本发明属于生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法。
背景技术：
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，是芽孢杆菌属的一种，属革兰氏阳性菌。常作为发酵表达特定蛋白的表达菌，如蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶及核苷酸酶生产；也可作为一种益生性细菌直接利用细菌菌剂，尤其该菌能以芽孢状态耐受氧化、酸碱和高温(120℃温度下存活20分钟以上)，使其适应一些严苛的环境条件而体现出独特优势。因此枯草芽孢杆菌在酶制剂发酵、饲料添加、生物肥生产、污水处理、有机废弃物处理等多领域都具有广泛的应用。
通过对自然界中枯草芽孢杆菌的分离筛选及遗传改良，已有多种枯草芽孢杆菌的标准菌种，如纳豆工业生产菌种的枯草芽孢杆菌亚种bacillussubtilissubsp.subtiliscicc23916、药用菌种bacillussubtiliscicc10275(中国工业微生物菌种保藏管理中心)等。更有大量生产用枯草芽孢杆菌菌种在生产中发挥其独特功能，如李晶晶等从牛瘤胃中分离的枯草芽孢杆菌yb-6、包文庆等分离的降解超富集植物的枯草芽孢杆菌bs-c3、余贤美等分离的防治柿树炭疽病的枯草芽孢杆菌bs-15等。加之枯草芽孢杆菌作为安全的生产菌，还是基因工程表达外源蛋白质的良好受体，一大批转基因枯草芽孢杆菌得以培育并应用于目标蛋白质(酶)的发酵生产。
对于直接利用菌剂作为商品应用形式的制剂，很容易使珍贵菌种扩散流失。生产商为了保护自身利益，常采取一些专门技术防范菌种的扩散流失。如利用抗生素抗性保种、逃逸性质粒选择、特定营养物质依赖等措施。然而，上述方法的技术含量不高，易于通过抗生素筛选、选择压力加持或添加特定营养物简单破解。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法，包括以下步骤：
1)、基因编辑法定向突变和/或敲除生产枯草芽孢杆菌的特定营养基因，构建基因编辑载体；
2)、将构建的基因编辑载体转化到目标枯草芽孢杆菌，筛选成功基因编辑的特定营养物依赖型菌作为生产菌；
3)、针对特定营养物筛选出分泌步骤2)所述特定营养物的普通枯草芽孢杆菌，作为营养菌；
4)、分别培养所述生产菌与营养菌，作为菌剂生产发酵的种子菌。
5)、将营养菌和生产菌混合进行菌剂生产的规模培养即得。
优选地，本发明所述的枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法中，所述枯草芽孢杆菌的特定营养基因包括简单营养物合成代谢相关酶的基因。
优选地，本发明所述的枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法中，所述枯草芽孢杆菌的特定营养基因包括氨基酸合成酶基因、核苷酸合成酶基因或生物素合成酶基因的一种或几种。
优选地，本发明所述的枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法中，所述基因编辑法包括采用crispr-cas9系统针对特定营养基因的基因编辑方法。
优选地，本发明所述的枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法中，所述步骤4)中所述营养菌的培养基分别为基本培养基；所述生产菌的培养基为丰富培养基或者添加所述特定营养物的基本培养基。
优选地，本发明所述的枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法中，所述目标枯草芽孢杆菌为商业化的枯草芽孢杆菌。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.商业菌剂有两种枯草芽孢杆菌组成，通过简单的抗生素筛选、基本培养基和丰富培养基的筛选，难以得到生产菌，具有了一定的加密性；
2.生产菌与营养菌的配合发酵，不会增加菌剂的生产成本；
3.对菌剂的商品性不会产生显著影响。
本发明采用基因编辑法对重要商用价值的枯草芽孢杆菌生产菌进行特定营养物质合成基因的定向突变和敲除，可以有效培育出特定营养物质依赖型的生产菌菌种，降低商业菌剂中菌种扩散和流失的风险。同时培育出与其互补的枯草芽孢杆菌营养菌，进行互补式菌剂发酵生产，保证生产的便利和有效。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌基因编辑的crispr-cas9载体结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂制备例1
步骤一、基因编辑载体构建：针对枯草芽孢杆菌bacillussubtilissubsp.subtilisatcc6051赖氨酸合成酶基因进行基因编辑敲除。
按照crispr-cas9的基因编辑原理，根据枯草芽孢杆菌赖氨酸合成关键酶(二氢吡啶-2,6-二羧酸合成酶dapb)基因的dna序列，设计一段基因编辑引导的gdna(seqidno1：tgatgcctcaaaatatcccgataggcagtcgtaaattgaa)，克隆到枯草芽孢杆菌转化质粒的启动子pδglva下游构建基因编辑载体(重组质粒)。载体上带有枯草芽孢杆菌转化的抗生素抗性选择标记(ampr)和cas9酶基因。
步骤二、转化：将商用枯草芽孢杆菌在丰富培养基(lb肉汤培养基：酵母粉5g/l、胰蛋白胨10g/l、nacl10g/l，ph7.0)中37℃、200r/min摇瓶培养到对数生长后期，od600＝1.0左右。离心4000g1min收集枯草芽孢杆菌，0.1xssc(nacl、柠檬酸钠、柠檬酸ph6.0)悬浮枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌后再离心收集枯草芽孢杆菌。每1ml摇瓶枯草芽孢杆菌对应悬浮在0.1ml的0.1xssc溶液中，加入0.1μg的步骤一的重组质粒。进行低剂量紫外线(1毫焦/平方厘米，波长260nm)照射30秒。
步骤三、转化菌筛选：将步骤二中的转化后的枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌摊铺到lb固体培养基(lb液体培养基加15g/l琼脂粉)，其中添加50μg/ml浓度的氨苄青霉素。培养皿倒置37℃培养过夜。得到的枯草芽孢杆菌进行赖氨酸缺陷型筛选。
步骤四、赖氨酸依赖型枯草芽孢杆菌的筛选：以基本培养基和添加了50μg/ml赖氨酸的基本培养基进行枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌的对照培养，将步骤三得到的枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌菌落，对照接种到上述两种培养基上，37℃过夜培养后观察枯草芽孢杆菌的生长情况。选择能在添加赖氨酸培养基上有效生长而不能在基本培养基上生长的枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌。
步骤五、验证基因的编辑敲除：通过pcr方法扩增枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌目标基因dna序列，经过测序分析确定基因是否被有效编辑敲除。获得生产菌。
步骤六、筛选产赖氨酸的普通枯草芽孢杆菌：从猪肠道食糜中分离枯草芽孢杆菌，对枯草芽孢杆菌产赖氨酸能力进行鉴定，选择产赖氨酸能力较强的菌株进行进一步菌种改良，建立起营养菌菌株(bacillussubtilisyb83，欧荣娣等高产赖氨酸枯草芽孢杆菌的选育，中国饲料，2014.20)。也可以采用其他菌种库中保存菌种。
步骤七、生产菌和营养菌种子培养：在添加赖氨酸的基本发酵培养基的种子罐培养经过基因编辑的枯草芽孢杆菌生产菌；平行培养普通枯草芽孢杆菌的营养菌种子。按照10:1比例混合两种种子菌后进行常规生产发酵，获得的枯草芽孢杆菌即制得枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂。
实施例2：枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂制备例2步骤一、基因编辑载体构建：针对枯草芽孢杆菌商用枯草亚菌(bacillussubtilissubsp.subtilisatcc6051)的生物素合成酶基因、赖氨酸合成关键酶基因同时进行基因编辑敲除。两种目标基因编辑敲除可以同时进行，也可以分步完成。
分步完成即在实施例1基础上，针对枯草芽孢杆菌生物素合成酶基因序列设计gdna(seqidno1：atgcggtcaacattaagaaaagaccttattgaattattttctcaggccgg)，构建生物素合成酶基因编辑敲除载体。同时编辑敲除则是在载体构建时，将生物素合成酶基因(seqidno2，枯草芽孢杆菌生物素合成酶bira基因dna序列(genbanknc000964.3)和赖氨酸合成酶基因(seqidno3，枯草芽孢杆菌赖氨酸合成关键酶dapb基因dna序列，genbankef191518.1)的序列设计成两个引导dna(如上述seqidno1)进行合成和克隆到编辑质粒上。引导gdna克隆到枯草芽孢杆菌中能转录该gdna的启动子(pδglva)和表达cas9的基因和元件的质粒，构建基因编辑载体(见附图1)。载体上带有枯草芽孢杆菌转化的抗生素抗性选择标记(ampr)。
步骤二、转化：将商用枯草芽孢杆菌在丰富培养基(lb培养基)中37℃、200r/min摇瓶培养到对数生长后期，od600＝1.0左右。离心4000g1min收集枯草芽孢杆菌，0.1xssc(nacl、柠檬酸钠、柠檬酸ph6.0)悬浮枯草芽孢杆菌后再离心收集枯草芽孢杆菌。每1ml摇瓶枯草芽孢杆菌对应悬浮在0.1ml的0.1xssc溶液中，加入0.1μg的重组质粒。进行低剂量(1毫焦/平方厘米，波长260nm)紫外线照射30sec。
步骤三、转化菌筛选：将步骤二中的枯草芽孢杆菌摊铺到lb固体培养基，其中添加50μg/ml浓度的氨苄青霉素。培养皿倒置37℃培养过夜。得到的枯草芽孢杆菌进行生物素和赖氨酸缺陷型筛选。
步骤四、生物素和赖氨酸依赖型枯草芽孢杆菌的筛选：以基本培养基和添加了生物素20μg/ml、赖氨酸50μg/ml的基本培养基进行枯草芽孢杆菌的对照培养，将步骤三得到的枯草芽孢杆菌菌落，对照接种到两种培养基上，37℃过夜培养后观察枯草芽孢杆菌的生长情况。选择能在添加生物素和赖氨酸培养基上有效生长而不能在基本培养基上生长的枯草芽孢杆菌。
步骤五、验证基因的编辑敲除：通过pcr方法扩增枯草芽孢杆菌目标基因dna序列，经过测序分析确定两个目标基因是否被有效编辑敲除。获得生产菌。
步骤六、筛选产赖氨酸和生物素的普通枯草芽孢杆菌：从猪肠道中分离枯草芽孢杆菌，对枯草芽孢杆菌产赖氨酸和生物素能力进行鉴定，选择产赖氨酸能力较强的菌株进行进一步菌种改良，建立起营养菌菌株。
步骤七、生产菌和营养菌种子培养：在添加赖氨酸和生物素的基本发酵培养基的种子罐培养经过基因编辑的枯草芽孢杆菌生产菌；平行培养普通枯草芽孢杆菌的营养菌种子。按照10:1比例混合两种种子菌后进行常规生产发酵，获得的枯草芽孢杆菌再制成菌剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>湖南农业大学
<120>一种枯草芽孢杆菌互补培养的菌种加密性菌剂生产方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tgatgcctcaaaatatcccgataggcagtcgtaaattgaa40
<210>2
<211>978
<212>dna
<213>bacillussubtilis
<400>2
atgcggtcaacattaagaaaagaccttattgaattattttctcaggccggcaatgaattt60
atttccggccaaaaaatcagtgatgctctcggctgttcaagaactgctgtgtggaagcat120
attgaagagcttcggaaagagggttatgaagtagaagccgttagaagaaaaggatatcgg180
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<211>1017
<212>dna
<213>bacillussubtilis
<400>3
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