本发明属于含有机有效成分的医药配制品技术领域，尤其涉及一种trim31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法。
背景技术：
目前，业内常用的现有技术是这样的：胰腺导管腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤，近年来在全球的发病率呈逐年上升趋势，而死亡率一直居高不下，5年生存率仅为3％-6％。胰腺导管腺癌预后差，归因于临床症状出现较晚，大多数患者一经诊断即失去手术机会，而胰腺导管腺癌患者能够获得较长生存率的唯一的机会便是能够进行根治性手术切除。因此早期精确的诊断以及新型的治疗手段对胰腺导管腺癌的诊治尤其重要。三结构域蛋白(trim)家族是细胞生物学功能的关键调节因子，trim家族成员含有多域的e3泛素连接酶，并以n端存在三结构域为特征。研究表明trim家族在细胞生长、免疫、抗病毒等方面的功能显著。目前，trim蛋白家族成员trim3、trim25和trim37等在恶性肿瘤中的作用也逐渐被证实。由于trim家族成员数目较多，其各自成员生物学功能不尽相同，所以有关近些年才确定的家族新成员trim31的研究较少，其在胰腺导管腺癌中的作用尚未见报道。如何设计靶向于trim31的干扰序列并选择适当的增殖检测模型成为研究trim31对胰腺导管腺癌细胞增殖作用的难点。同时，若上述问题得到解决，将有利于寻找胰腺导管腺癌治疗的新靶点，改善此肿瘤患者的预后。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)目前关于trim31的研究较少，其在肿瘤发生与进展中的作用尚不明确。
(2)其在胰腺导管腺癌中的作用尚未见报道。
(3)如何设计靶向于trim31的干扰序列以及选择适当的增殖检测模型。
解决上述技术问题的难度和意义：
由于trim家族成员众多，而且其成员各自作用存在差异。只有设计靶向于trim31的干扰序列并选择适当的增殖检测模型，才能明确trim31对胰腺导管腺癌的作用。若上述问题得到解决，将有利于寻找胰腺导管腺癌治疗的新靶点，改善此肿瘤患者的预后。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种trim31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法。
本发明是这样实现的，一种检测癌症的基因序列，所述trim31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法采用实时荧光定量聚合酶链反应和westernblot检测trim31在人胰腺导管腺癌细胞系以及正常人胰腺上皮细胞系中的表达量，并选取两株胰腺导管腺癌细胞系进行后续实验。
进一步，所述trim31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法包括以下步骤：
步骤一，细胞培养：正常胰腺导管上皮细胞hpde、胰腺导管腺癌细胞aspc-1、bxpc-3用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基，miapaca-2及panc-1用含10％胎牛血清的rpmidmem培养基，两组细胞均置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养；
步骤二，rt-qpcr和westernblot法检测各细胞系中trim31表达量取适量处于对数生长期的各细胞，提取细胞总rna及蛋白；选取吸光度度1.8-2.0(a260/a280)之间的rna样本用于实验；再根据逆转录试剂盒说明书，分别逆转录为cdna；qrt-pcr反应检测trim31在各细胞系中的表达量，并以gapdh作为内参，对表达量采用2-δδct法计算相对表达；westernblot法检测各细胞系的trim31蛋白表达量；
步骤三，沉默trim31及沉默效率检测：选取两株胰腺导管腺癌细胞进行后续实验，将两株细胞分别分为trim31沉默组(实验组)和空载体组(阴性对照组)；设计并构建靶向沉默trim31表达的3条sirna。取2×105个对数生长期细胞分别接种于6孔板中，待细胞贴壁后利用lipofectamine3000将3条sirna-trim31片段及对照sirnas分别转染两株细胞；48h后收集细胞，提取rna；72h后收集细胞，提取蛋白；通过rt-qpcr和westernblot检测sirna对trim31的沉默效率；
步骤四，检测细胞增殖采用cck8法；转染sirna48h后收集细胞，以3×103个/孔细胞接种于96孔板中，每组分别设0、1、2、3及4d组，每个时间点设置5个复孔；检测前每孔分别加入cck8试剂10ul，避光37℃孵育2h，轻轻振荡后，酶标仪450nm波长处测定光密度(od)值，观察trim31对胰腺癌细胞增殖的影响；
步骤五，人胰腺导管腺癌细胞单克隆形成能力采用细胞平板克隆实验，转染sirna24h后收集细胞以5×103个/孔细胞接种于6cm培养皿中，37℃培养箱中培养7-8天后，4％多聚甲醛固定30分钟，0.1％结晶紫染色30分钟，计数每孔克隆形成数量并拍照记录；
步骤六，mtor激活剂对trim31沉默细胞增殖能力的影响；转染sirna48h后在培养基中加入适量mtor激活剂雷帕霉素，终浓度2umol/l；24h后提取细胞总蛋白，westernblot检测mtor及p-mtor蛋白表达量与阴性对照组及trim31沉默组之间的差异；cck8法检测各组细胞增殖能力。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：研究三结构域蛋白31(tripartitemotif-containingprotein31，trim31)对胰腺导管腺癌(pdac)增殖的影响并探讨其机制。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qrt-rcr)和westernblot检测trim31在人胰腺导管腺癌细胞系以及正常人胰腺上皮细胞系中的表达量，并选取两株胰腺导管腺癌细胞系进行后续实验。在胰腺导管腺癌细胞中转染靶向沉默trim31的sirna，qrt-rcr和westernblot实验检测对trim31的沉默效果；体外采用cck-8实验，平板克隆实验检测trim31对胰腺导管腺癌细胞增殖能力的影响。westernblot检测trim31沉默对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mtor)总蛋白及磷酸化水平的影响；用mtor激活剂rapamycin处理trim31沉默的胰腺导管腺癌细胞，并通过cck8实验分析胰腺导管腺癌细胞的活力。trim31在4株胰腺导管腺癌细胞系中的表达量均较正常人胰腺上皮细胞系高(p<0.05)。在体外沉默trim31的表达能抑制胰腺导管腺癌细胞的增殖能力(p<0.05)以及p-mtor的蛋白表达水平，并且mtor激活剂rapamycin能部分拮抗这些作用。沉默trim31的表达可能通过抑制mtor的活性抑制胰腺导管腺癌细胞的增殖，有望成为胰腺导管腺癌治疗的新靶点。
附图说明
图1是本发明实施例提供的trim31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法流程图。
图2是本发明实施例提供的trim31在aspc-1、bxpc-3、miapaca-2、panc-1及hpde细胞系中的表达；*p<0.05示意图；
图中：a为trim31mrna在5株细胞系相对表达量；b为westernblot检测trim31蛋白在五株细胞系中表达量；c为trim31蛋白在五株细胞系中相对表达量。
图3是本发明实施例提供的miapaca-2细胞系转染sicontrol和sitrim31后trim31的表达；*p<0.05示意图。
图4是本发明实施例提供的沉默trim31表达后panc-1与miapaca-2细胞增殖能力示意图；
图中：a为panc-1；b为miapaca-2；*p<0.05。
图5是本发明实施例提供的胰腺导管腺癌细胞panc-1与miapaca-2的克隆形成能示意图。
图6是本发明实施例提供的westernblot法检测mtor激动剂rapamycin对p-mtor蛋白水平的影响示意图。
图7是本发明实施例提供的cck8实验分析rapamycin对trim31沉默的panc-1和miapaca-2细胞增殖能力的影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明采用实时荧光定量聚合酶链反应(qrt-rcr)和westernblot检测trim31在人胰腺导管腺癌细胞系以及正常人胰腺上皮细胞系中的表达量，并选取两株胰腺导管腺癌细胞系进行后续实验。
如图1所示，本发明实施例提供的trim31沉默对胰腺导管腺癌细胞增殖的检测方法包括以下步骤：
s101：细胞培养：正常胰腺导管上皮细胞hpde、胰腺导管腺癌细胞aspc-1、bxpc-3用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基，miapaca-2及panc-1用含10％胎牛血清的rpmidmem培养基，两组细胞均置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养；
s102：rt-qpcr和westernblot法检测各细胞系中trim31表达量取适量处于对数生长期的各细胞，提取细胞总rna及蛋白。选取吸光度度1.8-2.0(a260/a280)之间的rna样本用于实验。再根据逆转录试剂盒说明书，分别逆转录为cdna。qrt-pcr反应检测trim31在各细胞系中的表达量，并以gapdh作为内参，对表达量采用2-δδct法计算相对表达。westernblot法检测各细胞系的trim31蛋白表达量；
s103：沉默trim31及沉默效率检测：选取两株胰腺导管腺癌细胞进行后续实验，将两株细胞分别分为trim31沉默组(实验组)和空载体组(阴性对照组)。取2×105个对数生长期细胞分别接种于6孔板中，待细胞贴壁后利用lipofectamine3000将3条sirna-trim31片段及对照sirnas分别转染两株细胞。48h后收集细胞，提取rna；72h后收集细胞，提取蛋白。通过rt-qpcr和westernblot检测sirna对trim31的沉默效率；
s104：检测细胞增殖采用cck8法。转染sirna48h后收集细胞，以3×103个/孔细胞接种于96孔板中，每组分别设0、1、2、3及4d组，每个时间点设置5个复孔；检测前每孔分别加入cck8试剂10ul，避光37℃孵育2h，轻轻振荡后，酶标仪450nm波长处测定光密度(od)值，观察trim31对胰腺癌细胞增殖的影响；
s105：人胰腺导管腺癌细胞单克隆形成能力采用细胞平板克隆实验，转染sirna24h后收集细胞以5×103个/孔细胞接种于6cm培养皿中，37℃培养箱中培养7-8天后，4％多聚甲醛固定30分钟，0.1％结晶紫染色30分钟，计数每孔克隆形成数量并拍照记录；
s106：mtor激活剂对trim31沉默细胞增殖能力的影响。转染sirna48h后在培养基中加入适量mtor激活剂雷帕霉素，终浓度2umol/l。24h后提取细胞总蛋白，westernblot检测mtor及p-mtor蛋白表达量与阴性对照组及trim31沉默组之间的差异。cck8法检测各组细胞增殖能力。
:下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1材料与方法
1.1细胞株及主要试剂
4株胰腺导管腺癌细胞系及正常胰腺导管上皮细胞获赠于华中科技大学附属同济医院胆胰外科实验室，进口胎牛血清、rpmi-dmem细胞培养基、0.05％含edta的胰蛋白酶均购自gibico公司，cck8检测试剂盒购自碧云天公司，rna抽提试剂trizol购自invitrogen公司，逆转录试剂盒、sybrpremixextaq试剂盒均购自takara公司，sitrim31套装购自广州锐博公司，trim31引物购自武汉天一辉远生物科技有限公司。mtor、p-mtor抗体购自美国cst公司，trim31抗体购自武汉三鹰生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养：正常胰腺导管上皮细胞hpde、胰腺导管腺癌细胞aspc-1、bxpc-3用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基，miapaca-2及panc-1用含10％胎牛血清的rpmidmem培养基，两组细胞均置于37℃、5％co2的恒温培养箱中培养。
1.2.2rt-qpcr和westernblot法检测各细胞系中trim31表达量取适量处于对数生长期的各细胞，提取细胞总rna及蛋白。选取吸光度度1.8-2.0(a260/a280)之间的rna样本用于实验。再根据逆转录试剂盒说明书，分别逆转录为cdna。qrt-pcr反应检测trim31在各细胞系中的表达量，并以gapdh作为内参，对表达量采用2-δδct法计算相对表达。westernblot法检测各细胞系的trim31蛋白表达量。
1.2.3沉默trim31及沉默效率检测：选取两株胰腺导管腺癌细胞进行后续实验，将两株细胞分别分为trim31沉默组(实验组)和空载体组(阴性对照组)。取2×105个对数生长期细胞分别接种于6孔板中，待细胞贴壁后利用lipofectamine3000将3条sirna-trim31片段及对照sirnas分别转染两株细胞。48h后收集细胞，提取rna；72h后收集细胞，提取蛋白。通过rt-qpcr和westernblot检测sirna对trim31的沉默效率。
1.2.4检测细胞增殖采用cck8法。转染sirna48h后收集细胞，以3×103个/孔细胞接种于96孔板中，每组分别设0、1、2、3及4d组，每个时间点设置5个复孔；检测前每孔分别加入cck8试剂10ul，避光37℃孵育2h，轻轻振荡后，酶标仪450nm波长处测定光密度(od)值，观察trim31对胰腺癌细胞增殖的影响。
1.2.5人胰腺导管腺癌细胞单克隆形成能力采用细胞平板克隆实验，转染sirna24h后收集细胞以5×103个/孔细胞接种于6cm培养皿中，37℃培养箱中培养7-8天后，4％多聚甲醛固定30分钟，0.1％结晶紫染色30分钟，计数每孔克隆形成数量并拍照记录。
1.2.6mtor激活剂对trim31沉默细胞增殖能力的影响。转染sirna48h后在培养基中加入适量mtor激活剂雷帕霉素，终浓度2umol/l。24h后提取细胞总蛋白，westernblot检测mtor及p-mtor蛋白表达量与阴性对照组及trim31沉默组之间的差异。cck8法检测各组细胞增殖能力。
1.3统计学处理：数据用spss22.0统计软件处理，计数资料以(x±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以p＜0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1trim31在胰腺导管腺癌细胞中的表达
在胰腺导管腺癌细胞株中，4株胰腺导管腺癌细胞trim31的相对表达量分别与正常胰腺导管细胞相比，均为高表达。其中在aspc-1、bxpc-3、miapaca-2、panc-1细胞株中trim31的mrna相对表达量分别为4.47±0.88、10.70±0.93、15.97±1.76、9.53±0.45，均显著高于hpde细胞株的相对表达量1.043±0.14(p<0.05，图2a)。aspc-1、bxpc-3、miapaca-2、panc-1细胞株中trim31的蛋白相对表达量分别为1.97±0.89、3.54±0.32、3.80±0.21、2.37±0.27，均显著高于hpde细胞株的相对表达量1.023±0.19(p<0.05图2b、2c)。
2.2trim31沉默效率检测
选取miapaca-2进行试验，并转染三条sitrim31序列。sitrim31-1和sitrim31-3显著沉默了trim31在miapaca-2细胞系中mrna及蛋白水平的表达(p<0.05，图3)。转染sitrim31-2未能明显沉默trim31的表达，差异无统计学意义(p＞0.05，图3)。
2.3sitrim31对胰腺导管腺癌细胞增殖能力的影响
选取miapaca-2和panc-1作为实验所用细胞系。cck-8结果显示，当培养3日后，panc-1细胞系sitrim31-1组较sicontrol组od450明显降低，差异有统计学意义(p<0.05，图4a)。当培养4日后，miapaca-2细胞系sitrim31-1组较sicontrol组明显降低，差异有统计学意义(p<0.05，图4b)。
2.4sitrim31对胰腺导管腺癌细胞克隆形成的影响
集落形成数量分别为:sicontrol组：panc-1:412.6±18.48；miapaca-2:182.7±11.51；sitrim31-1组：panc-1:267.0±37.58；miapaca-2:89.4±5.67；sitrim31-1组较sicontrol组集落形成数量明显减少，差异均有统计学意义(p<0.05，图5)。
2.5mtor在trim31沉默抑制胰腺导管腺癌细胞增殖中的作用
通过westernblot法检测了trim31沉默的panc-1和miapaca-2细胞中的mtor及磷酸化的mtor(p-mtor)的蛋白水平，以及在沉默trim31的同时用2umol/l的mtor激活剂rapamycin处理细胞。结果显示trim31对mtor表达未见显著影响，而能明显抑制p-mtor的蛋白水平，用rapamycin处理细胞后p-mtor的蛋白水平得到明显恢复。而与此同时，cck8实验分析结果显示rapamycin也明显拮抗了trim31沉默对胰腺导管腺癌细胞活力的抑制作用。这些发现揭示trim31可能通过下调mtor信号通路进而抑制胰腺导管腺癌细胞增殖。
本发明主要关注trim31对胰腺导管腺癌细胞增殖的影响，发现trim31在胰腺导管腺癌中是高表达的，trim31沉默能抑制胰腺导管腺癌细胞增殖。同时发现trim31沉默可降低mtor的活性，并且mtor激活剂可拮抗trim31沉默对胰腺导管腺癌细胞增的抑制作用，这些发现揭示trim31沉默可能通过下调mtor的活性抑制胰腺导管腺癌细胞生长。
综上，trim31作为一种促癌基因的形式在胰腺导管腺癌中高表达。沉默其表达能显著抑制mtor的活性进而抑制胰腺导管腺癌的增殖。trim31有望成为胰腺导管腺癌诊治的潜在靶点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。