一种细胞cDNA芯片及其制备方法和应用与流程

文档序号:15457509发布日期:2018-09-15 01:31

本发明涉及基因芯片领域,尤其是涉及一种细胞cDNA芯片及其制备方法和应用。



背景技术:

细胞生物学水平的生命科学及医学研究主要是从细胞结构、细胞功能、蛋白及各种核酸在细胞中的表达三个方面展开。为全面解决科研问题,解释各种假说和推测,以上三个方面相辅相成,缺一不可。从实验角度来看,检测细胞中各种核酸的表达是细胞生物学研究最基础的一环。因此,选择合适的细胞株或原代细胞的首要依据就是:目的基因或蛋白的表达水平应符合实验需要。

为选择合适的细胞株或原代细胞,目前研究人员进行细胞株筛选时通常采用的方法是,购买或复苏待选细胞株2-5株,先进行长达一周到两周以上的培养、扩增,然后对每株不同的细胞进行RNA抽提、反转录及目的基因扩增。上述方法存在以下缺点:1)步骤多,耗时长;2)筛选效率极低,无法现实高通量筛选;3)每种待选细胞株或原代细胞需单独按上述方法进行操作,实验条件难以保持一致,组间的均一性较差,影响筛选结果的准确性;4)受不同细胞株尤其是原代细胞来源渠道的限制以及实验经费的限制,研究人员通常不能同时获得目标种类的所有细胞株,只能在有限的选择范围内进行筛选,检测的细胞种类不全,从而影响后续实验结果。

现有的基因芯片技术多是将大量的已知序列的DNA片段(基因探针)固定于基片上,构成一个二维DNA探针阵列,根据杂交测序方法可以一次性对样品中的大量序列进行检测和分析,可用于基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等,但是该方法不适合直接应用于多种细胞株的筛选。

因此,针对本领域科研活动中细胞株筛选的现状,亟需提供一种用于细胞株筛选的新型的研究工具,可适用于细胞株的多样本分析以及快速的分子水平分析。



技术实现要素:

本发明所要解决的技术问题在于,提供一种用于细胞株筛选的细胞cDNA芯片,能够提高细胞株筛选的效率和准确性,缩短筛选时间,可用于细胞株的高通量筛选。

为解决上述技术问题,本发明提供一种细胞cDNA芯片,包括基片和固定于基片上的cDNA模板;

所述cDNA模板,是由细胞株或原代细胞抽提的总RNA经过反转录得到的cDNA;所述细胞株或原代细胞是来自于人/动物;

所述cDNA芯片还具有管家基因引物,所述管家基因引物是管家基因的一对正向及反向引物,所述管家基因引物作为内参及阳性对照。

具体的,所述基片上具有阵列式分布的点样区间,所述点样区间用于固定cDNA模板;所述cDNA模板为两种或两种以上,是来源于两种或两种以上不同的细胞株或原代细胞;来源不同的cDNA模板固定于不同的点样区间。细胞株或原代细胞的选择,可以根据客户需求进行个性化定制。

具体的,固定于不同点样区间的cDNA模板的上样量保持一致,且控制内参qPCR结果Ct值波动不超过2。

具体的,所述总RNA在用于反转录之前应控制纯度,限定范围为:OD260/OD280的比值为2.0±0.1,OD260/OD230的比值为2.0-2.1。

具体的,所述总RNA在用于反转录之前应测定RNA的完整性,选择RIN值超过7的高质量的RNA进行反转录,得到cDNA。

具体的,所述管家基因为β-actin(β肌动蛋白),其正向及反向引物为SEQ ID NO:1~2所示序列的核苷酸链或其互补链。所述β-actin也可选用其他管家基因,如GAPDH,U6等。所述管家基因β-actin(β肌动蛋白)的序列为SEQ ID NO:3所示序列的核苷酸链或其互补链。其中,

SEQ ID NO:1:GAAGAGCTAC GAGCTGCCTG A

SEQ ID NO:2:CAGACAGCAC TGTGTTGGCG

SEQ ID NO:3:GAAGAGCTAC GAGCTGCCTG ACGGCCAGGT CATCACCATT GG CAATGAGC GGTTCCGCTG CCCTGAGGCA CTCTTCCAGC CTTCCTTCCT GGGCATGG AG TCCTGTGGCA TCCACGAAAC TACCTTCAAC TCCATCATGA AGTGTGACGT GGA CATCCGC AAAGACCTGT ACGCCAACAC AGTGCTGTC

本发明还提供一种细胞cDNA芯片的制备方法,包括以下步骤:

1)cDNA的获得:由人/动物细胞株或原代细胞抽提得到总RNA,纯化;检测和筛选RNA,RNA纯度限定范围为:OD260/OD280的比值为2.0±0.1,OD260/OD230的比值为2.0-2.1,RNA完整性的RIN值超过7;利用筛选出的RNA进行反转录,得到cDNA;

2)制备cDNA模板:将步骤1)得到的cDNA进行定量,以固定的上样量点样于基片上,确保内参qPCR结果Ct值波动不超过2;冻干后制备成cDNA模板。

具体的,所述基片可选用96孔PCR板、384孔PCR板或其他规格PCR板。所述细胞c DNA芯片上覆盖有相应的PCR板覆膜。

本发明还提供使用细胞cDNA芯片进行细胞株筛选的方法,包括以下步骤:

1)进行PCR反应:以细胞cDNA芯片固定的cDNA模板为PCR反应的模板,以管家基因引物为PCR反应的引物,配置PCR反应体系溶液,加入至cDNA阵列中,使冻干的cDN A模板充分溶解;将cDNA芯片放入PCR仪中进行PCR反应,PCR循环时的退火温度控制低于正向及反向引物的Tm值(DNA的解链温度);此过程中上下游引物会特异的与cDNA的目的区域结合,并进行核苷酸链式聚合反应。

2)进行荧光收集,通过实时荧光定量的方法来检测目的基因的表达。算各样本中目标基因与管家基因的△Ct值,可分析目的基因在不同细胞株或原代细胞中的表达水平,从而有助于选择合适的细胞株或原代细胞。

具体的,PCR反应体系溶液中包含DNA聚合酶,DNA聚合酶为无核酸外切酶活性,包括5’核酸外切酶活性和3’核酸外切酶活性。

本发明提供的细胞cDNA芯片可直接应用于细胞株筛选,无需经过细胞株的培养、扩增,RNA抽提、反转录等周期,样本准备时间短,降低科研时间成本。

本发明提供的细胞cDNA芯片用于细胞株筛选时只需一次使用一张玻片,而现有技术的筛选方案需要使用十几张甚至成百上千张玻片,本发明节省了实验操作工作量,有效缩短多样本量的筛选时间,可以帮助研究人员根据对目的基因表达水平的需求一次性筛选多种细胞株,可用于细胞株的高通量筛选。

本发明提供的细胞cDNA芯片用于细胞株筛选时只需一次使用一份试剂,而现有技术的筛选方案每种待选细胞株筛选时使用需一份试剂,本发明极大的节省了实验试剂用量,节省科研成本。

本发明提供的细胞cDNA芯片能够根据客户的需求进行定制服务,有效解决了研究人员大样本收集的困难。

本发明提供的细胞cDNA芯片使用了均一化的cDNA模板,用于反转录制备cDNA的R NA也经过严格质控,OD260/OD280的比值为2.0±0.1,OD260/OD230的比值为2.0-2.1,R NA完整性的RIN值超过7,实验误差小,实验条件保持一致,提高了胞株筛选的准确性。

本发明提供的细胞cDNA芯片能够提供详细细胞株或原代细胞的详细临床及随访信息,方便研究人员进行何种相关性分析。

本发明提供的细胞cDNA芯片用于筛选细胞株的方法,具有检测通量大、敏感性高、操作简单快速、定量准确性高、结果可靠性强等优势。

附图说明

图1为在15株肺腺癌细胞的细胞cDNA芯片中qPCR检测管家基因β-actin的Ct值的柱状图。

图2为在15株肺腺癌细胞的细胞cDNA芯片中qPCR检测目的基因Fibulin5的Ct值与管家基因β-actin的Ct值的差值的柱状图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

本发明的细胞cDNA芯片包括:包括基片和固定于基片上的cDNA模板;

cDNA模板是由人类或动物细胞株或原代细胞抽提的RNA(核糖核酸)反转录得到的cDNA;

本发明的细胞cDNA芯片还包括管家基因引物,管家基因β-actin(β肌动蛋白)的正向及反向引物一对。

其中,所述cDNA模板为由细胞株或原代细胞(或根据客户需求进行个性化定制)抽提的RNA反转录形成的cDNA。

其中,所述管家基因β-actin(β肌动蛋白)的正向及反向引物为SEQ ID NO:1-2所示序列的核苷酸链或其互补链。β-actin也可由其他管家基因代替,比如GAPDH,U6等。

其中,所述管家基因β-actin(β肌动蛋白)的序列为SEQ ID NO:3所示序列的核苷酸链或其互补链。

序列说明如下:

SEQ ID NO:1:GAAGAGCTAC GAGCTGCCTG A

SEQ ID NO:2:CAGACAGCAC TGTGTTGGCG

SEQ ID NO:3:GAAGAGCTAC GAGCTGCCTG ACGGCCAGGT CATCACCATT GGCAATGAGC GGTTCCGCTG CCCTGAGGCA CTCTTCCAGC CTTCCTTCCT GGGCATGGAG TCCTGTGGCA TCCACGAAAC TACCTTCAAC TCCATCATGA AGTGTGACGT GGACATCCGC AAAGACCTGT ACGCCAACAC AGTGC TGTC

本发明的细胞cDNA芯片的cDNA模板是按以下方法获得:

1.人/动物细胞株或原代细胞抽提得到总RNA;

2.RNA纯化;

3.nanodrop进行纯度检测,以选择高纯度RNA,限定范围为:260/280为2.0(±0.1),260/230为2.0-2.1;

4.安捷伦生物分析精确测定RNA的完整性,选择RIN值超过7的高质量的RNA进行反转录,得到cDNA;

5.cDNA经过Qubit进行定量,以固定的上样量进行96孔板点样,以保证内参qPCR结果Ct值波动不超过2。

本发明的细胞cDNA芯片用于细胞株筛选时,采用DNA聚合酶、dNTP和相应的PCR反应缓冲液通过聚合酶链式反应进行相应检测。其中,使用的PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)反应程序中PCR循环时的退火温度应该低于正向及反向引物的Tm(DNA的解链温度)值。对有效扩增的情况下,样品检测结果可信,否则试验需要重复。

本发明细胞cDNA芯片的检测方法包括以下步骤:

利用聚合酶链式反应体系,聚合酶链式反应体系中包含由细胞株或原代细胞提取的cDNA(所有样本的cDNA经过精确的定量和均一化),及一对特异性管家基因的上游引物和下游引物。

反应的基本步骤如下:首先,将cDNA芯片从-20℃中取出,置于室温1min,在离心管中配置反应体系溶液;然后去掉cDNA芯片的封膜,将上述混合液混匀后,以20μl/孔加入cDNA阵列中;用新的封膜将cDNA芯片封住,注意一定要仔细贴紧,封好后,将孔板放置于冰上15min,使得冻干的cDNA充分溶解,轻轻震荡后,2000-6000rpm离心1min;将孔板放入PCR仪,设定好程序,进行PCR实验,经过变性打开DNA双链,根据引物的Tm值选择合适的退火和延伸温度进行DNA的退火和延伸,此过程中上下游引物会特异的与cDNA的目的区域结合,并进行核苷酸链式聚合反应,最后进行荧光收集;由此,通过实时荧光定量的方法来检测目的基因的表达;最后,通过计算目的基因与管家基因△Ct值的方法得到目的基因的差异表达情况。

以检测癌症相关基因Fibulin5的差异表达的一个例子进行说明:首先,根据本方法特点,设计合成Fibulin5的引物。按本发明的制备方法由15种肺腺癌细胞株中获得cDNA模板并制备成cDNA芯片。以管家基因β-actin为内参,引物参照SEQ ID NO:1-2序列合成。扩增程序如下:(1)PCR扩增体系:按照以下方法配置PCR反应液。(2)PCR扩增程序如下:按照以下方法进行PCR扩增,PCR反应条件为:95℃预变性10分钟,95℃15秒,58℃40秒,扩增反应40循环,在60℃40秒阶段收集荧光。

结果分析如下:参照图1和图2,根据△Ct值[(癌症样本Ct值-内参Ct值)]比较基因Fibulin5在不同细胞株中的表达水平。由图1可知,该细胞cDNA芯片中15种肺腺癌细胞株经qPCR检测管家基因β-actin的Ct值波动≤2,说明通过本发明的制备方法所制得的细胞cDNA芯片的均一化程度高,组间实验误差小,筛选细胞株的准确性高。由图2可以很直观的看出,扣除内参后肺腺癌细胞株D6中基因Fibulin5的表达水平明显高于其他细胞株,本方法可以一次性筛选多种细胞株,可用于细胞株的高通量筛选。

综上所述,上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 上海芯超生物科技有限公司

<120> 一种细胞cDNA芯片及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

gaagagctac gagctgcctg a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

cagacagcac tgtgttggcg 20

<210> 3

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

gaagagctac gagctgcctg acggccaggt catcaccatt ggcaatgagc ggttccgctg 60

ccctgaggca ctcttccagc cttccttcct gggcatggag tcctgtggca tccacgaaac 120

taccttcaac tccatcatga agtgtgacgt ggacatccgc aaagacctgt acgccaacac 180

agtgctgtc 189

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