一种快速检测沙门氏菌污染的方法及试剂盒与流程

文档序号:15457513发布日期:2018-09-15 01:31

本发明属于生物技术领域,涉及食源性疾病的致病菌—沙门氏菌的检测,具体涉及一种快速检测食品中沙门氏菌污染的方法及试剂盒。



背景技术:

沙门氏菌(Salmonella)是一百多年前发现的一种病原体,其是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科的一个大属,其菌型繁多,分布广泛,是常见的重要的人畜共患病病原菌之一,也是引起人发生食物中毒最常见的病原菌,它不仅可以引起胃肠炎,还会引起伤寒、败血症及肠外灶性感染等多种症候群。据统计,在世界各国的细菌性食物中毒中,沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首,在我国,以沙门氏菌引起的食物中毒也排在细菌性食物中毒的首位,沙门氏菌是监测食品卫生状况的重要指标菌,一旦发现食品污染沙门氏菌,表明监测的食品卫生不合格。食品及其原料中沙门氏菌的快速、现场检测对食品安全控制具有重要意义.。

目前,世界各国对食源性沙门氏菌的检测方法及限量标准均制定出了非常严格的规定,使受污染的食品能够得到及时处理,以保障食品质量及食品安全。然而,包括我国在内的许多国家对沙门氏菌的临床检测仍然采用传统的培养方法,这种常规的沙门氏菌检测存在操作繁琐、检测时间长、结果判定误差大等诸多弊端,已经远远不能满足现代快速检测诊断的需要。近年来,沙门氏菌检测技术有了很大的进展,由十分困难的传统分离培养法到免疫学检测方法发展成为今天的分子生物学检测技术,例如黄金海等人研究的环介导等温扩增技术(LAMP)对沙门氏菌进行检测(“食品中沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立”,《天津大学学报》,2012年05期),钟伟军等人研究了食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立(“食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立”,《中国人兽共患病学报》,2007年第12期),然而以上分子检测方法均需要昂贵的设备,并且在结果判定方面不直观,需要借助一定的设备才能判断。

inv 基因簇是沙门氏菌属的特异性引物基因, 具有属特异性,细菌感染宿主通常是先粘附到宿主组织上 , 进而通过细菌的毒力因子侵袭宿主细胞 , 导致宿主患病及死亡, 这些毒力因子由细菌的基因编码, 是细菌的基因产物。菌体的 inv蛋白决定其侵袭力, 与沙门氏茵的毒力有关。沙门氏菌的侵袭蛋白(invasion protein, inv)决定细菌进入宿主上皮细胞的能力, 与沙门氏菌的致病性密切相关, inv基因由invA、 invB、 invC、 invD和invE 等基因组成,其中 invA 为沙门氏菌的主要毒力因子,invE蛋白是沙门氏菌致病岛(SPI-1)编码的 III 型分泌系统中的一个必需组成成份 , 它介导细菌的一组具有调节细胞功能活性的效应蛋白(即细菌的转位酶SipB、SipC和SipD) 进入宿主细胞 , 从而完成细菌在感染细胞内 的定植 , 因此是沙门氏菌侵入细胞必需的介导因子之一 。



技术实现要素:

基于现有沙门氏菌分子检测方法的不足,本发明旨在提供一种快速检测沙门氏菌污染的方法及其运用,该沙门氏菌的检测方法操作简单,灵敏度高,特异性高,特别适合基层食品安全的检测。

为实现本发明的目的,解决现有技术中存在的技术问题,本发明采用了如下技术方案:

一种沙门氏菌的检测方法,包括如下步骤:

步骤一,制备探针分子:根据沙门氏菌的基因组结构和保守序列,选取沙门氏菌的invA和invE基因作为检测目标片段,根据GenBank公开的沙门氏菌invA和invE基因序列,分别设计探针分子,所述invA基因检测的探针分子序列为5’-GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT-3’,所述invE基因检测的探针分子的序列为5’- GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA-3’,上述基因检测的探针分子的5’端分别采用不同的报告荧光基团进行标记,即invA基因检测的探针分子结构为:报告荧光基团1- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT;invE基因检测的探针分子结构为:报告荧光基团2- GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA;

步骤二,将聚苯乙烯纳米球溶液与步骤一所制得的探针分子:报告荧光基团1- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT以及报告荧光基团2- GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA混合,然后加入待测样品,检测荧光。

其中引物设计是所依据的GenBank基因序列分别是:invA- EU348365;invE- U43274.1。

其中,步骤一中所述的报告荧光基团1和报告荧光基团2分别选自异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、四甲基罗丹明(TAMRA)、ROX、CY3、CY5、CY5.5、CAL red、Red640和Texas Red等,且报告荧光基团1和2不同。

其中,步骤二中所述的聚苯乙烯纳米球由以下方法制备得到:将0.05g过硫酸氨和0.05g十二烷基磺酸钠溶解到10mL水中,再加入12mL苯乙烯,将反应物加热一段时间,然后将产物离心,用甲醇冲洗移除SDS,即制得聚苯乙烯纳米球。

在本发明结果判定过程中,分别设置阳性对照组和阴性对照组,根据样品检测荧光的强度判断样品中是否存在沙门氏菌。

本发明还请求保护一种用于沙门氏菌检测的试剂盒,其包括:invA基因检测的探针分子溶液、invE基因检测的探针分子溶液、聚苯乙烯纳米球溶液、阳性对照、阴性对照,其中invA基因检测的探针分子结构为:报告荧光基团1- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT;invE基因检测的探针分子结构为:报告荧光基团2- GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA。

优选地,所述阴性对照为去离子水,所述阳性对照为沙门氏菌的核酸提取物,例如购自CGMCC的编号为CGMCC 1.1190的肠沙门氏菌肠亚种;或者购自ATCC的编号为ATCC14028的鼠伤寒沙门氏菌;也可以是实验室分离、鉴定的沙门氏菌菌株,采用商业化的核酸提取试剂盒对沙门氏菌进行提取获得的沙门氏菌核酸提取物。

本发明还请求保护所述的沙门氏菌的检测方法或用于沙门氏菌检测的试剂盒在用于食品中沙门氏菌的检测,所述的食品为肉类食品、乳制品或果蔬制品,其中肉类食品优选为鲜肉制品,所述乳制品优选为鲜牛乳,所述新鲜果蔬制品优选为新鲜果蔬或者鲜榨果蔬汁。

基于以上技术方案,本发明所使用的沙门氏菌的检测方法成本低廉,其是将靶核酸分子特异性结合探针分子吸附在聚苯乙烯纳米球表面,淬灭探针分子的荧光,然后,当探针分子与待测样品中的DNA分子混合,杂交形成双链时,探针分子从聚苯乙烯纳米球表面脱离,荧光淬灭效应消失,通过检测荧光信号实现对待测样品的检测,根据荧光的强度变化还可确定待测样品中靶核酸分子的含量。

在本发明中,发明人创新地选取invA和invE作为检测目标基因,基于本发明方法检测的高灵敏性和自然界突变的不确定性,本发明选取两个沙门氏菌致病性的侵袭因子invA和invE作为检测目标,可以有效地避免有可能存在的自然突变导致单基因检测效果的失真,同时,还能在检测过程中实现结果的二次确认,确保灵敏度高、检测结果更加准确。

该方法实现起来十分简单,不需要使用昂贵的PCR仪器以及昂贵的ELISA检测试剂,仅需简单的荧光检测设备即可实现结果的检测和分析,检测时间短、灵敏度高,可以广泛用于食品安全检测,特别是基层食品卫生监督部门的食品安全检测。

附图说明:

图1:核酸检测结果。其中a为探针DNA(各50nM)的荧光发射光谱,b为探针DNA(各50nM)+阳性对照核酸(来自实施例3,300nM)的荧光发射光谱,c为探针DNA(各50nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+阴性对照(去离子水)的荧光发射光谱,d为探针DNA(各50nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照核酸(来自实施例3,300nM)的荧光发射光谱,e为聚苯乙烯纳米球溶液本身的荧光发射光谱。

图2:灵敏度试验结果。其中图2-A中样品a、b、c、d、e对应的浓度为a-3×104CFU/mL,b-3×103CFU/mL,c-3×102CFU/mL,d-3×101CFU/mL,e-3CFU/mL,f-聚苯乙烯纳米球溶液本身的荧光发射光谱;图2-B和图2-C中泳道1-10对应的浓度为:泳道1-3×108CFU/mL,泳道2-3×107CFU/mL,泳道3-3×106CFU/mL,泳道4-3×105CFU/mL,泳道5-3×104CFU/mL,泳道6-3×103CFU/mL,泳道7-3×102CFU/mL,泳道8-3×101CFU/mL,泳道9-3CFU/mL,泳道10-空白对照。

图3:聚苯乙烯纳米球颗粒的高倍电镜图像。

具体实施方式:

实施例1:一种沙门氏菌的检测方法,包括如下步骤:

步骤一,制备探针分子:根据沙门氏菌的基因组结构和保守序列,选取沙门氏菌的invA和invE基因作为检测目标片段,根据GenBank公开的沙门氏菌invA和invE基因序列,分别设计探针分子,所述invA基因检测的探针分子序列为5’-GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT-3’,所述invE基因检测的探针分子的序列为5’- GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA-3’,上述基因检测的探针分子的5’端分别采用不同的报告荧光基团进行标记,即invA基因检测的探针分子结构为:FAM- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT;invE基因检测的探针分子结构为:ROX- GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA;

步骤二,将聚苯乙烯纳米球溶液与步骤一所制得的探针分子:FAM- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT以及ROX - GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA混合,然后加入待测样品,检测荧光。

具体检测过程是将聚苯乙烯纳米球溶液加入到荧光探针溶液中,两个探针分子会吸附到聚苯乙烯纳米球颗粒表面,引起荧光淬灭,经过30min平衡反应时间,荧光淬灭达到平衡,加入靶DNA(靶DNA经94℃变性15min,而后在5-60s内快速冷却至0-4℃),靶DNA与探针DNA分子杂交形成双链,探针DNA分子会从聚苯乙烯纳米球颗粒表面脱离下来,从而荧光得到恢复,反应30min后,确认荧光恢复达到平衡(FAM480/522,ROX:587/606),检测荧光值,根据荧光值判断是否待检测样品中是否存在沙门氏菌的核酸,进而判断食品是否受沙门氏菌污染。

实施例2:一种沙门氏菌的检测方法,包括如下步骤:

步骤一,制备探针分子:根据沙门氏菌的基因组结构和保守序列,选取沙门氏菌的invA和invE基因作为检测目标片段,根据GenBank公开的沙门氏菌invA和invE基因序列,分别设计探针分子,所述invA基因检测的探针分子序列为5’-GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT-3’,所述invE基因检测的探针分子的序列为5’- GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA-3’,上述基因检测的探针分子的5’端分别采用不同的报告荧光基团进行标记,即invA基因检测的探针分子结构为:FITC- GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT;invE基因检测的探针分子结构为:Texas Red - GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA;

步骤二,将聚苯乙烯纳米球溶液与步骤一所制得的探针分子:FITC - GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT以及Texas Red - GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA混合,然后加入待测样品,检测荧光。

具体检测过程是将聚苯乙烯纳米球溶液加入到荧光探针溶液中,两个探针分子会吸附到聚苯乙烯纳米球颗粒表面,引起荧光淬灭,经过30min平衡反应时间,荧光淬灭达到平衡,加入靶DNA(靶DNA经94℃变性15min,而后在5-60s内快速冷却至0-4℃),靶DNA与探针DNA分子杂交形成双链,探针DNA分子会从聚苯乙烯纳米球颗粒表面脱离下来,从而荧光得到恢复,反应30min后,确认荧光恢复达到平衡(FITC490/520,ROX:596/620),检测荧光值,根据荧光值判断是否待检测样品中是否存在沙门氏菌的核酸,进而判断食品是否受沙门氏菌污染。

实施例3:一种用于沙门氏菌检测的试剂盒,包括:invA基因检测的探针分子溶液、invE基因检测的探针分子溶液、聚苯乙烯纳米球溶液、阳性对照、阴性对照,其中invA基因检测的探针分子结构为:FAM - GCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT;invE基因检测的探针分子结构为:ROX- GTGATTTAGTCCTTGTGTTACGCGA。

所述阴性对照为去离子水,所述阳性对照为沙门氏菌的核酸提取物,是购自ATCC的编号为ATCC14028的鼠伤寒沙门氏菌采用商业化的核酸提取试剂盒对沙门氏菌进行提取获得的沙门氏菌核酸提取物。

实施例4:检测试验

采用实施例1的方法对阳性对照和阴性对照进行了试验,以验证检测方法的准确性,其检测结果对应于说明书附图图1,其中a为探针DNA(各50nM)的荧光发射光谱,b为探针DNA(各50nM)+阳性对照核酸(来自实施例3,300nM)的荧光发射光谱,c为探针DNA(各50nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+阴性对照(去离子水)的荧光发射光谱,d为探针DNA(各50nM)+聚苯乙烯纳米球溶液+阳性对照核酸(来自实施例3,300nM)的荧光发射光谱,e为聚苯乙烯纳米球溶液本身的荧光发射光谱。

以上检测结果表明,在没有检测模板存在的情况下,探针分子和聚苯乙烯纳米球相互结合,发生荧光淬灭效应,其在520nm下检测到的荧光强度(c)不足探针分子溶液(a)或者探针DNA(25nM)+阳性对照质粒(b)荧光强度的一半,而当添加模板后(d),其相应的荧光值即恢复到接近探针分子溶液的荧光值,同样,在606nm下检测也出现了同样的检测结果,以上结果表明本发明的方法检测结果准确,能够有效地通过荧光情况判断待检测样品中是否存在沙门氏菌。

实施例5:灵敏度检测:

取阳性对照核酸(3×108CFU/mL的菌液提取得到的),分别进行梯度稀释,分别进行invA PCR检测、invE PCR检测和采用实施例1的方法进行检测,检测结果见图2-A-图2-C;其中图2-A中样品a、b、c、d、e对应的浓度为a-3×104CFU/mL,b-3×103CFU/mL,c-3×102CFU/mL,d-3×101CFU/mL,e-3CFU/mL,f-聚苯乙烯纳米球溶液本身的荧光发射光谱;图2-B和图2-C中泳道1-10对应的浓度为:泳道1-3×108CFU/mL,泳道2-3×107CFU/mL,泳道3-3×106CFU/mL,泳道4-3×105CFU/mL,泳道5-3×104CFU/mL,泳道6-3×103CFU/mL,泳道7-3×102CFU/mL,泳道8-3×101CFU/mL,泳道9-3CFU/mL,泳道10-空白对照。

图2-B中采用传统的PCR检测方法进行检测(PCR扩增invA基因上一段长为202bp的核酸片段,其上游引物序列为5’-CGGTGGGGTTTGTTGTCTTTTC-3’ , 下游引物为5’-TCTCTTTCCAGTTCGCTTCGCC-3’,Tm=54℃),由图2-B的检测将可见,PCR检测invA的检测方法仅能检测到最低浓度为3×103CFU/mL的样品;图2-C采用传统的PCR检测方法进行检测(PCR扩增invE基因上一段长为463bp的核酸片段,其上游引物序列为5' -CGATCCGAAGACCCTCAA-3' ;下游引物为: 5'-CAATAACGCATTCAAACCT-3',Tm=50℃),由图2-C的检测将可见,PCR检测invE的检测方法也仅能检测到最低浓度为3×103CFU/mL的样品;由图2-A本发明实施例1的方法能够检测最低浓度为3×101CFU/ mL的样品,即本发明构建的方法的灵敏度能够达到3×101CFU/ mL,其灵敏度先比传统的PCR检测方法高出近100倍。

实施例6:样品检测

取新鲜果蔬汁100份,每个样品分为均分为三等份,每份10mL,每份样品经离心后取上清液,置于100℃水浴中水浴15min,而后8000rpm离心10min,取上清液作为检测样品,其中第一份按照实施例1的方法进行检测,第二份样品采用常规PCR方法(PCR扩增invA基因上一段长为202bp的核酸片段,其上游引物序列为5’-CGGTGGGGTTTGTTGTCTTTTC-3’ , 下游引物为5’-TCTCTTTCCAGTTCGCTTCGCC-3’,Tm=54℃,参见“沙门氏菌 PCR 检测方法的建立”,许会会等,《中国畜牧兽医》,2010年第37卷第4期)检测,第三份样品采用黄金海等人研发的LAMP方法进行检测,具体检测结果如下:实施例1的方法检出:阳性86件,阴性14件;常规PCR方法检出:阳性74件,阴性26件;LAMP方法检出:阳性83例,阴性17例,其中实施例1检测为阴性的样品,PCR和LAMP方法检测均为阴性,而实施例1检测为阳性、PCR或/或LAMP检测为阴性的样品经传统的细菌培养方式培养鉴定后,其均为阳性,说明本申请实施例1的方法相比传统的PCR方法和LAMP检测方法具有更高的准确性和灵敏性。

另外,委托天津某检验检疫机关赵老师团队对本发明的试剂盒检测的准确性进行了验证,通过与现有PCR检测方法、ELISA检测方法进行比较发现,本发明的试剂盒的检测结果与PCR方法和ELISA检测方法存在一致性,对1000份出入境食品样品进行检测发现,本发明试剂盒的检出率比传统的PCR方法高出20%[(本发明的检出样品数量/PCR检出样品数量-1)*100%],比ELISA检测方法的检出率高10%[(本发明的检出样品数量/ELISA检出样品数量-1)*100%],且经验证本发明试剂盒检测的准确性高达100%(即本发明检测为阳性的样品经确认后均受到沙门氏菌的污染)。之所以取得良好的技术效果,是由于本发明探针涉及合理,且本发明的方法具有高灵敏性和高准确性。

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