本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因突变的引物和方法。
背景技术：
高铁血红蛋白血症是指血中高铁血红蛋白(methemoglobin)水平超过血红蛋白总量1％时的临床状态。按原因分为获得性和遗传性两大类。获得性高铁血红蛋白血症最常见，多为摄入某些氧化(还原)性药物或毒物时的一过性表现。遗传性高铁血红蛋白血症(hereditarymethemoglobinemia，hm)绝大部分为nadh-细胞色素b5还原酶(nadh-cytochromeb5reductase，b5r)的遗传缺陷所致，呈常染色体隐性遗传，故又称隐性先天性高铁血红蛋白血症(recessivecongenitalmethemoglobinemia，rcm)；一小部分由血红蛋白先天异常(即血红蛋白m)引起，一般呈显性遗传。
遗传性高铁血红蛋白血症是一种常染色体隐性遗传病，绝大多数是由患者的nadh-细胞色素b5还原酶遗传缺陷所致。编码b5r的基因全长约31kb，有9个外显子和8个内含子，定位于2号染色体2q13-qter(genbank：nm-00022)，其mrna长1921bp(genbank：nm-000398)。国内外在遗传性高铁血红蛋白血症患者中已发现多种不同的b5r基因突变。
b5r在体内有两种存在形式：胞浆可溶型和膜结合型。前者主要存在于红细胞，是红细胞高铁血红蛋白还原系统的主要成员，其活性占红细胞高铁血红蛋白总还原能力的2/3以上。膜结合型b5r广泛分布于组织细胞，参与多种生物化学活动，如脂肪酸代谢、胆固醇合成、药物生物转化。两种形式的b5r由同一个染色体单基因编码，胞浆可溶型含275个氨基酸残基；膜结合型除含胞浆可溶型的275个氨基酸残基外，氨基端还有一个由25个氨基酸残基组成的膜结合区。编码b5r的基因位于22号染色体，全长31kb，含9个外显子和8个内含子。
b5r缺陷导致的rcm可分成三型：ⅰ型又称红细胞型，以发绀为主要临床表现，b5r活性降低仅限于红细胞，患者能应付较轻的体力劳动，寿命一般不受影响；ⅱ型又称全身型，包括红细胞在内的全身细胞都存在b5r活性下降，临床上除发绀外，还伴有神经精神症状，患者一般在成年前夭亡；ⅲ型为血细胞型，最少见，酶活力下降局限于血细胞。近年文献报道，ⅲ型实际上与ⅰ型是同一类型。
寻找和分析b5r的基因突变类型，有助于阐明该单一基因突变可导致临床上不同遗传性高铁血红蛋白血症表型的分子机制。
本发明采用sanger测序法检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因基因，并且设计的引物分别扩增包含高铁血红蛋白血症cyb5r基因突变位点的dna片段，通过测序结果的分析，可以很直观的了解高铁血红蛋白血症cyb5r基因的突变情况，扩增引物设计时加上了m13接头，并使用m13作为测序引物，简化操作步骤和节约了检测成本。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因全外显子的引物，采用sanger测序法，可用于快速检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因位点突变的情况。
检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因突变的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因的扩增引物和测序引物；其中扩增引物的碱基序列为：
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测序引物的碱基序列为：
m13f：tgtaaaacgacggccagt；
m13r：aacagctatgaccatg。
本发明的第二个目的在于提供一种检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因突变的试剂盒：其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)样品dna抽提试剂；
(2)检测体系pcr反应试剂，包括扩增引物，其碱基序列为：
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cyb5r-e9-r3：aacagctatgaccatgcttccagccacctatcttc；
(3)测序体系反应试剂，包括测序引物，其碱基序列为：
m13f：tgtaaaacgacggccagt；
m13r：aacagctatgaccatg；
(4)阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
进一步地，扩增引物的正、反向引物的浓度比为：1：1。
进一步地，测序引物m13f、m13r的浓度比为：1：1。
所述检测体系pcr反应试剂还包括2×pcrbuffer；dntps；kodfxdnapolymerase。所述测序体系还包括测序纯化液、edta、无水乙醇、75％乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶i。
本发明还提供了检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取样品dna；
(2)利用扩增引物对(1)中的dna分别进行扩增，获得检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因的扩增产物；
(3)利用测序引物m13f与m13r对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型cyb5r基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；
其中扩增引物的碱基序列为：
cyb5r-e1-f：tgtaaaacgacggccagtttcccagtctccatccc；
cyb5r-e1-r：aacagctatgaccatggcgtaagtagcggtcac；
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测序引物的碱基序列为：
m13f：tgtaaaacgacggccagt；
m13r：aacagctatgaccatg。
本发明设计了扩增高铁血红蛋白血症cyb5r基因全外显子的正、反向引物，并创新性的在pcr扩增上游引物前端和下游引物前端分别加了一段长18bp的m13f引物序列和长16bp的m13r引物序列。这样扩增以后的产物两端都会带上所引入的m13f及m13r引物序列，随后进行测序反应的时候，所有的扩增产物可以使用统一的m13f和m13r引物就可以进行正反向测序了。对送检样本进行pcr扩增，采用sanger测序法，对pcr产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因全外显子的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。
有益效果：利用本发明所述扩增引物和测序引物，可以扩增高铁血红蛋白血症cyb5r基因全外显子，通过测序结果的分析，可以很直观的了解高铁血红蛋白血症cyb5r基因位点突变情况，并不受基因突变多样化的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用pcr方法扩增目的基因并测序检测其基因，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
附图说明
图1pcr产物电泳结果。
图2外显子1测序图谱。
图3外显子2测序图谱。
图4外显子3测序图谱。
图5外显子4测序图谱。
图6外显子5测序图谱。
图7外显子6-7测序图谱。
图8外显子8测序图谱。
图9外显子9测序图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因位点的引物，包括：扩增检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因全外显子的10对正、反向引物；所述扩增引物的碱基序列为：
所述引物还包括测序引物，其碱基序列为
m13f：tgtaaaacgacggccagt
m13r：aacagctatgaccatg。
在检测中，先利用上述正、反向引物对高铁血红蛋白血症cyb5r基因的dna片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。
检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因全外显子突变的试剂盒，包括：组织dna抽提试剂盒(例如使用天根生物的提取试剂盒)；无水乙醇；检测体系pcr反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中
检测体系pcr反应液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；检测目的基因用的上、下游引物。
测序体系包括：测序纯化液、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：m13f(3.2μm)与m13r(3.2μm)，以及bigdyeterminatorv3.1(购买自美国appliedbiosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(sap)0.6u和核酸外切酶i(exoni)1.2u。
检测体系pcr反应液配制如下：
阳性对照品：含有cyb5r序列的溶液。
阴性对照品：无cyb5r序列的溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2
血液dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的基因组dna：
1)抽取500ul血液加入1000ul红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200ul缓冲液ga，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm(13，400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12，000rpm(13，400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份18μl分装：
x＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：向pcr反应液中各2μldna；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：
(5)sanger测序：
取9μlpcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与测序引物：m13-f(3.2μm)与m13-r(3.2μm)按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlhidi后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序。
(7)结果判断：将测序结果与野生型参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取临床全血样本2份，检测该2份样本高铁血红蛋白血症cyb5r基因突变的情况。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系pcr反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通pcr仪检测，时间为160分钟。
从图1-图9检测结果可以看出，本发明所述引物能够检测出高铁血红蛋白血症cyb5r基因，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩增出高铁血红蛋白血症cyb5r基因基因，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出高铁血红蛋白血症cyb5r基因基因突变。
序列表
<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120>检测高铁血红蛋白血症cyb5r基因突变的引物、试剂盒和方法
<160>22
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