本发明属于生物工程领域，具体涉及一株新的可广谱裂解蜡样芽胞杆菌的噬菌体的裂解酶的制备，及其在防治病原蜡样芽胞杆菌中的应用。
背景技术：
蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus）广泛分布于各种环境中，包括灰尘、土壤及污水等环境中，也存在于昆虫及动物的肠道；另外，在植物性食品和许多生食和熟食中也较为常见（drobniewskifa:bacilluscereusandrelatedspecies.clinmicrobiolrev1993,6(4):324-338）。蜡样芽胞杆菌属于产芽孢的革兰氏阳性杆菌，芽孢由于具有抗逆性，因此可在经过高温处理、脱水干燥等食品杀菌的工艺中存活，是常见的食源性条件致病菌。蜡样芽胞杆菌可通过产生呕吐毒素和肠毒素从而导致人体食物中毒，偶见菌体感染导致其他疾病，例如菌血症、脑膜炎、和心内膜炎等。
一般来说，临床治疗通常采取青霉素、环丙沙星、左氧氟沙星等抗生素治疗芽孢杆菌导致的疾病。而随着抗生素的大量使用，导致病原菌对抗生素的耐药性逐渐加重，甚至出现大量的多重耐药菌（simmr,vorosa,ekmanjvetal:bc4707isamajorfacilitatorsuperfamilymultidrugresistancetransportproteinfrombacilluscereusimplicatedinfluoroquinolonetolerance.plosone2012,7(5)）。据报道，黄俊云等分离的蜡样芽胞杆菌临床分离株对青霉素的耐药率达到75%以上(黄俊云，邓晓:208例蜡样芽胞杆菌的分离及耐药性分析.现代预防医学2010,37(16):3140-3141.)。因此，使用新的病原菌防治手段显得尤为迫切。
噬菌体裂解酶是一种细胞壁水解酶，可特异性水解细菌的肽聚糖成分，导致细菌破裂。目前，日益增多的裂解酶已经被应用于治疗金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)（rashelm,uchiyamaj,ujiharat,ueharay,kuramotos,sugiharas,yagyuk,muraokaa,sugaim,hiramatsuketal:efficienteliminationofmultidrug-resistantstaphylococcusaureusbyclonedlysinderivedfrombacteriophagephimr11.thejournalofinfectiousdiseases2007,196(8):1237-1247）、化脓链球菌(streptococcuspyogenes)（nelsond,loomisl,fischettiva:preventionandeliminationofupperrespiratorycolonizationofmicebygroupastreptococcibyusingabacteriophagelyticenzyme.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica2001,98(7):4107-4112）和肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)等革兰氏阳性病原菌导致的疾病（loefflerjm,djurkovics,fischettiva:phagelyticenzymecpl-1asanovelantimicrobialforpneumococcalbacteremia.infectionandimmunity2003,71(11):6199-6204）。噬菌体裂解酶通常包括两个功能域，一个n端的催化功能域，负责肽聚糖的水解，以及一个c端的细胞壁识别功能域，负责对靶细菌特异性识别。因此，裂解酶可特异性的作用于一类细菌，而对其他细菌没有裂解效果，加之噬菌体可与细菌共同进化，从而使得细菌对噬菌体裂解酶较难产生耐药性，可使用裂解酶可避免细菌耐药性的产生。同时，裂解酶也可高效快速的裂解靶细菌，具有许多传统抗生素所无法比拟的优势。是一类具有极大应用潜力的微生物抗菌剂。
技术实现要素：
本发明着眼于上述问题，提供一种新型蜡样芽胞杆菌裂解酶及其制备方法，该裂解酶plyhse3对炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、蜡样芽胞杆菌(b.cereus)、苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)以及铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）具有显著的抑菌效果，表现出了极其广泛的裂解活性、较高的ph及温度耐受性，可在低于16°c的条件下发挥正常的裂解活性，因此本发明发现的裂解酶被认为具有极大的防治病原菌蜡样芽胞杆菌的应用潜力。
本发明中该裂解酶基因为噬菌体vb_bcem-hse3的基因gp100，其核苷酸序列如seqidno.1所示：
(atgggtttcaaaatgaagtatagtattaaacaagattatttaccttcaggttctttacgtagacctggtatccgtatgtcaaaagtagctcacgtagtagctcatgatacaggtaatcctggatcatctgcacagggtaacgtaaactactaccgtaattctgcttacgagatggaagcatcagctcagcttttcgttgatgacaagaacatcatcgagtgtattccagcattattgaatccacctgagaaagcttggcatgttcgttataactctcctaatgagaagaaatggtacggagcttctaatgatcaggctatcggagttgaattatgtttcggtggtagcatcaactttgaagaagcttataaacgttatctatgggtaatcgcttatatctgttacaagtatggattttctcctactagagtaatcggtcacgaaaagttagatccaggtcgtaaggtcgatcctagtgcaggtctacgagtaggtggacgtacttatgatcaactcatgagagatattgttgctgagtacaatgactgtactgacggttcttcttatgagccaccagctagtggaggtaatcaaggtggaggtaattcagctgatggatctattggtattgttcgtacgaaagttaacttgaacttccgtaaagagcctaatacatcatcagagattatcaagactttacctgctaacactgagtggatctgttgggctgagaaagatggttggtacaacttaggtggaggatgggtattcggtagctctgaatatgctactttcattagtaacggaacttcaactccgactccacccccagtaactccgccatcaggaggatctcaagcagtaactggagttgcttacattactgctgatgttcttaacgtacgtagtgagccttctactaatgcagcaatcgttaagaaagtatacaatggtgaatcttataaagtattcgctaagcaaggtgactggtacaatgttggtggtaatcaatggatctcagctaattatgttagattcgttccagatggaagctcagctcctgtgactggtactgcttacattaaagctgatgttcttaacgtacgtaaccgaccttctatggacggaacagtcgttaagaaagtctataatggtgaagcttataaagtatttgctaagagtggcgactggtattgtgtaggaggagaccagtggatttcagctaactctgagtatgttagattcgtatctaactaa)
其氨基酸序列如seqidno.2所示。
(mgfkmkysikqdylpsgslrrpgirmskvahvvahdtgnpgssaqgnvnyyrnsayemeasaqlfvddkniiecipallnppekawhvrynspnekkwygasndqaigvelcfggsinfeeaykrylwviayicykygfsptrvighekldpgrkvdpsaglrvggrtydqlmrdivaeyndctdgssyeppasggnqgggnsadgsigivrtkvnlnfrkepntsseiiktlpantewicwaekdgwynlgggwvfgsseyatfisngtstptpppvtppsggsqavtgvayitadvlnvrsepstnaaivkkvyngesykvfakqgdwynvggnqwisanyvrfvpdgssapvtgtayikadvlnvrnrpsmdgtvvkkvyngeaykvfaksgdwycvggdqwisanseyvrfvsn)
为了实现上述的目的，本发明的大概方案如下：
裂解酶plyhse3的编码基因gp100（seqidno.1所示），其编码产物gp100（seqidno.2所示）是一种n-乙酰胞壁酸-l-丙氨酸酰胺酶，该基因包含有1个酰胺酶结构域（催化肽聚糖的水解），2个sh3_3结构域（促进裂解酶与细胞壁的结合）（图1）。在ncbi数据库中与裂解酶plyhse3相似性最高的基因为噬菌体brevibacillusphagejenst的基因，其相似性仅为23.3%，故而，该裂解酶为一种新的裂解酶。在基因gp100的下游，基因gp102编码穿孔素蛋白，该蛋白具有在菌体细胞膜上形成孔洞的能力，可协助裂解酶顺利进入菌体细胞壁以裂解宿主细胞使其释放出病毒粒子。通过构建裂解酶plyhse3的表达菌株bl21/pet28a-gp100，在大肠杆菌中可溶性表达并纯化了裂解酶plyhse3，并测定了其裂解活性（图2）。结果显示0.1um的plyhse3蛋白即可将指示菌蜡样芽孢杆菌6113高效裂解。随着蛋白浓度的增高，裂解效率也逐渐增高。但当蛋白浓度超过0.5um后，增加蛋白浓度对于裂解效率的提高效果并不显著（图3）。因此，在后续研究中，采用0.5um浓度plyhse3蛋白进行后续裂解谱和稳定性研究。
经研究发现，plyhse3蛋白具有广泛的裂解谱，可裂解测试菌株中所有蜡样芽胞杆菌菌群细菌，包括两株炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、七株蜡样芽胞杆菌(b.cereus)和七株苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)，然而plyhse3蛋白并不能裂解测试菌株中其他革兰氏阳性细菌，包括枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bgsc1a1、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)gr8和临床分离株金黄色葡萄球菌(s.aureus)60501（图4）。相对于革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌由于有外膜成分，会阻碍裂解酶从外部裂解细菌。在本研究中，通过在裂解酶反应体系中加入edta提高外膜的通透性，plyhse3可裂解革兰氏阴性菌绿脓假单胞菌(pseudomonasaerugonisa)菌株pao1和临床分离株6312（图4）；plyhse3可在15min内高效完成对绿脓假单胞菌的裂解，但该反应是在加入plyhse3蛋白后会延迟10min发生，其原因可能为在该10分钟内，edta增加了绿脓假单胞菌外膜的通透性；但该裂解酶在添加edta的情况下仍不能裂解所测试的其他革兰氏阴性测试菌，如大肠杆菌(escherichiacoli),假结核耶尔森菌(yersiniapseudotuberculosis)和鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumannii)。
对裂解酶plyhse3的温度耐受性研究发现，将plyhse3在低于37°c的温度下处理1h，裂解活性无显著改变；在45°c处理1h，仍能保留初始活性的77.6%；而在55°c处理1h，可观察到大量蛋白质发生变性，裂解活性显著降低（图5）。对plyhse3的最适反应温度分析发现，plyhse3的最适反应温度为37°c；在45°c的反应温度下，裂解酶可达到最大反应活性的的54.8%（图6）；plyhse3在4°c和16°c的反应条件下对蜡样芽胞杆菌6113也具有较高的裂解活力，分别为最大裂解活性的35.9%和59.6%。plyhse3的最适反应ph为ph8.0,在ph5.0到ph9.0的范围内，plyhse3均对蜡样芽胞杆菌6113表现出高效裂解活力（图7）。
附图说明
图1为裂解酶plyhse3的生物信息学分析。
图2为裂解酶plyhse3的蛋白质纯度分析。
图3为裂解酶plyhse3的裂解活性与使用浓度关系分析。
图4为裂解酶plyhse3的裂解谱。
图5为裂解酶plyhse3的温度耐受性分析。
图6为裂解酶plyhse3的最适反应温度。
图7为裂解酶plyhse3的最适反应ph。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
裂解酶plyhse3的制备
以蜡样芽孢杆菌噬菌体vb_bcem-hse3（cctccm2017798）的dna为模板，设计引物对gp100-for/bamh
裂解酶plyhse3的生物学特性测定
1)裂解酶plyhse3的裂解活性和裂解谱
为了探究裂解酶plyhse3的裂解活性，对数生长期的蜡样芽胞杆菌6113（cctccm2017798）经过离心收集并使用缓冲液a洗涤两次后，加入上述制备的plyhse3至终浓度分别为0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5µm，使用酶标仪（bioteksyergy，biotek，vermont，usa）并进行震荡培养，每隔1min取样检测其吸光度od600。
裂解酶plyhse3裂解谱测定所使用的菌株见表1，裂解谱测定方法如下：将终浓度为0.5µm的plyhse3加入革兰氏阳性细菌培养液中混匀，震荡培养，每隔1min检测其吸光度od600。测定plyhse3蛋白对革兰氏阴性菌裂解活性时，需要向混悬液中另加入终浓度为50mm的乙二胺四乙酸（edta），其他方法同上。
裂解酶plyhse3的温度耐受性和最佳反应条件
为了测定plyhse3蛋白的温度稳定性，该酶分别在4°c、16°c、28°c、37°c、45°c、55°c和65°c条件下处理30分钟，随后向指数生长期的蜡样芽胞杆菌6113培养液中加入处理后的酶使其终浓度为0.5µm，检测反应1h后混悬液的吸光度od600。测定plyhse3蛋白的最佳反应温度方法如下：收集指数生长期的蜡样芽孢杆菌6113，重悬于反应液(50mmtris-cl,300mmnacl,10%甘油，ph8.0)中，加入处理后终浓度为0.5um的plyhse3并混匀，将混悬液分别置于4°c、16°c、28°c、37°c、45°c、55°c和65°c条件下反应1h，检测反应后混悬液od600的变化情况。
测定plyhse3蛋白的最佳反应ph，方法同检测裂解酶的最佳反应温度，裂解酶和蜡样芽胞杆菌6113分别置于不同ph缓冲液条件下处理1h，缓冲液配制方法同上述噬菌体ph稳定性测定缓冲液配制。
表1噬菌体vb_bcem-hse3和裂解酶plyhse3的裂解谱
续表1噬菌体vb_bcem-hse3和裂解酶plyhse3的裂解谱
aatcc,americantypeculturecollection;bgsc,bacillusgeneticstorecenter。
序列表
<110>海南师范大学
海南大学
<120>一种蜡样芽孢杆菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>3
<211>1257
<212>dna
<213>bacilluscereusphage
<400>3
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