一种蜡样芽孢杆菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用与流程

文档序号:15457430发布日期:2018-09-15 01:29

本发明属于生物工程领域,具体涉及一株新的可广谱裂解蜡样芽胞杆菌的噬菌体的裂解酶的制备,及其在防治病原蜡样芽胞杆菌中的应用。



背景技术:

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)广泛分布于各种环境中,包括灰尘、土壤及污水等环境中,也存在于昆虫及动物的肠道;另外,在植物性食品和许多生食和熟食中也较为常见(Drobniewski FA: Bacillus cereus and related species. Clin Microbiol Rev 1993, 6(4):324-338)。蜡样芽胞杆菌属于产芽孢的革兰氏阳性杆菌,芽孢由于具有抗逆性,因此可在经过高温处理、脱水干燥等食品杀菌的工艺中存活,是常见的食源性条件致病菌。蜡样芽胞杆菌可通过产生呕吐毒素和肠毒素从而导致人体食物中毒,偶见菌体感染导致其他疾病,例如菌血症、脑膜炎、和心内膜炎等。

一般来说,临床治疗通常采取青霉素、环丙沙星、左氧氟沙星等抗生素治疗芽孢杆菌导致的疾病。而随着抗生素的大量使用,导致病原菌对抗生素的耐药性逐渐加重,甚至出现大量的多重耐药菌(Simm R, Voros A, Ekman JV et al: BC4707 Is a major facilitator superfamily multidrug resistance transport protein from Bacillus cereus implicated in fluoroquinolone tolerance. Plos One 2012, 7(5))。据报道,黄俊云等分离的蜡样芽胞杆菌临床分离株对青霉素的耐药率达到75%以上 (黄俊云,邓晓: 208例蜡样芽胞杆菌的分离及耐药性分析. 现代预防医学 2010, 37(16):3140-3141.)。因此,使用新的病原菌防治手段显得尤为迫切。

噬菌体裂解酶是一种细胞壁水解酶,可特异性水解细菌的肽聚糖成分,导致细菌破裂。目前,日益增多的裂解酶已经被应用于治疗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Rashel M, Uchiyama J, Ujihara T, Uehara Y, Kuramoto S, Sugihara S, Yagyu K, Muraoka A, Sugai M, Hiramatsu Ket al: Efficient elimination of multidrug-resistant Staphylococcus aureus by cloned lysin derived from bacteriophage phi MR11. The Journal of infectious diseases 2007, 196(8):1237-1247)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(Nelson D, Loomis L, Fischetti VA: Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001, 98(7):4107-4112)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)等革兰氏阳性病原菌导致的疾病(Loeffler JM, Djurkovic S, Fischetti VA: Phage lytic enzyme Cpl-1 as a novel antimicrobial for pneumococcal bacteremia. Infection and immunity 2003, 71(11):6199-6204)。噬菌体裂解酶通常包括两个功能域,一个N端的催化功能域,负责肽聚糖的水解,以及一个C端的细胞壁识别功能域,负责对靶细菌特异性识别。因此,裂解酶可特异性的作用于一类细菌,而对其他细菌没有裂解效果,加之噬菌体可与细菌共同进化,从而使得细菌对噬菌体裂解酶较难产生耐药性,可使用裂解酶可避免细菌耐药性的产生。同时,裂解酶也可高效快速的裂解靶细菌,具有许多传统抗生素所无法比拟的优势。是一类具有极大应用潜力的微生物抗菌剂。



技术实现要素:

本发明着眼于上述问题,提供一种新型蜡样芽胞杆菌裂解酶及其制备方法,该裂解酶PlyHSE3对炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌 (B. cereus)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)以及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有显著的抑菌效果,表现出了极其广泛的裂解活性、较高的pH及温度耐受性,可在低于16 °C的条件下发挥正常的裂解活性,因此本发明发现的裂解酶被认为具有极大的防治病原菌蜡样芽胞杆菌的应用潜力。

本发明中该裂解酶基因为噬菌体vB_BceM-HSE3的基因gp100,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示:

(ATGGGTTTCAAAATGAAGTATAGTATTAAACAAGATTATTTACCTTCAGGTTCTTTACGTAGACCTGGTATCCGTATGTCAAAAGTAGCTCACGTAGTAGCTCATGATACAGGTAATCCTGGATCATCTGCACAGGGTAACGTAAACTACTACCGTAATTCTGCTTACGAGATGGAAGCATCAGCTCAGCTTTTCGTTGATGACAAGAACATCATCGAGTGTATTCCAGCATTATTGAATCCACCTGAGAAAGCTTGGCATGTTCGTTATAACTCTCCTAATGAGAAGAAATGGTACGGAGCTTCTAATGATCAGGCTATCGGAGTTGAATTATGTTTCGGTGGTAGCATCAACTTTGAAGAAGCTTATAAACGTTATCTATGGGTAATCGCTTATATCTGTTACAAGTATGGATTTTCTCCTACTAGAGTAATCGGTCACGAAAAGTTAGATCCAGGTCGTAAGGTCGATCCTAGTGCAGGTCTACGAGTAGGTGGACGTACTTATGATCAACTCATGAGAGATATTGTTGCTGAGTACAATGACTGTACTGACGGTTCTTCTTATGAGCCACCAGCTAGTGGAGGTAATCAAGGTGGAGGTAATTCAGCTGATGGATCTATTGGTATTGTTCGTACGAAAGTTAACTTGAACTTCCGTAAAGAGCCTAATACATCATCAGAGATTATCAAGACTTTACCTGCTAACACTGAGTGGATCTGTTGGGCTGAGAAAGATGGTTGGTACAACTTAGGTGGAGGATGGGTATTCGGTAGCTCTGAATATGCTACTTTCATTAGTAACGGAACTTCAACTCCGACTCCACCCCCAGTAACTCCGCCATCAGGAGGATCTCAAGCAGTAACTGGAGTTGCTTACATTACTGCTGATGTTCTTAACGTACGTAGTGAGCCTTCTACTAATGCAGCAATCGTTAAGAAAGTATACAATGGTGAATCTTATAAAGTATTCGCTAAGCAAGGTGACTGGTACAATGTTGGTGGTAATCAATGGATCTCAGCTAATTATGTTAGATTCGTTCCAGATGGAAGCTCAGCTCCTGTGACTGGTACTGCTTACATTAAAGCTGATGTTCTTAACGTACGTAACCGACCTTCTATGGACGGAACAGTCGTTAAGAAAGTCTATAATGGTGAAGCTTATAAAGTATTTGCTAAGAGTGGCGACTGGTATTGTGTAGGAGGAGACCAGTGGATTTCAGCTAACTCTGAGTATGTTAGATTCGTATCTAACTAA)

其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

(MGFKMKYSIKQDYLPSGSLRRPGIRMSKVAHVVAHDTGNPGSSAQGNVNYYRNSAYEMEASAQLFVDDKNIIECIPALLNPPEKAWHVRYNSPNEKKWYGASNDQAIGVELCFGGSINFEEAYKRYLWVIAYICYKYGFSPTRVIGHEKLDPGRKVDPSAGLRVGGRTYDQLMRDIVAEYNDCTDGSSYEPPASGGNQGGGNSADGSIGIVRTKVNLNFRKEPNTSSEIIKTLPANTEWICWAEKDGWYNLGGGWVFGSSEYATFISNGTSTPTPPPVTPPSGGSQAVTGVAYITADVLNVRSEPSTNAAIVKKVYNGESYKVFAKQGDWYNVGGNQWISANYVRFVPDGSSAPVTGTAYIKADVLNVRNRPSMDGTVVKKVYNGEAYKVFAKSGDWYCVGGDQWISANSEYVRFVSN)

为了实现上述的目的,本发明的大概方案如下:

裂解酶PlyHSE3的编码基因gp100(SEQ ID NO. 1所示),其编码产物Gp100(SEQ ID NO. 2所示)是一种N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶,该基因包含有1个酰胺酶结构域(催化肽聚糖的水解),2个SH3_3结构域(促进裂解酶与细胞壁的结合)(图1)。在NCBI数据库中与裂解酶PlyHSE3相似性最高的基因为噬菌体Brevibacillus phage Jenst的基因,其相似性仅为23.3%,故而,该裂解酶为一种新的裂解酶。在基因gp100的下游,基因gp102编码穿孔素蛋白,该蛋白具有在菌体细胞膜上形成孔洞的能力,可协助裂解酶顺利进入菌体细胞壁以裂解宿主细胞使其释放出病毒粒子。通过构建裂解酶PlyHSE3的表达菌株BL21/pET28a-gp100,在大肠杆菌中可溶性表达并纯化了裂解酶PlyHSE3,并测定了其裂解活性(图2)。结果显示0.1uM 的PlyHSE3蛋白即可将指示菌蜡样芽孢杆菌6113高效裂解。随着蛋白浓度的增高,裂解效率也逐渐增高。但当蛋白浓度超过0.5uM后,增加蛋白浓度对于裂解效率的提高效果并不显著(图3)。因此,在后续研究中,采用0.5uM浓度 PlyHSE3蛋白进行后续裂解谱和稳定性研究。

经研究发现,PlyHSE3蛋白具有广泛的裂解谱,可裂解测试菌株中所有蜡样芽胞杆菌菌群细菌,包括两株炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、七株蜡样芽胞杆菌 (B. cereus)和七株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis),然而PlyHSE3蛋白并不能裂解测试菌株中其他革兰氏阳性细菌,包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BGSC 1A1、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)GR8和临床分离株金黄色葡萄球菌(S. aureus)60501(图4)。相对于革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌由于有外膜成分,会阻碍裂解酶从外部裂解细菌。在本研究中,通过在裂解酶反应体系中加入EDTA提高外膜的通透性,PlyHSE3可裂解革兰氏阴性菌绿脓假单胞菌(Pseudomonas aerugonisa)菌株PAO1和临床分离株6312(图4);PlyHSE3可在15min内高效完成对绿脓假单胞菌的裂解,但该反应是在加入PlyHSE3蛋白后会延迟10min发生,其原因可能为在该10分钟内,EDTA增加了绿脓假单胞菌外膜的通透性;但该裂解酶在添加EDTA的情况下仍不能裂解所测试的其他革兰氏阴性测试菌,如大肠杆菌(Escherichia coli), 假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)。

对裂解酶PlyHSE3的温度耐受性研究发现,将PlyHSE3在低于37 °C的温度下处理1h,裂解活性无显著改变;在45 °C处理1h,仍能保留初始活性的77.6%;而在55 °C处理1h,可观察到大量蛋白质发生变性,裂解活性显著降低(图5)。对PlyHSE3的最适反应温度分析发现,PlyHSE3的最适反应温度为37 °C;在45°C的反应温度下,裂解酶可达到最大反应活性的的54.8 %(图6);PlyHSE3在4°C和16°C的反应条件下对蜡样芽胞杆菌6113也具有较高的裂解活力,分别为最大裂解活性的35.9 % 和59.6 %。PlyHSE3的最适反应pH为pH8.0,在pH 5.0到pH 9.0的范围内,PlyHSE3均对蜡样芽胞杆菌6113表现出高效裂解活力(图7)。

附图说明

图1为裂解酶PlyHSE3的生物信息学分析。

图2为裂解酶PlyHSE3的蛋白质纯度分析。

图3为裂解酶PlyHSE3的裂解活性与使用浓度关系分析。

图4为裂解酶PlyHSE3的裂解谱。

图5为裂解酶PlyHSE3的温度耐受性分析。

图6为裂解酶PlyHSE3的最适反应温度。

图7为裂解酶PlyHSE3的最适反应pH。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解,下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则,本发明的实施方式不限于以下内容。

裂解酶PlyHSE3的制备

以蜡样芽孢杆菌噬菌体vB_BceM-HSE3(CCTCC M 2017798)的DNA为模板,设计引物对Gp100-For/BamH (5’-GCGGATCCATGGGTTTCAAAATGAA-3’) 和Gp100-Rev/Sal (5’- GAGTCGACTTAGTTAGATACGAATC-3’)进行基因 gp100扩增。将扩增基因gp100和载体pET28a分别使用限制性内切酶BamHI和SalI进行酶切后利用T4连接酶进行连接,构建重组质粒pET28a-gp100,随后转化导入大肠杆菌BL-21(F dcm ompT hsdSB(rB mB ) gal (DE3) )构建重组大肠杆菌BL21/pET28a-gp100。重组大肠杆菌接种于含有卡那霉素(kanamycin,34µg/mL)的LB液体培养基于37°C条件培养到指数生长期,加入0.4 mM异丙基-B-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导蛋白表达,表达蛋白利用镍氮三乙酸层析(Ni-NTA columns; Qiagen, Dusseldorf, Germany)进行纯化。然后将蛋白质透析置换到新的缓冲液A中,缓冲液A配方如下:50 mM Tris,300 mM NaCl,10% 甘油,1 mM巯基乙醇,pH 8.0,于-20 °C留存备用。

裂解酶PlyHSE3的生物学特性测定

1)裂解酶PlyHSE3的裂解活性和裂解谱

为了探究裂解酶PlyHSE3的裂解活性,对数生长期的蜡样芽胞杆菌6113(CCTCC M 2017798)经过离心收集并使用缓冲液A洗涤两次后,加入上述制备的PlyHSE3至终浓度分别为0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 µM,使用酶标仪(BioTek Syergy,Biotek,Vermont,USA)并进行震荡培养,每隔1min取样检测其吸光度OD600。

裂解酶PlyHSE3裂解谱测定所使用的菌株见表1,裂解谱测定方法如下:将终浓度为0.5µM的PlyHSE3加入革兰氏阳性细菌培养液中混匀,震荡培养,每隔1min检测其吸光度OD600。测定PlyHSE3蛋白对革兰氏阴性菌裂解活性时,需要向混悬液中另加入终浓度为50 mM的乙二胺四乙酸(EDTA),其他方法同上。

裂解酶PlyHSE3的温度耐受性和最佳反应条件

为了测定PlyHSE3蛋白的温度稳定性,该酶分别在4 °C、16 °C、28 °C、37 °C、45 °C、55 °C和65 °C 条件下处理30分钟,随后向指数生长期的蜡样芽胞杆菌6113培养液中加入处理后的酶使其终浓度为0.5µM,检测反应1h后混悬液的吸光度OD600。测定PlyHSE3蛋白的最佳反应温度方法如下:收集指数生长期的蜡样芽孢杆菌6113,重悬于反应液(50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 10% 甘油,pH 8.0)中,加入处理后终浓度为0.5uM的PlyHSE3并混匀,将混悬液分别置于4 °C、16 °C、28 °C、37 °C、45 °C、55 °C和65 °C 条件下反应1h,检测反应后混悬液OD600的变化情况。

测定PlyHSE3蛋白的最佳反应pH,方法同检测裂解酶的最佳反应温度,裂解酶和蜡样芽胞杆菌6113分别置于不同pH缓冲液条件下处理1h,缓冲液配制方法同上述噬菌体pH稳定性测定缓冲液配制。

表1 噬菌体vB_BceM-HSE3和裂解酶PlyHSE3的裂解谱

续表1 噬菌体vB_BceM-HSE3和裂解酶PlyHSE3的裂解谱

aATCC, American Type Culture Collection; BGSC, Bacillus Genetic Store Center。

序列表

<110> 海南师范大学

海南大学

<120> 一种蜡样芽孢杆菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 1257

<212> DNA

<213> Bacillus cereus phage

<400> 3

atgggtttca aaatgaagta tagtattaaa caagattatt taccttcagg ttctttacgt 60

agacctggta tccgtatgtc aaaagtagct cacgtagtag ctcatgatac aggtaatcct 120

ggatcatctg cacagggtaa cgtaaactac taccgtaatt ctgcttacga gatggaagca 180

tcagctcagc ttttcgttga tgacaagaac atcatcgagt gtattccagc attattgaat 240

ccacctgaga aagcttggca tgttcgttat aactctccta atgagaagaa atggtacgga 300

gcttctaatg atcaggctat cggagttgaa ttatgtttcg gtggtagcat caactttgaa 360

gaagcttata aacgttatct atgggtaatc gcttatatct gttacaagta tggattttct 420

cctactagag taatcggtca cgaaaagtta gatccaggtc gtaaggtcga tcctagtgca 480

ggtctacgag taggtggacg tacttatgat caactcatga gagatattgt tgctgagtac 540

aatgactgta ctgacggttc ttcttatgag ccaccagcta gtggaggtaa tcaaggtgga 600

ggtaattcag ctgatggatc tattggtatt gttcgtacga aagttaactt gaacttccgt 660

aaagagccta atacatcatc agagattatc aagactttac ctgctaacac tgagtggatc 720

tgttgggctg agaaagatgg ttggtacaac ttaggtggag gatgggtatt cggtagctct 780

gaatatgcta ctttcattag taacggaact tcaactccga ctccaccccc agtaactccg 840

ccatcaggag gatctcaagc agtaactgga gttgcttaca ttactgctga tgttcttaac 900

gtacgtagtg agccttctac taatgcagca atcgttaaga aagtatacaa tggtgaatct 960

tataaagtat tcgctaagca aggtgactgg tacaatgttg gtggtaatca atggatctca 1020

gctaattatg ttagattcgt tccagatgga agctcagctc ctgtgactgg tactgcttac 1080

attaaagctg atgttcttaa cgtacgtaac cgaccttcta tggacggaac agtcgttaag 1140

aaagtctata atggtgaagc ttataaagta tttgctaaga gtggcgactg gtattgtgta 1200

ggaggagacc agtggatttc agctaactct gagtatgtta gattcgtatc taactaa 1257

<210> 4

<211> 418

<212> PRT

<213> Bacillus cereus phage

<400> 4

Met Gly Phe Lys Met Lys Tyr Ser Ile Lys Gln Asp Tyr Leu Pro Ser

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Arg Pro Gly Ile Arg Met Ser Lys Val Ala His Val

20 25 30

Val Ala His Asp Thr Gly Asn Pro Gly Ser Ser Ala Gln Gly Asn Val

35 40 45

Asn Tyr Tyr Arg Asn Ser Ala Tyr Glu Met Glu Ala Ser Ala Gln Leu

50 55 60

Phe Val Asp Asp Lys Asn Ile Ile Glu Cys Ile Pro Ala Leu Leu Asn

65 70 75 80

Pro Pro Glu Lys Ala Trp His Val Arg Tyr Asn Ser Pro Asn Glu Lys

85 90 95

Lys Trp Tyr Gly Ala Ser Asn Asp Gln Ala Ile Gly Val Glu Leu Cys

100 105 110

Phe Gly Gly Ser Ile Asn Phe Glu Glu Ala Tyr Lys Arg Tyr Leu Trp

115 120 125

Val Ile Ala Tyr Ile Cys Tyr Lys Tyr Gly Phe Ser Pro Thr Arg Val

130 135 140

Ile Gly His Glu Lys Leu Asp Pro Gly Arg Lys Val Asp Pro Ser Ala

145 150 155 160

Gly Leu Arg Val Gly Gly Arg Thr Tyr Asp Gln Leu Met Arg Asp Ile

165 170 175

Val Ala Glu Tyr Asn Asp Cys Thr Asp Gly Ser Ser Tyr Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ser Gly Gly Asn Gln Gly Gly Gly Asn Ser Ala Asp Gly Ser Ile

195 200 205

Gly Ile Val Arg Thr Lys Val Asn Leu Asn Phe Arg Lys Glu Pro Asn

210 215 220

Thr Ser Ser Glu Ile Ile Lys Thr Leu Pro Ala Asn Thr Glu Trp Ile

225 230 235 240

Cys Trp Ala Glu Lys Asp Gly Trp Tyr Asn Leu Gly Gly Gly Trp Val

245 250 255

Phe Gly Ser Ser Glu Tyr Ala Thr Phe Ile Ser Asn Gly Thr Ser Thr

260 265 270

Pro Thr Pro Pro Pro Val Thr Pro Pro Ser Gly Gly Ser Gln Ala Val

275 280 285

Thr Gly Val Ala Tyr Ile Thr Ala Asp Val Leu Asn Val Arg Ser Glu

290 295 300

Pro Ser Thr Asn Ala Ala Ile Val Lys Lys Val Tyr Asn Gly Glu Ser

305 310 315 320

Tyr Lys Val Phe Ala Lys Gln Gly Asp Trp Tyr Asn Val Gly Gly Asn

325 330 335

Gln Trp Ile Ser Ala Asn Tyr Val Arg Phe Val Pro Asp Gly Ser Ser

340 345 350

Ala Pro Val Thr Gly Thr Ala Tyr Ile Lys Ala Asp Val Leu Asn Val

355 360 365

Arg Asn Arg Pro Ser Met Asp Gly Thr Val Val Lys Lys Val Tyr Asn

370 375 380

Gly Glu Ala Tyr Lys Val Phe Ala Lys Ser Gly Asp Trp Tyr Cys Val

385 390 395 400

Gly Gly Asp Gln Trp Ile Ser Ala Asn Ser Glu Tyr Val Arg Phe Val

405 410 415

Ser Asn

再多了解一些
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