一种检测C3orf21基因片段表达量的试剂盒的制作方法

文档序号:15457549发布日期:2018-09-15 01:32

本发明涉及生物医药领域,具体为一种检测C3orf21基因片段表达量的试剂盒。



背景技术:

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位。非小细胞型肺癌包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌和大细胞癌,非小细胞型癌症状与小细胞癌症状相比,其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚,而数据显示非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%,约75%的患者发现时已处于中晚期,5年生存率很低。因此如何可以在早期发现非小细胞型癌症,并及时进行治疗,可以最大程度上的提高癌症患者的生存率。

研究发现,非小细胞肺癌的转移、侵袭与Notch信号通路的应激表达有着密切的关系,而促使Notch信号通路产生应激作用,需要Notch蛋白受体与相对应的配体相互作用。在这一相互作用位点受到诸多化学修饰,其中最关键的一个修饰酶为木糖苷木糖基转移酶(XXYLT1)。为此,通过监测修饰酶的状态来进行非小细胞肺癌预测具有可行性。

进一步研究发现,编码木糖苷木糖基转移酶(XXYLT1)的基因C3orf21存在2个SNP位点,结合突变位点与临床病例样本分析,C3orf21的突变与非小细胞肺癌的发病风险密切相关。通过细胞及病例研究表明,C3orf21基因突变与非小细胞肺癌的转移、预后密切相关。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一种检测C3orf21基因片段表达量的试剂盒,该试剂盒通过鉴定非小细胞肺癌样本与对应的癌旁样本或者正常样本中C3orf21基因片段表达量的差异变化,在体外判断非小细胞肺癌的预后情况。

为了实现上述发明目的,本发明采用了以下技术方案:一种检测C3orf21基因片段表达量的试剂盒,C3orf21基因片段上包括两个分别标记为a位点和b位点的SNP位点,所述试剂盒通过检测C3orf21基因上的a位点和b位点来检测C3orf21基因片段表达量:

所述试剂盒针对a位点的引物及相应探针:homo rs2131877

上游:CTGGCCTTCAGGACCTAC

下游:CTGCCTGTAACCTCAAAGA

探针:CGGAGAGGTTAAATG

所述试剂盒针对b位点的引物及相应探针:homo rs952481

上游:TAAATGGGAAGGAAATGGTT

下游:CGACTTAATTGATTGGGAGC

探针:GCTAACCAGCCAGAGAG

优选的,所述试剂盒检测C3orf21基因片段表达量的方法为基础PCR-测序联合法。

优选的,所述试剂盒采用library preparation and target enrichment kits试剂盒作为基础试剂盒。

优选的,所述C3orf21基因片段序列如序列表中SEQ ID No1。

与现有技术相比,采用了上述技术方案的一种检测C3orf21基因片段表达量的试剂盒,具有如下有益效果:

本发明提供一种检测C3orf21基因片段表达量的试剂盒,应用该试剂盒通过鉴定非小细胞肺癌样本与对应的癌旁样本或正常样本中C2orf21表达量的差异变化,在体外判断非小细胞肺癌的预后情况,有利于及早发现和在治疗过程中了解非小细胞癌的转移、预后。

附图说明

图1为限制性内切酶分析结果和测序结果分析示意图;

图中:Enzyme:HindIII/BamHI;Expected Size:1200+5.4K;Marker Ladder的货号:SM0331,公司为Thermo Fisher Scientific。

图2为RT-qPCR验证siRNA感染后c3or21基因的表达水平示意图;

图中附图标记:CK、MSTO-211H细胞(未经siRNA感染)组;siRNA、阴性对照siRNA感染MSTO-211H细胞组;siRNA1、siRNA1感染MSTO-211细胞组;siRNA2、siRNA2感染MSTO-211细胞组;siRNA3、siRNA3感染MSTO-211细胞组。

图3为RT-qPCR验证过表达质粒感染后c3or21基因的表达水平示意图;

图中附图标记:CK、MSTO-211H细胞(未经质粒感染)组;NCpc、阴性对照质粒pcDNA3.1感染MSTO-211H细胞组;质粒、c3or21过表达质粒感染MSTO-211H细胞组。

图4为WB验证siRNA和过表达质粒感染后c3orf21蛋白的表达水平(一);

图5为WB验证siRNA和过表达质粒感染后c3orf21蛋白的表达水平(二);

图6为不同处理后细胞CFSE流式分析图;

图中:左上角为%Divided,左下角为Division Index。

图7为MTSO-211H细胞凋亡率示意图;(注:凋亡率%=早期凋亡率%+晚期凋亡率%)。

图中附图标记:CK、MSTO-211H组;siNC组;siRNA、c3orf21-siRNA组;pcDNA组;质粒、c3orf21-过表达质粒组。

图8为MTSO-211H细胞凋亡流式分析图;

图中附图标记:Q2-1:坏死细胞;Q2-2:晚期凋亡细胞;Q2-3:正常细胞;Q2-4:早期凋亡细胞。

图9为RTCA结果示意图;

图中附图标记:a、MSTO-211H组;b、siNC组;c、c3orf21-siRNA组;d、pcDNA3.1组;f、c3orf21-过表达质粒组。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图,对本发明做进一步描述。以下所述是本发明的优选实施方式,对于本领域的普通技术人员来说不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干变型和改进,这些也应视为本发明的保护范围。

实施例1

1、DNA提取

1)取一定量的组织,磨碎后,加TE 0.5ml,转移至匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中

3)加20%SDS 25ml,蛋白酶K(2mg/ml)25ml,混匀

4)60℃水浴1-3hr

5)加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min

6)离心5000g 10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中

7)加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g 10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次

8)加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g 10min,取上层水相到另一离心管

9)加1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀

10)待絮状物出现后,离心5000g 5min,弃上清液

11)沉淀用75%乙醇洗涤离心5000g 3min,弃上清液

12)室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ul TE溶解过夜。

2、DNA纯度的测定和DNA的定量

以相应溶剂为对照(Blank),取2μl DNA溶液于BioDrop检测,观察A260/A280、A260/A230比值及连续波长吸收峰,并计算DNA溶液浓度,判断DNA提取质量:A260/A280>2.0且<2.3,则可以满足后续实验所需。

3、PCR扩增

将2ul DNA加入到PCR扩增试剂中,最后添加1ul上、下游引物混合液,按以下参数扩增

1、95.0℃for 3min

2、95.0℃for 10s

3、54.4℃for 30s

4、72.0℃for 30s

5、GOTO2,40more times

6、72.0℃for 10min

7、4.0℃for forever

4、测序:

以上述PCR扩增产物,使用library preparation and target enrichment kits作为基础测序试剂,混合加入上述两个探针各1等份,使用illumina测序仪检测C3orf21两个SNP位点。

实施例2:siRNA和过表达载体构建

1、NCBI检索c3orf21基因序列;

2、按照检索得到的基因序列进行全基因合成序列;

3、双酶切法将目标序列结合进入pcDNA3、1载体中;

4、限制性内切酶分析,确认表达载体构建成功;

如图1所示的限制性内切酶结果和测序结果分析图,可以得出过表达载体构建成功。

实施例3:siRNA和过表达质粒效果验证

通过QPCR和WB检测转染人肺癌细胞MSTO-211H 48h后c3orf21基因表达量改变来验证siRNA和过表达质粒的效果。

1、取生长状态良好的处于对数生长期的MSTO-211H细胞,分别胰酶消化,离心,血球计数板下计数,铺6cm皿,每孔40×104个细胞,于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养过夜。

2、培养过夜后,按照RNAiMAX说明书,siRNA和RNAiMAX以3ul:6ul的比例进行siRNA转染;按照lipo3000说明书,质粒和lipo3000以5ug:7、5ul的比例进行siRNA转染;48h后收集样本进行QPCR和WB检测。

结果显示:

图2RT-qPCR结果显示,NC组和siRNA1、siRNA2和siRNA3组相比,目的基因c3orf21的表达分别降低了85%、88%和77%;

图3RT-qPCR结果显示,NCpc组和质粒组相比,目的基因c3orf21的表达升高了132倍。

图4和5的WB结果显示,NC组和siRNA组相比,目的蛋白XXYLT1表达siRNA2组下调明显;质粒组与NCpc组相比,目的蛋白XXYLT1表达上调。

siRNA和过表达质粒感染后,基因表达水平和蛋白表达水平均达到预期结果。(预期结果:siRNA干扰后,c3orf21基因水平和XXYLT1蛋白水平下调;过表达质粒感染后,c3orf21基因水平和XXYLT1蛋白水平上调)。

实施例4:CFSE检测细胞增殖

1、用人肺癌细胞MSTO-211H转染c3orf21基因的siRNA和过表达质粒:

取生长状态良好的处于对数生长期的MSTO-211H细胞,分别胰酶消化,离心,血球计数板下计数,铺1块六孔板,每孔30×104个细胞,于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养过夜。

MSTO-211H细胞实验分组均如下:

(1)MSTO-211H组(CK)

(2)siNC组

(3)c3orf21-siRNA组

(4)pcDNA3、1组

(5)c3orf21-过表达质粒组

培养过夜后,按照RNAiMAX说明书,siRNA和RNAiMAX以1ul:3ul的比例进行siRNA转染;按照lipo3000说明书,质粒和lipo3000以2、5ug:3ul的比例进行质粒转染;24h后进行CFSE染色。

2、CFSE染色:

(1)胰酶消化各组细胞,用空白培养基调整细胞浓度至约107个/ml;

(2)加入10uM CFSE染色液,轻轻混匀,在37℃培养箱中培养15-30min;

(3)离心后去上清,加入2ml PBS溶液,再离心后去上清,重复一次;

(4)以10×104个/孔接种六孔板,置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养72h

3、流式检测:

(1)作用72h的细胞用1×PBS清洗两次,去除脱落的细胞及剩余的培养液;

(2)在平皿中加入0、25%的胰酶500μL,37℃、5%CO2饱和湿度恒温培养箱中消化2-3min后,轻轻吹落下细胞,800rpm,离心5min收集细胞;

(3)用1×PBS清洗一次,离心收集细胞;重复一次;

(4)用500ul PBS重悬细胞后,轻柔涡旋,流式上机检测。

如图6所示的CFSE结果来看,SINC和pcDNA组,与CK相比均有一定程度的生长抑制,说明转染对细胞存在一定影响。与SINC组比较,SIRNA组生长减慢明显;与pcDNA组比较,过表达质粒组生长无明显差异。

实施例5:流式检测细胞凋亡

人肺癌细胞MSTO-211H转染c3orf21基因的siRNA和过表达质粒48h后检测各组细胞的凋亡情况。

人肺癌细胞MSTO-211H转染c3orf21基因的siRNA和过表达质粒48h后检测各组细胞的凋亡情况。

1、质粒转染

取生长状态良好的处于对数生长期的MSTO-211H细胞,分别胰酶消化,离心,血球计数板下计数,铺1块六孔板,每孔30×104个细胞,于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养过夜。

MSTO-211H细胞实验分组均如下:

(1)MSTO-211H组(CK)

(2)siNC组

(3)c3orf21-siRNA组

(4)pcDNA3.1组

(5)c3orf21-过表达质粒组

培养过夜后,按照RNAiMAX说明书,siRNA和RNAiMAX以1ul:3ul的比例进行siRNA转染;按照lipo3000说明书,质粒和lipo3000以2.5ug:3ul的比例进行质粒转染;48h后进行凋亡检测。

2、流式检测凋亡

(1)处理后的细胞用1×PBS清洗两次,收集脱落的细胞及剩余的培养液;

(2)在平皿中加入0.25%的胰酶1ml,37℃、5%CO2饱和湿度恒温培养箱中消化2-3min后,轻轻吹落下细胞,2000rpm,离心5min收集细胞;

(3)用1×PBS清洗一次,离心收集细胞;

(4)每管细胞中加入500ul的1×Binding Buffer重悬细胞;

(5)每管细胞中加入5ul的Annexin V-FITC和10ul的PI;

(6)轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育5min;

(7)流式上机检测。

如图7和图8中显示的凋亡结果可知,与siNC组比较,c3orf21-siRNA组凋亡减少7%;与pcDNA3.1组比较,c3orf21-过表达质粒组凋亡增加4%;统计学分析均没有显著性差异。说明c3orf21过表达有促进凋亡的趋势。

实施例6:RTCA检测试验

人肺癌细胞MSTO-211H转染c3orf21基因的siRNA和过表达质粒后进行RTCA检测72h各组细胞的迁移情况。

取生长状态良好的处于对数生长期的MSTO-211H细胞,分别胰酶消化,离心,血球计数板下计数,铺1块六孔板,每孔30×104个细胞,于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养过夜。

MSTO-211H细胞实验分组均如下:

(1)MSTO-211H组(CK)

(2)siNC组

(3)c3orf21-siRNA组

(4)pcDNA3.1组

(5)c3orf21-过表达质粒组

培养过夜后,按照RNAiMAX说明书,siRNA和RNAiMAX以1ul:3ul的比例进行siRNA转染;按照lipo3000说明书,质粒和lipo3000以2.5ug:3ul的比例进行质粒转染;24h后进行RTCA实验。

RTCA实验

(1)CIM板装配及基线测量

a.CIM板装配:在超净台内将CIM上室和下室从包装袋中取出,将CIM夹具放在超净台上,使蓝色标志点位于夹具的左上方,将下室平稳地放到夹具对应的凹槽中。

b.在下室的孔中用多道或单道移液器加入165ul含血清培养基培养基,注意加液时不要产生气泡,使加入的培养基在下室的孔内形成凸出的弯月面。

c.将夹具连同下室沿逆时针旋转90度,将上室中传感器一面置于下室上,注意使上室和下室的孔对齐。放置时注意上、下室贴有蓝点的孔相对应,放置时要避免气泡的产生。将上室放到下室上之后,立即用手向下按压,可听到两次卡扣卡入的声音。

d.在上室中加入30ul无血清培养基,轻拍板四周,使培养基分布均匀。将device置于37℃,CO2浓度为5%的CO2培养箱平衡1h。

e.基线测量:将平衡1h的device置于RTCA DP Analyzer上,开始step 1进行基线检测。

(2)细胞悬液准备

从培养箱中取出六孔板,进行消化,离心后,各实验组配制成实验需要的细胞浓度4×105cells/ml。

(3)将细胞加入CIM板

a.将测好基线的CIM板从DP上取出,在上室孔中加入100μl混合均匀的无血清细胞悬液,使每孔中细胞数目分别为40k。

b.将16CIM板置于超净台中室温放置30min。

c.将16CIM板放到培养箱中的RTCA Station上。

d.在系统自动扫描“Scan Plate”后,开始Step2,间隔15min测量一次,共检测72hr。

序列表

<110> 浙江省肿瘤医院

<120> 一种检测C3orf21基因片段表达量的试剂盒

<130> CN-CN-2017-0953-1

<141> 2018-04-10

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2291

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

msanschrms mnradngram mccncmcdsn ankcggcgcc ggggcaaggg ccgccggcgc 60

cgggacccga gggcccccgc ggcggcaccg cggcgccgcg gccgagcgca gggccccccg 120

aggcgggccc cagcgccggg ccaggcgcgc cgggcgcggc gccccacacg cgcccgcgcg 180

gccgcggcgc ggccgcgcgc ccacacccgg ccaggccggg agacccccag cgccaccaag 240

aggcgaagga ggcccgcgcc ggggccccgc cgcgccccgc cgcccgcgcg gagcagcgcg 300

gggcccgggc gccagccccc ggcgcgaagg ccaagagcgg agggcggcgg gccgggccgg 360

ggacaccacc gcgagagcac caaggcggag cacaagccgc gcgcaggcca aggcccgcgc 420

gcgcgcgcca cgcgcgcccg ccaagcgagg cgcacgaggg caacccaccg gagcgaggag 480

gccagccgcg aggggccaag ggccgcgcgg gagcccgccg cccgccgcgg ccaaggcaag 540

gcacccacga ggcggcgacg gaaagccccc cacgggaggc cagcagaagc accaggcggc 600

gggaaccaca caggacccac cccccggcgc cagcacagac agcccaaaga gaccgcagac 660

acagcggacc agaccgaaga agaccaacac cgggagggag gaagacagcc gccaggcgcc 720

acacggcaag cccgggagag cagccagaca ggcacacacg gcagccgcca gagaaccccc 780

agacccgggg ggggcccgcc ccccgagggg cgccgggcca acagcggggg aggcgaaccg 840

gaggccagcg ccagccccgc cacagccgcc gcggagccgg cgcagggcag cagcggccga 900

caagaccacc cgcggccacc cggggaccag gacccaccag acggcaggag caccccaagc 960

cccaggcgga cgaccggaac cggcagcggc accggggagg gaccaggcac aggacgccga 1020

ggccacaggg gagggccacg caagacacca cgggaacgca acaccccacc cggaggacag 1080

gcgccccccg ccgccccggg gccccagacg ggggaaggac agggccggga cagacccaag 1140

ggcaggcgac ccgcagagag acaccgcagg gaagccggaa agggcgagac cccgccgggc 1200

aggcacggcg aggccacccg ccaaggacgg ccggcacgcg ggcgggacca ccccagggag 1260

caggcgacac aaaggacacg cagccagggg cgggaagcaa gcacgaagag aaggaagggg 1320

agaaagggcc cccgcgcgcc cgaggaagga aaccagaccc ggccggacca aaaaaaaaaa 1380

gacagcccca cgagaaagac aaacagaacg cagcacccac gagccccaaa cgggaaggaa 1440

gccaaggaag accagcccag acaagcccaa acgaagccag cccacacaac cacccgggag 1500

gcgcgcacgc gcacccgagc cacgcacggg aggcaggacg cccgaggaag gaccaggacc 1560

aacggggccg caaagaaaac accaaagaga ccacagcgac cccagcacac cagaacccca 1620

gccaccacca aaccagccca gggaccagac caccagaaag caaacgcaca aagaacagag 1680

acggccacca cgaggacagc aggagaacgc gggaccagga agaccaccaa aaaggagccc 1740

aggccgggca cagcgcaagc cgaacccaac acgggagacc gaggcggggg acgagagccc 1800

ggaggcgaga cagccgggaa acacagggag gcccccacgc acaaaaaaaa aaagccaggg 1860

ggggcggcgg cccggcacgg gaggcgaagg ggagggggcg agccaggagc acgcacgagc 1920

ggacacacca cgcacccagc cggacgacag aggagacgcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

ccaaaaagga acccagcaac ccaagggacc aggggcggaa gacagcacca gggcagaagc 2040

acagcgaaaa aaccccacaa ccacgagacc gagaccagca gaaaaaagcg cgcgaggggc 2100

cccgacgagg cgcagacgga aagccccagg ggccagacaa cacggggaca acgccccaga 2160

ggaggaagca aaaacacgag aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220

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aaaaaaaaaa a 2291

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