本发明所述的环二肽合成酶在生物合成环-l-谷氨酸-l-亮氨酸中的应用。
表达本发明所述的环二肽合成酶的基因工程菌在生物合成环-l-谷氨酸-l-亮氨酸中的应用。
作为本发明所述的应用的一种优选方式，包括以下步骤：
(1)构建表达权利要求1所述的环二肽合成酶的基因工程菌；
(2)在终浓度为50μg/ml卡那霉素的m9培养基中发酵该工程菌株，发酵结束后利用乙酸乙酯对发酵上清进行萃取，得到环-l-谷氨酸-l-亮氨酸粗品；
(3)环-l-谷氨酸-l-亮氨酸粗品经0.22μm的滤膜过滤后利用hplc进行纯化，得到环-l-谷氨酸-l-亮氨酸纯品。
作为本发明所述的应用的进一步优选，包括以下步骤：
(1)以生防假单胞菌pf-5菌株的基因组为模板，引物cdps-fp和cdps-rp扩增环二肽合成酶编码基因，将其克隆到pet28a(+)的相同的酶切位点，再转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，测序正确后，得到含有重组载体pet28/pfl_1389的bl21(de3)工程菌株；引物cdps-fp序列如seqidno.3所示，引物cdps-rp序列如seqidno.4所示；
(2)在终浓度为50μg/ml卡那霉素的m9培养基中发酵该工程菌株，发酵结束后利用乙酸乙酯对发酵上清进行萃取，得到环-l-谷氨酸-l-亮氨酸粗品；
(3)环-l-谷氨酸-l-亮氨酸粗品经0.22μm的滤膜过滤后利用hplc进行纯化，得到环-l-谷氨酸-l-亮氨酸纯品；
或者包括以下方法：
(1)以重组质粒pet28/pfl_1389的dna为模板，以引物r102afp和r102arp进行反向pcr扩增，回收扩增产物，并用dpni消化质粒模板，在65℃下处理10min，使内切酶失活；然后再纯化片段，利用磷酸化酶对回收片段磷酸化，再对磷酸化的片段进行连接反应，并转化大肠杆菌top10感受态细胞，挑取转化子测序正确后，将序列正确的质粒转入bl21(de3)感受态细胞，即得到表达突变体的大肠杆菌工程菌；
(2)在终浓度为50μg/ml卡那霉素的m9培养基中发酵所述的表达突变体的大肠杆菌工程菌，发酵结束后利用乙酸乙酯对发酵上清进行萃取，得到环-l-谷氨酸-l-亮氨酸粗品；
(3)环-l-谷氨酸-l-亮氨酸粗品经0.22μm的滤膜过滤后利用hplc进行纯化，得到环-l-谷氨酸-l-亮氨酸纯品。
一种生物合成环-l-谷氨酸-l-亮氨酸的方法，包括如下步骤：
(1)以生防假单胞菌pf-5菌株的基因组为模板，引物cdps-fp和cdps-rp扩增环二肽合成酶编码基因，将其克隆到pet28a(+)的相同的酶切位点，再转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，测序正确后，得到含有重组载体pet28/pfl_1389的bl21(de3)工程菌株；引物cdps-fp序列如seqidno.3所示，引物cdps-rp序列如seqidno.4所示；
(2)在终浓度为50μg/ml卡那霉素的m9培养基中发酵该工程菌株，发酵结束后利用乙酸乙酯对发酵上清进行萃取，得到环-l-谷氨酸-l-亮氨酸粗品；
(3)环-l-谷氨酸-l-亮氨酸粗品经0.22μm的滤膜过滤后利用hplc进行纯化，得到环-l-谷氨酸-l-亮氨酸纯品；
或者包括如下步骤：
(1)以重组质粒pet28/pfl_1389的dna为模板，以引物r102afp和r102arp进行反向pcr扩增，回收扩增产物，并用dpni消化质粒模板，在65℃下处理10min，使dpni酶失活；然后再纯化片段，对纯化片段进行磷酸化之后，再进行连接反应，并转化大肠杆菌top10感受态细胞，挑取转化子测序正确后，将序列正确的质粒转入bl21(de3)感受态细胞，即得到表达突变体的大肠杆菌工程菌；
(2)在终浓度为50μg/ml卡那霉素的m9培养基中发酵所述的表达突变体的大肠杆菌工程菌，发酵结束后利用乙酸乙酯对发酵上清进行萃取，得到环-l-谷氨酸-l-亮氨酸粗品；
(3)环-l-谷氨酸-l-亮氨酸粗品经0.22μm的滤膜过滤后利用hplc进行纯化，得到环-l-谷氨酸-l-亮氨酸纯品。
有益效果：
本发明提供了一种新的环二肽合成酶及其编码基因，该合成酶能催化一种新的环二肽环-l-谷氨酸-l-亮氨酸(cyclo-l-glu-l-lue)的生物合成。本发明通过点突变构建了该合成酶的突变体，使其合成产物的能力提高了20％。
附图说明
图1大肠杆菌表达环-l-谷氨酸-l-亮氨酸合成酶表达载体的构建以及重组蛋白的纯化.
a:表达载体的结构图；b：sds-page检测纯化的重组蛋白.
图2hplc-ms检测大肠杆菌工程菌产生的环-l-谷氨酸-l-亮氨酸
a:hplc-ms检测大肠杆菌工程菌合成产物(黑色：空载体pet28a；红色：pet28a+pfl_1389)；b:差异峰处的物质的m/z值.
图3ms2鉴定产物的结构
a:ms2分析纯化产物的裂解谱带；b:环-l-谷氨酸-l-亮氨酸的结构式(cyclo-l-glu-l-lue,cel)以及裂解部位.
图4环-l-谷氨酸-l-亮氨酸合成酶突变体合成产物的hplc-ms检测
a:四个保守性位点突变体的hplc-ms检测；b:其他三个位点突变体的hplc-ms检测.
具体实施方式
实施例1大肠杆菌表达环-l-谷氨酸-l-亮氨酸合成酶表达载体的构建以及重组蛋白的纯化.
以生防假单胞菌pf-5菌株(购自atcc，编号为atccbaa-477)的基因组为模板，引物cdps-fp(seqidno:3)和cdps-rp(seqidno:4)扩增环二肽合成酶编码基因(seqidno:1)，引物的两端分别引入ndei和hindiii酶切位点，回收pcr产物，再将pcr产物用ndei和hindiii双酶切后，克隆到pet28a(+)的相同的酶切位点，再转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，测序正确后，得到含有重组载体pet28/pfl_1389(图1a)的bl21(de3)工程菌株。
将上步构建的工程菌株接种到终浓度为50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养，当od600达到0.5左右时，加入终浓度为1mm的iptg诱导剂，在18℃条件下继续培养12小时后，离心收集菌体。得到的菌体用结合缓冲液(20mmol/lk2po4,500mmol/lnacl,and20mmol/limidazole,5％甘油，ph7.4)悬浮之后，用超声波进行破碎。然后，离心后的上清过histraphp柱，然后用含有10-500mm咪唑的洗脱液(20mmol/lk2po4,500mmol/lnacl,and10-500mmol/limidazole,5％甘油，ph7.4)进行浓度梯度洗脱，收集不同咪唑浓度洗脱液组份，利用sds-page进行检测。最后，利用分子筛柱子hiload16/60superdex200进一步纯化，将得到洗脱组份用sds-page进行检测(图1b)。
实施例2hplc-ms检测大肠杆菌工程菌产生的环-l-谷氨酸-l-亮氨酸
用终浓度为50μg/ml卡那霉素的lb培养基活化含有pet28/pfl_1389重组载体的bl21(de3)工程菌株，以转pet28空载体的大肠杆菌bl21(de3)(pet28)为对照。按照1％的接种量，转接到终浓度为50μg/ml卡那霉素的m9培养基中，37℃，200rpm培养，当od600达到0.5左右时，加入终浓度为1mm的iptg诱导剂，在18℃条件下继续培养36h，培养液在10000rpm下离心30min，上清用0.22μm水系滤膜过滤，滤液进行hplc-ms检测，检测波长为214nm。如图2a所示，红色的线为bl21(de3)(pet28/pfl_1389)，黑色的线为对照bl21(de3)(pet28)，由图可知差异峰值出现在26.5min时(图2a)，表明在工程菌株中出现了不同的物质。在该差异峰值下存在五种物质，其中m/z为243.1的物质是主要成份(图2b)。
实施例3ms2鉴定产物的结构
采用上述同样的方法用m9培养基发酵bl21(de3)(pet28/pfl_1389)工程菌株。利用乙酸乙酯对发酵上清进行萃取，用旋转蒸发仪蒸发掉溶剂，用80％的甲醇溶液溶解，再过0.22μm的滤膜，在利用制备级hplc进行纯化，使用的纯化柱为macherey-nagel公司的vp250/21nucleodurc18htec5μm，流动相a含0.1％三氟乙酸的去离子水，流动相b为含0.1％三氟乙酸的乙腈。纯化过程如下：0-2分钟，5％的流动相b；2-25分钟，50％的流动相b；25-35分钟，95％的流动相b；35-39分钟，5％的流动相b；39-45分钟，5％的流动相b.流速为16ml/min。将检测m/z为243.1的洗脱组份，先冷冻抽干，再称重，取少量样品，溶解到甲醇中，进行ms2检测。图3a物质的m/z为243.1的ms2图谱。根据环二肽的分子量数据库，结合ms2谱带推测该物质的结构式为环-l-谷氨酸-l-亮氨酸(cyclo-l-glu-l-lue,cel)。
实施例4环-l-谷氨酸-l-亮氨酸合成酶突变体合成产物的hplc-ms检测
本专利涉及环-l-谷氨酸-l-亮氨酸合成酶的7个突变体，分别是pfl_1389s32a、pfl_1389y170a、pfl_1389e174a、pfl_1389y192a、pfl_1389r85a、pfl_1389r93a和pfl_1389r102a。这些突变体的构建过程都相同。以突变体pfl_1389s32a的构建为例，以重组质粒pet28/pfl_1389的dna为模板，设计一对5'端邻接，3'端方向相反的引物seqidno.5和seqidno.6，并在引物的5’端加上磷酸基团。其中seqidno.5为变异导入引物，将丝氨酸(s)的编码密码子变为丙氨酸(a)编码密码子。pcr扩增反应所用的酶为pyrobestdnapolymerase，回收扩增产物用，并用dpni消化质粒模板，在65℃下处理10min，使内切酶失活。然后再纯化片段，对纯化片段连接反应，并转化大肠杆菌top10感受态细胞，挑取转化子测序正确后，将序列正确的质粒转入bl21(de3)感受态细胞，即得到相应能表达突变体的大肠杆菌工程菌。突变体在上述相同的条件下培养，采用同样，利用hplc-ms进行检测。y170a突变体构建引物为seqidno.7和seqidno.8；e174a引物为seqidno.9和seqidno.10；y192a引物为seqidno.11和seqidno.12；r85a的引物为seqidno.13和seqidno.14；r93a的引物为seqidno.15和seqidno.16；r102a的引物为seqidno.17和seqidno.18。图4a所示为pfl_1389s32a、pfl_1389y170a、pfl_1389e174a和pfl_1389y192a的检测，结果表明，这四个突变体都丧失合成产物的能力，这说明，这4个位点是该酶的活性位点。图4b为突变体pfl_1389r85a、pfl_1389r93a和pfl_1389r102a的检测结果，分析结果表明，突变体pfl_1389r102a的产物合成能力提高了20％。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一种环二肽合成酶及其应用
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