本发明涉及一种植物甾醇酯的制备方法，特别涉及到一种简单、高效无污染合成高纯度植物甾醇酯的方法，属于食品、医药和化妆品等技术领域。
背景技术：
植物甾醇是一类以环戊烷全氢菲为骨架(又称甾核)为骨架的天然醇类化合物。在自然界中分布非常广，而且本身无毒性，而且具有乳化性和稳定性等特性。它由三个六元环和一个五元环组成，c-3位连有一个羟基，c-17位连有8-10个碳原子构成的侧链。多数植物甾醇c-5位为双键，c-5上有双键的称甾醇，c-5饱和的称甾烷醇，植物甾醇的这种结构特点决定了它的多方面的生理特性及其广泛用途。常见植物甾醇是β-谷甾醇(β-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、菜油甾醇(campesterol)和菜籽甾醇(brassicasterol)等。
人们对植物甾醇生理功能的认识始于上个世纪50年代，随后的几十年间，人们对植物甾醇及植物甾醇酯的生理功能的研究越来越多，逐步认识了植物甾醇及甾醇酯除了能降低血液胆固醇浓度功效外，还具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、美容等多种生理功能。
游离植物甾醇的油溶性和水溶性均很差，若人体直接摄取则难以被吸收，这是植物酱醇难以被广泛应用的最大因素。为了不改变植物甾醇的结构，保证其生物功效，如今主要是把植物甾醇酯化，转化为植物甾醇酯来增大它的溶解度扩大它使用的范围。有研究表明，植物甾醇酯相比较于植物甾醇，大大提高在脂类食物中的溶解度，能增加20％-40％的生物利用率，有利于吸收和利用。
植物甾醇脂肪酸酯是由植物甾醇和脂肪酸酯化合成，其脂溶性以及生物利用性更优于游离的植物甾醇。植物甾醇酯被人体吸收后，在体内酶的水解作用下转化成植物甾醇和脂肪酸，因此，植物甾醇酯具有植物甾醇和脂肪酸两方面的功效。
目前，植物甾醇酯的合成方法主要有酶法和化学法。化学法往往采用重金属或强碱性物质作为反应催化剂，且反应过程需要高温等苛刻条件，同时可能产生不期望的副产物；酶法生产植物甾醇酯，条件温和，通常在常温常压下进行，因此脂肪酸和植物甾醇酯产品不易发生氧化。同时，由于酶的催化专一性，不会产生有害副产物，使用安全。酶法酯化目前主要有溶剂法和无溶剂法两种方式，由于酯化反应是可逆过程，反应中需要除去生产的水，才能促进反应向甾醇酯的方向反应。因此溶剂法一般需在底物中分子筛脱水，或者构建膜脱水体系，除去反应生成的水，才能提高转化率，降低酶法酯化的成本。无溶剂法则一般通过抽真空，脱除反应生成的水。
中国专利cn103509076a公开了以二氧化硅为催化剂合成脂肪酸植物甾醇酯的方法，该方法在纯化时是在密闭容器中在高温抽真空条件下除去低沸点物质的，在这种条件下因蒸发面积小，且加热时间长，可能出现受热不均匀、局部碳化等问题；另外，该方法还采用了分子蒸馏纯化方法，最终得到的重相为甾醇酯产品，该方法得到的植物甾醇酯并不能除去一些分子量大于植物甾醇酯的脂溶性杂质及加热过程中产生的少量碳化物质，因此产品的色泽和纯度较差。
美国专利us6184397公开了一种以脂肪酸和植物甾醇酯化合成甾醇酯的方法。该方法以氧化锌或者路易斯酸为催化剂，反应温度在100-220℃，反应时间8-15小时，反应时间较长，反应完成后需要脱色，最终纯度约为90％以上。
中国专利cn1982326公开了一种多不饱和脂肪酸植物甾醇酯的制备方法。该法使用常见的酸碱催化剂，虽然没有使用有毒有害的有机溶剂，但是步骤繁琐，需要高温和真空等苛刻条件。
中国专利cn101200754描述了一种在无溶剂体系中利用固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法。该方法反应条件温和且无需添加有机溶剂。但无溶剂体系中反应介质粘度大，传质效率低，导致酶催化效率低，用量大，转化率低，反应时间长，成本高等缺点，难以工业化生产。
中国专利cn102618615b，cn103352067b及cn106755254a公开的非水相酶法制备植物甾醇酯的工艺中均需要添加分子筛除水，同样，吸水后的分子筛再生困难，工业化成本高，不具有竞争力。
总的来说，化学法酯化往往采用重金属或强碱性物质作为反应催化剂，且反应过程需要苛刻条件，同时可能产生不期望的副产物，且很多在高温高压下进行，产品颜色较深，生产成本高，不易工业化生产。而传统的无溶剂酶法酯化，由于体系粘度高，传质效率低，反应后生物酶，稳定性差，催化效率下降较快，导致生产成本高，难以适应工业化生产。而有机溶剂非水相酶法酯化虽然酯化效率高，酶稳定性好，能够长时间重复利用，但反应需要添加分子筛等除水剂，或者构建膜脱水体系，同样导致成本居高不下。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前植物甾醇酯合成工艺中存在的催化剂效率低，操作条件苛刻等缺点而开发的一种高效合成植物甾醇酯的方法。
一种酶法制备植物甾醇酯的方法，其特征在于包含以下步骤：1)将脂肪酸、植物甾醇、生物酶催化剂和有机溶剂一起加入反应器中进行酯化反应；2)反应结束后，过滤回收生物酶催化剂，酶可以重复利用于下批反应；3)滤液添加脱色剂60-70℃搅拌20-30分钟脱色，再过滤除去脱色剂，先减压蒸馏回收溶剂，然后分子蒸馏去除未反应的脂肪酸，最后得到乳白色，纯度为90％以上的植物甾醇酯；
步骤(1)中所述的有机溶剂需满足以下条件：ⅰ.所述的有机溶剂易溶解植物甾醇及游离脂肪酸，ⅱ.所述有机溶剂能与水形成共费混合物，共沸点在30-90℃之间，ⅲ.所述的有机溶剂冷凝回流后在分水器中易与水形成互不相溶的两相；
步骤1)中生物酶催化剂特指固定化脂肪酶，添加量为植物甾醇质量的2-10％；
步骤3)中所述分子蒸馏包括至少2级分子蒸馏，并收集经历第二级分子蒸馏所得的轻相。
步骤1)中所述的脂肪酸是饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸按任意比例的混合物，所述的饱和脂肪酸是硬脂酸、辛酸、己酸、月桂酸、棕榈酸中的任意一种或两种以上任意比例的混合物，不饱和脂肪酸是油酸、亚油酸、共轭亚油酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸中的任意一种或两种以上任意比例的混合物。
步骤1)中所述的植物甾醇为菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇中的任意一种或两种以上以任意比例的混合物。
步骤1)中植物甾醇与脂肪酸摩尔比为1:2-6之间，植物甾醇与有机溶剂的质量比为1:0.5-3之间。
一种植物甾醇酯的制备方法，其特征在于：步骤1)中有机溶剂为环己烷、二氯甲烷、甲苯及氯仿中的一种。
一种植物甾醇酯的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述脂肪酶为来源于根霉、假丝酵母、黑曲霉中一种或多种。
步骤1)中所述的反应器为带有回流分水装置的三口烧瓶。
步骤1)中所述的酯化反应具体为加热至35-70℃，恒温冷凝回流反应，期间分水若干次，以植物甾醇含量≤0.5％为终点。
一种植物甾醇酯的制备方法，其特征在于：步骤3)中所述脱色过程中脱色剂为白土、活性炭中的一种或者两种的混合物，添加量为植物甾醇酯质量的1-10％。
步骤3)中所述分子蒸馏包括3级分子蒸馏，且将第3级分子蒸馏所得的轻相—脂肪酸套用只下批的步骤1)中；第1级分子蒸馏条件为：真空度0-1000pa，温度50-100℃，刮膜转速为100-300rpm；第2级分子蒸馏条件为：真空度0-100pa，温度100-150℃，刮膜转速为100-300rpm；第3级分子蒸馏条件为：真空度0-10pa，温度150-180℃，刮膜转速为
100-300rpm。
本发明所述的一种酶法制备植物甾醇酯的方法，其有益效果是：
(1)本发明酶法酯化工艺简单，不需要复杂设备，对设备无特殊要求，适合大规模工业生产；
(2)利用有机溶剂酶法酯化，一方面降低体系粘度，保证酶在非水相体系中传质效率，提高酶的稳定性，同时能大幅度延长酶的催化活性，降低生产成本，另一方面利用有机溶剂的带水作用，除去体系中不断生成的水，提高酯化率；
(3)产品安全性高，采用酶催化合成植物甾醇酯，过程中反应物和产物不易发生氧化变性。由于酶的催化专一性、副产物少、产品安全性高，特别适合应用于食品、医药和化妆品等对安全性要求较高的领域。
具体实施方式
为详细说明本发明之技术内容、构造特征、所达成目的及功效，以下兹例举实施例并详予说明。
实施例1
将植物甾醇100.0g(含菜籽甾醇4.0％、菜油甾醇25.7％、豆甾醇21.3％、β-谷甾醇46.5％的混合甾醇，混合甾醇的纯度为97.5％，购至于西安海斯夫生物科技有限公司)、脂肪酸200.0g(脂肪酸为油酸脂肪酸，油酸含量80.6％、购自嘉里精细化学工业(上海)有限公司)，100ml环己烷加入带有回流分水装置的三口烧瓶中，待植物甾醇和脂肪酸全部溶解后，加入10g固定化脂肪酶(来源于根霉)，加热至65℃，恒温冷凝回流反应，期间分水若干次，以植物甾醇含量≤0.5％为终点；反应终点后，过滤回收固定化脂肪酶，滤液加入5g白土，70℃搅拌30分钟，过滤去除白土，滤液先减压回收环己烷，然后再分子蒸馏除去未反应的游离脂肪酸，最后得到白色，纯度为95.8％的植物甾醇酯92.6g。
其中3级分子蒸馏条件如下：第1级分子蒸馏的真空度为500pa，温度50℃，刮膜转速为300rpm；第2级分子蒸馏的真空度为50pa，温度120℃，刮膜转速为200rpm；第3级分子蒸馏的真空度为5pa，温度160℃，刮膜转速为200rpm。
实施例2
将β-谷甾醇100.0g(纯度为95.0％，购至于西安国邦实业有限公司)、脂肪酸100g(所用为共轭亚油酸脂肪酸，其中共轭亚油酸含量78.6％，购于大连医诺生物有限公司)、150ml氯仿加入带有回流分水装置的三口烧瓶中，待植物甾醇和脂肪酸全部溶解后，加入5g固定化脂肪酶(来源于黑曲霉)，加热至60℃，恒温冷凝回流反应，期间分水若干次，以植物甾醇含量≤0.5％为终点；反应终点后，过滤回收固定化脂肪酶，滤液加入5g活性炭，55℃搅拌30分钟，过滤去除活性炭，滤液先减压回收氯仿，然后再分子蒸馏除去未反应的游离脂肪酸，最后得到白色，纯度为93.3％的植物甾醇酯97.2g。
分子蒸馏条件如下：第1级分子蒸馏的真空度为100pa，温度80℃，刮膜转速为100rpm；第2级分子蒸馏的真空度为10pa，温度150℃，刮膜转速为200rpm；第3级分子蒸馏的真空度为1pa，温度180℃，刮膜转速为300rpm。
实施例3
将豆甾醇100.0g(纯度为96.5％，实验室自制产品)、脂肪酸150g(所用为α-亚麻酸脂肪酸，其中α-亚麻酸含量75.8％，购于菏泽中元健禾生物工程有限公司)、100ml二氯甲烷加入带有回流分水装置的三口烧瓶中，待植物甾醇和脂肪酸全部溶解后，加入10g固定化脂肪酶(来源于假丝酵母)，加热至40℃，恒温冷凝回流反应，期间分水若干次，以植物甾醇含量≤0.5％为终点；反应终点后，过滤回收固定化脂肪酶，滤液加入1g活性炭，40℃搅拌30分钟，过滤去除活性炭，滤液先减压回收二氯甲烷，然后再分子蒸馏除去未反应的游离脂肪酸，最后得到白色，纯度为97.2％的植物甾醇酯90.3g。
分子蒸馏条件如下：第1级分子蒸馏的真空度为200pa，温度50℃，刮膜转速为100rpm；第2级分子蒸馏的真空度为20pa，温度150℃，刮膜转速为200rpm；第3级分子蒸馏的真空度为2pa，温度180℃，刮膜转速为300rpm。
实施例4
将植物甾醇100g(含菜籽甾醇5.3％、菜油甾醇24.5％、豆甾醇7.5％、β-谷甾醇57.0％，实验室自制产品)、脂肪酸200g(脂肪酸为亚油酸脂肪酸，其中亚油酸含量为81.5％，购自安庆市中创生物工程有限公司)、150ml环己烷加入带有回流分水装置的三口烧瓶中，待植物甾醇和脂肪酸全部溶解后，加入10g固定化脂肪酶(来源于黑曲霉)，加热至65℃，恒温冷凝回流反应，期间分水若干次，以植物甾醇含量≤0.5％为终点；反应终点后，过滤回收固定化脂肪酶，滤液加入5g白土和5g活性炭，60℃搅拌30分钟，过滤去除白土和活性炭，滤液先减压回收环己烷，然后再分子蒸馏除去未反应的游离脂肪酸，最后得到白色，纯度为94.1％的植物甾醇酯93.6g。
分子蒸馏条件如下：第1级分子蒸馏的真空度为300pa，温度60℃，刮膜转速为200rpm；第2级分子蒸馏的真空度为30pa，温度120℃，刮膜转速为200rpm；第3级分子蒸馏的真空度为3pa，温度180℃，刮膜转速为200rpm。
实施例5
将植物甾醇100.0g(含菜籽甾醇0.9％、菜油甾醇25.0％、豆甾醇24.3％、β-谷甾醇43.9％，购至于宜春大海龟生物科学有限公司)、脂肪酸125g(脂肪酸为γ-亚麻酸脂肪酸，其中γ-亚麻酸含量为70.3％，购于大连医诺生物有限公司)、150ml甲苯加入带有回流分水装置的三口烧瓶中，待植物甾醇和脂肪酸全部溶解后，加入5g固定化脂肪酶(来源于黑曲霉)，加热至70℃，恒温冷凝回流反应，期间分水若干次，以植物甾醇含量≤0.5％为终点；反应终点后，过滤回收固定化脂肪酶，滤液加入10g活性炭，65℃搅拌30分钟，过滤去除活性炭，滤液先减压回收甲苯，然后再分子蒸馏除去未反应的游离脂肪酸，最后得到白色，纯度为90.9％的植物甾醇酯90.1g。
分子蒸馏条件如下：第1级分子蒸馏的真空度为400pa，温度70℃，刮膜转速为200rpm；第2级分子蒸馏的真空度为40pa，温度140℃，刮膜转速为200rpm；第3级分子蒸馏的真空度为4pa，温度170℃，刮膜转速为200rpm。
实施例6
将植物甾醇100.0g(含菜籽甾醇0.9％、菜油甾醇25.0％、豆甾醇24.3％、β-谷甾醇43.9％，购至于宜春大海龟生物科学有限公司)、脂肪酸200g(脂肪酸为二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的混合脂肪酸，其中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量为58.3％，购于山东禹王)、125ml氯仿加入带有回流分水装置的三口烧瓶中，待植物甾醇和脂肪酸全部溶解后，加入2g固定化脂肪酶(来源于黑曲霉)，加热至55℃，恒温冷凝回流反应，期间分水若干次，以植物甾醇含量≤0.5％为终点；反应终点后，过滤回收固定化脂肪酶，滤液加入1g白土，60℃搅拌30分钟，过滤去除白土，滤液先减压回收氯仿，然后再分子蒸馏除去未反应的游离脂肪酸，最后得到白色，纯度为97.1％的植物甾醇酯87.6g。
分子蒸馏条件如下：第1级分子蒸馏的真空度为1000pa，温度100℃，刮膜转速为100rpm；第2级分子蒸馏的真空度为100pa，温度150℃，刮膜转速为100rpm；第3级分子蒸馏的真空度为10pa，温度180℃，刮膜转速为100rpm。
综上所述，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。