猪繁殖性状相关CDC42基因分子标记的克隆及其应用的制作方法

文档序号:15457574发布日期:2018-09-15 01:33
本发明属于猪分子标记制备
技术领域
,具体涉及一种猪繁殖性状相关CDC42基因分子标记的克隆及其应用。所述的分子标记与猪猪繁殖性状如窝产仔数和初生重性状关联。所述的分子标记从猪CDC42基因中克隆得到,它包括猪CDC42基因3′UTR序列突变位点的检测方法与应用。
背景技术
:在养猪业中,初生重性状、窝产仔数性状是猪经济价值的重要体现,如何提高母猪窝产活仔数和仔猪初生重在实际生产中显得尤为重要。母猪胎盘功能是影响母猪产仔数和仔猪初生重的重要因素,在妊娠过程中,猪胎盘通过形成胎盘褶皱这种独特的方式来增加母胎之间的交换面积,提高胎盘转运营养物质的能力。因此,猪胎盘褶皱的发育对胎儿的生长和发育具有重要调控作用,进而影响母猪的繁殖性状。胎盘褶皱发育是一个系统过程,多种基因、通路参与其中,协同完成。滋养层上皮细胞作为胎盘褶皱发育中的关键性细胞,在胎盘褶皱形态变化过程中,滋养层细胞受细胞外基质、细胞增殖、细胞迁移等生物学过程相关基因的调控。现有研究表明,在胎盘褶皱发育的不同时期,miRNA通过对细胞迁移、细胞增殖和细胞外基质等通路相关靶基因的调控,从而影响胎盘褶皱的发育。miRNA通过与靶基因3’UTR中顺式元件结合,发挥对靶基因转录后调控的作用。当SNP位于顺式元件中miRNA所结合位点时,SNP位点的不同基因型会影响miRNA与靶基因的结合效率,从而影响miRNA对靶基因的调控作用。因此,鉴定并验证能够影响胎盘褶皱发育相关miRNA调控功能的SNP对母猪繁殖性状的育种改良具有重要意义。CDC42是Rho家族中一种鸟嘌呤三核苷酸酸酶(GTPases),在鸟嘌呤核酸交换因子(GEFs)的刺激下,可以从非活化的GDP结合形态转化为活化的GTP结合形态,发挥着分子开关的功能,调控着多种细胞的功能,如细胞形状、极性、迁移、入侵和增殖等过程(SinhaandYang2008,Ridley2015)。活化的CDC42会引起细胞中细胞骨架中的微管和微丝重组,有助于细胞伪足的形成,调控细胞定向迁移。其在胚胎的发育、乳腺的发育、肾管的发育和肿瘤细胞的转移中具有重要的作用(StengelandZheng2011,Brayetal.2013,Eliasetal.2015)。在CDC42敲除的小鼠中,胚胎在E5.5天死亡,其胚胎表现为形状更小、外胚层中E-钙粘素、α环联蛋白和β环联蛋白无法在正常部位表达,上皮细胞极性缺失(DuquetteandLamarche-Vane2014)。在人类胎盘形成时,受前列腺素E2和内皮素刺激的滋养层细胞,在CDC42的参与下进行细胞迁移(Nicolaetal.2008,Liuetal.2012)。鉴于以上研究我们认为CDC42基因可能在猪胎盘褶皱发育和形成过程中发挥着关键性的作用,而对基因突变的多态性位点在群体中的进行关联分析是研究基因功能的一个有力的方法,所以申请人对CDC42基因进行了多态性和关联分析,以期为猪的繁殖性状提供新的分子标记。技术实现要素:发明的目的在于克服现有技术的缺陷,获得猪繁殖性状相关CDC42基因分子标记的克隆及其应用。猪繁殖性状包括猪窝产仔数性状和仔猪初生重相关性状,本发明的分子标记从猪CDC42基因中克隆得到,它包括猪CDC42基因3′UTR序列突变位点的检测方法与应用。本发明通过建立寻找突变位点以及基因多态性的检测方法,为猪窝总产仔数性状和仔猪初生重性状检测提供关联标记及其筛选方法。本发明的技术方案如下:一种分子标记Hpy188III-RFLP在猪繁殖性状关联分析中的应用,所述的应用步骤如下所述:根据NCBI数据库里猪CDC42基因的cDNA序列(GeneBankAccession:XM_005656039.3)设计引物,正向引物:5′-TGCCAAGAATAAACAGAAGCCTA-3′,反向引物:5′-TTGTGAAGGGTTTTTTGTTTGTTTAATAC-3′(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)然后提取猪胎盘组织总RNA并做cDNA第一链反转录,克隆得到CDC42基因的部分cDNA片段,通过PCR产物纯化克隆和测序,获得如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列,序列长度为1612bp。根据SEQIDNO:2所示的核苷酸序列设计引物对,该引物的核苷酸序列如下所示:正向引物:5′-TGGGTGGAACCTGTCTTGCC-3′(见序列表SEQIDNO:3),反向引物:5′-AAGCATTGGTTCAACACTA-3′(见序列表SEQIDNO:3),通过PCR扩增、PCR产物纯化和测序,通过序列分析获得如下所述的核苷酸序列(序列长度为682bp,下划线部分是引物序列):TGGGTGGAACCTGTCTTGCCCCTCCTCTTTTCTAGGATGCACTATATATGTGACTGTGACTTTCAAGGAAATTTGTTTGCCATTTGCTAATTTTTTTTGAAGTTAATTTCTAACTTCTTTCACTGATAAATGAAGAAAAGTATTGCACCTYTTGAAATACACCAAATGGATTGAGTACGTAATTAAAAAACATTTTTTTTTTCCCTGTCAGTCATTGTCTTAATATGCTTAGCATAGACGTGCAGCTTAATAGTGTGAGATCTGGTGTTCCTAGAACACAGCTGAAGACCTGGTATATAGAGGAAATCCGAGGGGTGGTGCTAGAAGACAGATGTCTACGGATGATTCACATCCTCTTCCAAGTTATGAGGATGGAGACCTGCTTCATTAAGAAGCTGGGGGTGGGGTGGGGGTGGGGAGAACATTTAACAACATGGGGACCAGTCAGGGGAATCCCCTTATTTCTGTTTTGCATATGAGGAACCCTAGAGCAGCCAGTTGAGGCTCTCTAGTTTAATAAAACTCCTGGGGAGAGTCTTATGCAGACTCTTCGTAAGTGTTAATAGGGATTTTATCAGCTTATTTTGGTTGCAGTTTCCAATTTTTAAAAATGTTAGGTTATCTTCCCCACCTTCCCCAAATCCTAATTCTTGTAGATTTCATTAGTGTTGAACCAATGCTT上述序列151位的Y是T或C,该突变导致Hpy188III-RFLP多态性;(3)检测突变位点位于CDC42基因的3’UTR区,该区域与miR-18a相结合,申请人构建CDC42的CC基因型和TT基因型psiCHECK-2双荧光素报告酶载体。将miR-18a以及载体共转染PK15细胞,双荧光素酶报告实验验证突变位点显著影响miR-18a和CDC42的结合效率。miR-18a和NC的序列:ssc-miR-18a:5’-UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUA-3’,NC(negativecontrol):5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。(4)对CDC42基因和miR-18a在褶皱发育过程中表达模式分析(5)定位CDC42基因的蛋白在猪胎盘组织中的表达位置。(6)应用PCR-RFLP方法对序列表的第151位碱基进行检测,然后进行基因型与窝产仔数和初生重性状的关联分析。SNP发现与检测方法建立:申请人设计了扩增引物,扩增了包含该SNP的CDC42基因3’UTR区。在扩增的682bp的片段上,存在一个Hpy188III的酶切位点,电泳检测结果显示在CDC42基因的T/C位点存在3种基因型,TT基因型(682bp),TC基因型(682bp、531bp、151bp),CC基因型(531bp、531bp)。酶切电泳结果证实了CDC42基因3’UTR该突变位点的存在。同时利用qRT-PCR技术分别检测了miR-18a和CDC42在猪胎盘褶皱发育中的胎盘中表达模式,结果表明(如图3所示),miR-18a在猪胎盘褶皱形成期(妊娠50天)的胎盘中显著下调表达,在褶皱扩展期(妊娠95天)的胎盘中为上调表达模式,而CDC42在猪胎盘褶皱形成期(妊娠50天)的胎盘中显著上调表达,在胎盘褶皱扩展期(妊娠95天)的胎盘中为下调表达模式,该结果表明miR-18a与CDC42在胎盘褶皱发育中的胎盘中呈现出相反的表达模式,因此,申请人推测miR-18a可能通过对CDC42的调控从而对影响胎盘皱褶的发育。另外,运用免疫组化技术检测CDC42蛋白在母胎界面的表达模式,结果表明如图4所示。在胎盘褶皱起始期(妊娠26天),CDC42表达于子宫内膜上皮细胞和胎盘滋养层细胞中,在胎盘褶皱形成期(妊娠50天),主要分布在胎盘褶皱侧部和顶部的滋养层细胞中,而在胎盘褶皱扩展期,表达于胎盘褶皱滋养层细胞中,在子宫内膜上皮细胞中则没有表达。上述结果说明,CDC42可能促进胎盘褶皱的形成和发育,而胎盘褶皱的发育可以增加胎盘的大小,缩短母体和胎儿毛细血管的距离,从而有利于胎儿的生长和发育(Valletetal.,2007;Milesetal.,2009)。附图说明序列表SEQIDNO:1是本发明制备的分子标记的核苷酸序列(第151位的碱基由A突变为T,该处的碱基是突变后的碱基T),序列全长为682bp,在该序列的第151bp处的Y是T或C突变,该突变导致Hpy188III-RFLP多态性。序列表SEQNO:2是CDC42部分cDNA序列(长度为1612bp,,包含了CDC42基因的3′UTR部分序列。序列表SEQIDNO:3是检测分子标记SEQIDNO:1的正向引物序列。序列表SEQIDNO:4是检测分子标记SEQIDNO:1的反向引物序列。序列表SEQIDNO:5是扩增CDC42基因片段的正向引物序列。序列表SEQIDNO:6是扩增CDC42基因片段的反向引物序列。图1:本发明技术流程图。图2:本发明中猪CDC42基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段,即本发明制备的分子标记(下划线部分序列为引物序列,其中英文字母Y代表突变位点(位于151碱基处),等位基因的突变以Y(T/C)表示)。图3:猪胎盘组织CDC42和miR-18a表达量qPCR检测结果,附图标记说明:纵坐标表示目的基因转录水平的相对表达量,横坐标表示猪的不同妊娠时期。图4:CDC42基因在猪不同妊娠时期胎盘的免疫组化结果。附图标记说明:棕色显示的为阳性信号,颜色越强表示表达量越高;编号D26、D50、D95、NC分别表示妊娠第26天、50天、95天和阴性对照;Tr:滋养层细胞;LE:腔上皮细胞;GE:腺上皮细胞。图5:本发明中CDC42基因Hpy188III-RFLP的三种基因型(TTTCCC)电泳结果。附图标记说明;图5中的泳道M:DNA分子量标准(DL2000,购自宝生物工程大连有限公司)。具体实施方式实施例1CDC42基因的克隆(1)引物设计用NCBI里提供的猪CDC42基因的3′UTR序列作为参考序列设计如下所述的引物进行PCR扩增,该引物对的核苷酸序列如下所述:扩增CDC42基因片段的引物组合序列:正向引物:5′-TGCCAAGAATAAACAGAAGCCTA-3′反向引物:5′-TTGTGAAGGGTTTTTTGTTTGTTTAATAC-3′(2)PCR产物的克隆和测序将纯化后的PCR产物与pMD-18T载体(购自宝生物工程大连有限公司),在4℃水浴过夜连接;无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5mlEpendorff管中,将5μl的连接产物加入混匀,在冰上放置30min,42℃热激90s,冰浴3-4min,加入400μl无抗生素的LB液体培养基,于37℃振荡培养45min。取100μl上述LB涂布于异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)X-gal的琼脂平板上,于37℃平放1h后倒置培养。挑取平板上的单菌落,接种于2-3mlLB中,于37℃,300r/min培养过夜。用1.5mlEP管12000r/min离心30秒收集菌体制备少量质粒。测序后得到一条长度为如SEQNO:2所示的CDC42部分cDNA序列(长度为1612bp,,包含了CDC42基因的3′UTR部分序列。实施例2CDC42基因片段在胎盘组织中的免疫组化试验(1)猪胎盘组织样品采集选取妊娠母猪(品种为大白猪,来自华中农业大学精品猪场),在妊娠后第26、50、95天分别屠宰采集猪胎盘组织样品。(2)石蜡组织切片制作取组织在10%中性福尔马林固定液中固定48h左右,然后修整组织块,再将组织快放入组织框内,用自来水冲洗过夜,再用蒸馏水浸泡10min。将组织在低浓度酒精到高浓度酒精中依次浸泡,即70%、80%、90%、95%(Ⅰ、Ⅱ)、无水乙醇(Ⅰ、Ⅱ)中各2h。组织放入二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)中直至透明,时间约为各15min。透明结束的组织依次放入60℃石蜡(Ⅰ、Ⅱ)中各1h。在包埋时,将液体包埋蜡倒入包埋框,放入组织轻轻按下,使切面朝下,位置放正。包埋好的蜡块用莱卡切片机制作厚度约4μm的连续切片,将切好的薄片置于37℃温水中,待其充分展平后,迅速用防脱载玻片将薄片捞出。(3)石蜡切片的免疫组织化学试验石蜡切片用60℃烘箱中烘烤1h,然后依次放入二甲苯(Ⅰ)和二甲苯(Ⅱ)中脱蜡,分别浸泡15min。已经充分脱蜡的切片再依次放入到无水乙醇(Ⅰ)中15min,无水乙醇(Ⅱ)15min,95%乙醇(Ⅰ)中5min,95%乙醇(Ⅱ)5min,90%乙醇5min,80%乙醇5min,70%乙醇5min,最后放入蒸馏水中5min。然后,将切片放入3%H2O2在室温下孵育,然后用常规磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,每次洗5min。将孵化后的切片进行抗原修复,采用用微波修复法:即向抗原修复盒中加入0.01M枸橼酸盐缓冲液(来源或配置方法),先用家用微波炉于高火下至煮沸,自然冷却至室温。然后再放入PBS中洗涤3次,每次5min。向玻片滴加兔血清封闭液,室温下作用30min,弃去多余液体,然后直接滴加稀释好的一抗(Anti-CDC42抗体,购自艾博抗(上海)贸易有限公司,按说明书操作)孵化。孵化好一抗后,用PBS洗涤切片3次,每次5min。然后滴加生物标记的二抗(羊抗兔二抗,购自武汉博士德生物工程有限公司,按说明书操作),室温孵育30min,再用PBS洗涤切片3次,每次5min。最后滴加SABC显色,在显微镜下观察结果。(4)免疫组化定位结果结果表明(如图4所述),在胎盘褶皱起始期(妊娠后第26天),CDC42基因片段表达于猪子宫内膜上皮细胞和胎盘滋养层细胞中,在胎盘褶皱形成期(妊娠后第50天),主要分布在胎盘褶皱侧部和顶部的滋养层细胞中,而在胎盘褶皱扩展期(妊娠后第95天),CDC42基因片段表达于胎盘褶皱滋养层细胞中,在子宫内膜上皮细胞中则没有表达。这个结果说明在猪胎盘褶皱的发育过程中CDC42基因片段始终胎盘滋养层上皮细胞中表达实施例3PCR-RFLP诊断方法的建立(1)设计了如下所示的引物组合正向引物:5’-TGGGTGGAACCTGTCTTGCC-3’,反向引物:5’-AAGCATTGGTTCAACACTAA-3’。(2)PCR扩增条件PCR反应总体积为10μl,其中猪基因组DNA约100ng,5μlPCRMix,正向引物、反向引物(来自本实施例)各0.2μl。PCR扩增程序:94℃5min,循环32次94℃30s,60℃30s,然后72℃15s,最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测,得到682bp特异扩增片段(即SEQIDNO:1)。测序结果发现该151bp片段存在一个Hpy188III酶切位点,该处即为多态性位点。(3)PCR-RFLP检测条件PCR产物酶切反应体积是10μl,其中1×buffer1μl,PCR产物3μl,限制性内切酶Hpy188III为0.5μl(1U),用H2O补足至10μl,将样品混匀后离心,37℃水浴1h,用3%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果,记录基因型,在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示,当第151bp位置是T时,则该Hpy188III酶切位点不存在,Hpy188III酶切后检测结果只有1个片段,长度是541bp(定为等位基因T);但存在T151→C151替换时,其结果导致第151bp处一个Hpy188III酶切位点的产生,得到2个片段,长度分别为531bp和151bp(定为等位基因C),三种基因型TT、TC、CC如图5所述。实施例4本发明的分子标记在猪繁殖性状(窝产仔数)标记性状关联分析中的应用本实施例关联分析所用的实验猪群来自中国广西自治区某猪场的大白猪,包括654头母猪,并对全部母猪进行基因型检测,确定其基因型。繁殖性状取自上述猪场2016-2017年的繁殖记录资料,记录母猪繁殖性状包括总产仔数(TNB)、产活仔数(NBA)、仔猪初生重均匀度(CV)和母猪初生重(BW)等。根据采集样本的繁殖记录信息和群体结构,本发明运用混合线性模型来统计分析CDC42基因SNP位点的基因型效应及其与产仔数性状的关系。采用SAS软件对该突变位点的多态性进行性状分析,具体模型如下:Yijkl=μ+genei+parityj+mate_seasonk+eijklY为性状值,μ为总体均数,其中固定效应包括:基因型效应genei;随机效应包括:胎次效应parityj,配种季节效应seasonk;eijkl为随机误差。对大白猪CDC42基因Hpy188III-RFLP多态性位点进行性状关联分析,该突变位点分型猪样本数为654头母猪,包括57个CC基因型的母猪,产仔175窝;253个CT基因型的母猪,产仔708窝;344个TT基因型的母猪,产仔787窝。运用关联分析方法,发现此SNP与经产母猪(3胎及以上)的总产仔数有极显著关联(P<0.01),其中TT和CT基因型母猪的总产仔数均显著高于CC基因型母猪。结果见表1。表1猪CDC42基因SNP位点与经产母猪(3胎及以上)总产仔数的关联分析结果基因型头数总产仔数(头)CC5711.94±0.31CT25312.49±0.23TT34412.90±0.24F检验0.006CC-CT0.0500P值CC-TT0.0016CT-TT0.0651注:表1中性状值为平均数±标准误,P<0.05代表有显著性差异,P<0.01代表有极显著差异。实施例5本发明的分子标记在仔猪初生重整齐度标记性状关联分析中的应用本实施例关联分析所用的实验猪群来自中国广西省某猪场的大白猪,其中丹系母猪353头,美系母猪176头,合计529头母猪,并对全部母猪进行基因型检测,确定其基因型。繁殖性状取自猪场2016-2017年的繁殖记录资料,记录繁殖性状包括第一胎母猪总产仔数(TNB)、产活仔数(NBA)、仔猪初生重整齐度(CV)等主要性状。。根据采集样本的繁殖记录信息和群体结构,本发明运用混合线性模型来统计分析CDC42基因SNP位点的基因型效应及其与仔猪初生重整齐度的关系。采用SAS软件对该突变位点的多态性进行性状分析,具体模型如下:Yijkl=μ+genei+sow_linej+mate_seasonk+eijklY为性状值,μ为总体均数,其中固定效应包括:基因型效应genei;随机效应包括:胎次效应sow_linej,配种季节效应seasonk;eijkl为随机误差。对大白猪CDC42基因Hpy188III-RFLP多态性位点进行性状关联分析,该突变位点分型猪样本数为529头母猪,其中TT型293头,CT型195头,CC型41头。将基因型和仔猪初生重整齐度关联分析,发现此SNP与大白母猪第一胎仔猪初生重整齐度(CV)有显著关联(P<0.05),其中CT型母猪所产仔猪的整齐度极显著好于TT型母猪(P<0.01)。表2猪CDC42基因SNP位点与母猪第一胎仔猪初生重整齐度的关联分析结果基因型头数变异系数(CV)CC410.187±0.014CT1950.171±0.007TT2930.193±0.006F检验0.041CC-CT0.278P值CC-TT0.714CT-TT0.012注:表2中性状值为平均数±标准误,P<0.05代表有显著性差异,P<0.01代表有极显著差异。实施例6本发明的分子标记在母猪初生重标记性状关联分析中的应用本实施例关联分析所用的实验猪群来自中国广西自治区某猪场的大白猪,包括母猪,其中丹系母猪547头,美系母猪264头,合计样本811头母猪,并对全部母猪进行基因型检测,确定其基因型。母猪初生重性状取自上述猪场2016-2017年的繁殖记录资料,记录信息包括母猪同窝产仔数、母猪初生重(BW)和猪品系等。据采集样本的繁殖记录信息和群体结构,运用混合线性模型来统计分析CDC42基因SNP位点的基因型效应及其与母猪初生重性状的关系。采用SAS软件对该突变位点的多态性进行性状分析,具体模型如下:Yijklm=μ+genei+sow_linej+number_of_littermatek+gene*sow_linem+eijklmY为性状值,μ为总体均数,其中固定效应包括:基因型效应genei,品系效应sow_linej;协变量:母猪同窝产仔数number_of_littermatek;互作效应:基因型和品系的互作gene*sow_linem;eijklm为随机误差。表3猪CDC42基因SNP位点与母猪初生重的关联分析结果基因型头数初生重(kg)CC611.32±0.047CT2981.38±0.019TT4511.31±0.020F检验0.027CC-CT0.281P值CC-TT0.719CT-TT0.008注:表中性状值为平均数±标准误,P<0.05代表有显著性差异,P<0.01代表有极显著差异。对大白猪CDC42基因Hpy188III-RFLP多态性位点进行性状关联分析,该突变位点分型猪样本数为811头母猪,其中TT型451头,CT型298头,CC型61头。将母猪初生重和基因型做关联分析检测,发现此突变与母猪初生重性状有显著关联(P<0.05),其中CT型母猪初生重极显著高于TT型母猪初生重(P<0.01),但CT型母猪初生重和CC型母猪初生重没有显著差异。序列表<110>华中农业大学<120>猪繁殖性状相关CDC42基因分子标记的克隆及其应用<141>2018-04-09<160>6<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>682<212>DNA<213>猪(Susscrofa)<220><221>gene<222>(1)..(682)<220><221>mutation<222>(151)..(151)<400>1tgggtggaacctgtcttgcccctcctcttttctaggatgcactatatatgtgactgtgac60tttcaaggaaatttgtttgccatttgctaattttttttgaagttaatttctaacttcttt120cactgataaatgaagaaaagtattgcaccttttgaaatacaccaaatggattgagtacgt180aattaaaaaacattttttttttccctgtcagtcattgtcttaatatgcttagcatagacg240tgcagcttaatagtgtgagatctggtgttcctagaacacagctgaagacctggtatatag300aggaaatccgaggggtggtgctagaagacagatgtctacggatgattcacatcctcttcc360aagttatgaggatggagacctgcttcattaagaagctgggggtggggtgggggtggggag420aacatttaacaacatggggaccagtcaggggaatccccttatttctgttttgcatatgag480gaaccctagagcagccagttgaggctctctagtttaataaaactcctggggagagtctta540tgcagactcttcgtaagtgttaatagggattttatcagcttattttggttgcagtttcca600atttttaaaaatgttaggttatcttccccaccttccccaaatcctaattcttgtagattt660cattagtgttgaaccaatgctt682<210>2<211>1612<212>DNA<213>猪(Susscrofa)<220><221>gene<222>(1)..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再多了解一些
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