脐带血再生粒子及组合物在治疗大脑退行性疾病中的用途的制作方法

文档序号:15457415发布日期:2018-09-15 01:29

本发明涉及生物医学领域,尤其是组织细胞学、再生医学、疾病治疗等领域,尤其涉及脐带血再生粒子及其组合物在治疗大脑退行性疾病中的用途。



背景技术:

脑退行性疾病是一类严重危害人类健康的病变,主要引起脑中枢神经系统特定神经元不正常死亡萎缩,导致脑神经功能严重缺陷,认知或运动障碍,这种损害是不可逆转的,会随着时间的推移而恶化,最终导致脑功能障碍。

脑退行性疾病包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)、多发性硬化症(MS)、Pick病、老年性抑郁症、手头震颤及其他脑萎缩症(BA)等。其中阿尔茨海默病和帕金森病是患病率最高的两种疾病,两个病在中国总计有800万患者左右。

随着我国人口老龄化趋势的加剧,脑缺血、中风以及老年痴呆、帕金森等神经系统损伤和退行性疾病的患病比例不断增高。

对于老年性脑退行性疾病的治疗,传统的药物治疗、手术治疗都很难发挥作用,而再生医学具有明显的优势。药物治疗往往通过干预某些信号通路来发挥作用,而再生医学则是再生细胞替代损伤的组织,从根本上治愈疾病。

再生医学是指利用生物学及工程学的理论方法创造丢失或功能损害的组织和器官,使其具备正常组织和器官的机构和功能。

近年来,外源性细胞疗法逐渐成为了脑退行性疾病治疗的新策略。外源性细胞治疗主要是通过引入干细胞等来恢复退化的神经元网络和认知功能。这些干细胞可以作为细胞输送系统,利用旁分泌机制来达到修复的目的。另一种思路是利用干细胞的分化和促进神经回路再生的功能来达到治疗的目的。这是一个精细的、复杂的、多步骤的过程。

寻求一种安全并且有效的再生医学治疗方法或者是细胞制剂,是目前治疗脑退行性疾病的一个热点,也是未来药物研究开发的一个重要方向。



技术实现要素:

基于背景存在的技术热点问题,本发明提供了一种安全的治疗剂或组合物,该治疗剂或组合物可以有效的延缓和治疗大脑退行性疾病。

本发明的技术方案如下:

脐带血再生粒子作为最新研究发现的干细胞前体活性物质,可以通过人体血液循环系统,到达大脑的不同部位,受所在部位微环境的刺激和影响,可以通过自我不断聚集和融合及组核,发育为大脑干/祖细胞,并进一步分化为大脑颗粒细胞、神经元细胞等,进而有效的缓解因年老而引起的脑衰退,为进一步治疗大脑退行性疾病提供了一条全新的方法道路。

本发明的脐带血再生粒子及其组合物可以再生脑颗粒细胞、神经元细胞等。

本发明的脐带血再生粒子及其组合物可以更新大脑干细胞。

本发明的脐带血再生粒子及其组合物可以改善大脑的认知和行为功能。

本发明的脐带血再生粒子及其组合物特别应用于阿尔茨海默病的治疗之中。

本发明的脐带血再生粒子及其组合物还特别应用于帕金森病的治疗之中。

本发明的脐带血再生粒子及其组合物还特别应用于老年性抑郁症的治疗之中。

本发明的脐带血再生粒子及其组合物还特别应用于大脑萎缩症的治疗之中。

为此,本发明第一方面提供了脐带血再生粒子作为治疗剂用于治疗大脑退行性疾病或者用于再生脑细胞和延缓脑衰退的治疗用途。

根据本发明第一方面的治疗剂,其中所述的脐带血再生粒子,有如下特征:

所述脐带血再生粒子是来源于脐带血的再生粒子。

所述脐带血再生粒子的直径大小范围为1-5μm。

所述脐带血再生粒子含有微量DNA成分。

所述脐带血再生粒子表达Oct3/4,Nanog,Sox2等蛋白。

所述脐带血再生粒子在用于哺乳动物,例如人,所述脐带血再生粒子的使用剂量是每公斤患者体重用量为(1-10)x109个脐带血再生粒子。例如每公斤患者体重用量为1x109个脐带血再生粒子,每公斤患者体重用量为5x109个脐带血再生粒子,每公斤患者体重用量为10x109个脐带血再生粒子。

进一步的,本发明第二方面提供了一种用于治疗大脑退行性疾病或者用于再生脑细胞和延缓脑衰退的治疗剂,其呈组合物的形式,该组合物主要包括脐带血再生粒子液和注射用缓冲溶液。

根据本发明第二方面的组合物,其中所述的脐带血再生粒子液,有如下特征:

所述脐带血再生粒子液是来自于脐带血。

所述脐带血再生粒子液中的脐带血再生粒子的直径大小范围为1-5μm。

所述脐带血再生粒子液中的脐带血再生粒子含有微量DNA成分。

所述脐带血再生粒子液中的脐带血再生粒子表达Oct3/4,Nanog,Sox2等蛋白。

所述脐带血再生粒子液在用于哺乳动物,例如人,所述脐带血再生粒子液的使用剂量是每公斤患者体重用量为(1-10)x109个脐带血再生粒子。例如每公斤患者体重用量为1x109个脐带血再生粒子,每公斤患者体重用量为5x109个脐带血再生粒子,每公斤患者体重用量为10x109个脐带血再生粒子。

根据本发明第二方面的治疗剂,其中所述注射用缓冲溶液在用于哺乳动物时,例如人,所述治疗剂中的注射用缓冲溶液是0.9%的氯化钠注射液。

根据本发明第一方面及第二方面的用途,其所用的脐带血再生粒子可以采用本领域已知的方法来制备。例如通过脐带血获得的脐带血再生粒子,可以参照中国专利申请号CN201610871433.3中的方法获得。

本发明的有益之处在于:

本发明提供了一种脐带血再生粒子及其组合物在制备用于治疗大脑退行性疾病或者用于再生脑细胞和延缓脑衰退的治疗剂中的用途。研究发现,本发明治疗剂可以有效的治疗大脑退行性疾病,特别是用于再生脑细胞的治疗和改善大脑认知和行为功能的治疗。

附图说明

图1:脐带血再生粒子在培养基中培养时所呈现的形态;

图2:切片染色图;图2A-2B为7天的切片染色图,其中2A为非特异抗体蛋白染色,图2B为GFP抗体蛋白染色;图2C-2D为4周的切片染色图,其中2C为非特异抗体蛋白染色,图2D为GFP抗体蛋白染色;图2A-2D是2.5倍透镜下拍摄的;带状样模式分布在图2B和2D中被箭头指出。

图3:大脑部分共表达GFP、nestin和DAPI。

图4:新形成的再生粒子融合成的颗粒样结构。

图5:小鼠大脑再生粒子状况示意图,其中,图5A为再生粒子分散在5天的大脑部分的一个圆形区域;图5B为在8天的大脑部分,大多数再生粒子在圆形区域彼此连接形成树突状样结构。

图6:大的细胞结构或者前神经元细胞共表达GFP和nestin。

图7:GFP和nestin共表达的长的原始的纤毛样结构。

图8:4周的大脑部分共表达的nestin和Oct4。

图9:小鼠找到水下平台的概率情况。

图10:小鼠找到水下平台的潜伏期情况。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述,而本发明的范围并不局限下述实施例。

本发明对实验中所用到的材料及实验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,但是本发明仍在此作尽可能详细的描述。

实施例1

脐带血再生粒子的制备

在本实施例中,示例性说明了脐带血再生粒子的制备。

血源:把脐带血采集到含抗凝剂的血袋中,抗凝剂是血袋中原有的枸橼酸钠,通过冷链运输方式(温度保持在2到8℃)将脐带血运到制备实验室。

条件:获取脐带血再生粒子的处理过程需要全程无菌操作。

具体步骤如下:

(1)取脐带血进行200g离心,离心时间为10分钟,离心后分为两部分,上层溶液A和下层沉淀A。

(2)取下层沉淀A,按体积比为1:2-5加入PBS轻微洗涤,进行200g离心,离心时间为10分钟,离心后分为两部分,上层溶液B和下层沉淀B。

(3)取下层沉淀B,按体积比为1:5-10加入红细胞裂解液置于水平摇床,摇动20分钟,之后进行2000g离心,离心时间为10分钟,离心后分为两部分,上层溶液C和下层沉淀C,上层溶液C弃掉。

(4)取下层沉淀C,按体积比为1:5-10加入PBS剧烈晃动,晃动时间为2分钟,之后进行200g离心,离心时间为10分钟,离心后分为两部分,上层溶液D和下层沉淀D,下层沉淀D弃掉。

(5)分别取上层溶液A、上层溶液B、上层溶液D,进行5000g离心,离心时间为10分钟,离心后,收集所有沉淀。

(6)将收集到的沉淀置于MEM的培养基(含20%的混合脐带血血清)进行培养,培养条件为37℃,5%CO2培养箱中,每2-3天更换培养基一次。

(7)将培养10天的培养基收取,进行5000g离心,以富集脐带血再生粒子(再生粒子形态见图1)。

实施例2

再生粒子迁入损伤的大脑半球呈带状模式

实验组通过尾静脉注射实施例1获得的再生粒子(GFP标记)到缺血性脑损伤的小鼠,对照组注射生理盐水。

在7天的时候,对照组大脑的切片部分都是GFP阴性(图2A),但是在GFP抗体反应部分呈GFP阳性(图2B)。在4周的时候,对照组部分大脑的连续部分都是GFP阴性(图2C),但是在GFP抗体反应部分呈GFP阳性(图2D)。7天的时候,整个大脑部分显示几乎所有的左半球组织是缺血和损伤的,并且是增强得和扩大的。GFP阳性的物质呈带状模式(见图2B箭头所示)排列围绕在损伤的半脑球。

实施例3

再生粒子形成颗粒状细胞

实验组通过尾静脉注射实施例1获得的再生粒子(GFP标记)到缺血性脑损伤的小鼠,对照组注射生理盐水。

再生粒子迁移进入脑组织之后,他们首先是融合成一个无核的细胞样结构,之后再进一步形成有核细胞。高倍显微观察进一步证实来自于毛细血管的再生粒子(见图4的宽箭头所示)在形成颗粒细胞之前先融合在一起,并进一步发育形成新的颗粒状细胞。

实施例4

再生粒子形成树突状神经元

实验组通过尾静脉注射实施例1获得的再生粒子(GFP标记)到缺血性脑损伤的小鼠,对照组注射生理盐水。

在缺血损伤的大脑,分散的再生粒子相互连接融合形成纤维样结构,并进一步形成树突状表达的神经元。在5天的大脑部分,一组再生粒子分散在一个圆形的区域内(见图5A)。个别的再生粒子可能被清晰的确定。然而,在8天的大脑部分,多数再生粒子彼此链接呈树突状样结构在一个圆形的区域,与此同时一小部分仍然呈分散的模式(见图5B)。2周之后,我们确认有核的大的细胞结构或者前神经元细胞共表达GFP和nestin(见图6)。

实施例5

再生粒子参与更新大脑干细胞

再生粒子可以彼此连接形成长的纤维样结构以产生新的细胞。我们观察到一个GFP和nestin共表达的长的原始的纤毛样结构(见图7)正在释放弱DAPI染色小的细胞在两端(在DAPI中箭头所示),这个表明长的纤毛样结构可能更新新的细胞。

为了进一步证实这些nestin表达的细胞是干细胞,我们采用共聚焦显微镜检查了在一个4周的大脑部分共表达的nestin和Oct4(见图8),发现那些nestin共定位区域表达Oct4,因此他们是干细胞。

实施例6

再生粒子明显改善脑痴呆小鼠的认知和行为功能

在本实施例中,实验共分为3组:SAMR1组,SAMP8-盐水组,SAMP8-再生粒子组。SAMR1组不作任何处理,SAMP8-盐水组给予0.15ml生理盐水尾静脉注射处理/月,SAMP8-再生粒子组给予0.15ml再生粒子尾静脉注射处理/月。

小鼠找到水下平台的概率情况中,在0个月时,SAMP8-盐水组与SAMP8-再生粒子组都比SAMR1组显著低,SAMP8-盐水组与SAMP8-再生粒子组之间无差异。在6个月时,SAMP8-盐水组与SAMP8-再生粒子组都比SAMR1组显著低,SAMP8-盐水组比SAMP8-再生粒子组显著低(见图9)。

小鼠找到水下平台的潜伏期中,在0个月时,SAMP8-盐水组与SAMP8-再生粒子组都比SAMR1组显著高,SAMP8-盐水组与SAMP8-再生粒子组之间无差异。在6个月时,SAMP8-盐水组与SAMP8-再生粒子组都比SAMR1组显著高,SAMP8-盐水组比SAMP8-再生粒子组显著高(见图10)。

以上两个实验表明,再生粒子可明显改善脑痴呆小鼠的认知和行为功能。

以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

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