本发明属生命科学和生物
技术领域：
，特别涉及检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性的引物和方法
背景技术：
：乙醇脱氢酶adh和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2后产生氧化作用，将乙醇氧化成乙醛和乙酸，承担了大部分酒精代谢任务，是人体内最重要的酒精代谢。adh系统的第一步主要是在adh作用下乙醇生成乙醛，80％的酒精氧化是在肝脏中通过该途径进行的；第二步，乙醛在aldh的作用下生成对身体无毒理作用的乙酸，饮酒后血液中的乙醛浓度主要由aldh决定的。肝细胞内的adh和aldh在辅酶i(nad+)参与下对酒精正常生理代谢共同发挥重要作用，多年来一直是人们研究的焦点。但是人体内adh和aldh含量有限，当大量饮酒时，不能及时代谢大量的酒精，引起酒醉。此外，adh和aldh基因呈多态性，个体差异大，导致有的想喝酒的人但不能喝，喝醉的人却不能及时醒酒。adh是一种含金属酶，经寡核苷酸多态snp技术分析，目前已鉴定出的人体adh编码基因至少有6种，它们在肝脏表达最高，也有在肺、消化道、大脑和角膜等器官组织不同程度的表达。乙醇脱氢酶分为3个亚型，其中乙醇脱氢酶1(adh1)中的adh1b是人体乙醇代谢中最主要的同工酶，位于人类染色体4q21-25，长度约为15kb，包含9个外显子，在第3外显子处发生g143a点突变，导致第47位氨基酸由精氨酸变成组氨酸，而使改变后的等位基因编码的酶活性大大增加。人体肝脏中aldh有4种，为同源四聚体，编码基因定位于第12染色体，它们负责大部分乙醛的氧化。aldh1存在于细胞浆中；aldh2，aldh3和aldh4分别存在于不同的细胞器中。其中aldh2具有遗传多态性，等位基因aldh2外显子12发生一个碱基替换，引起aldh2失活。突变基因aldh2(2)对野生型aldh2(1)为显性，这样的aldh2(2)纯合子和杂合子携带者的aldh2均无活性，多见于亚洲人种。这种人饮酒后乙醛不能及时代谢，引起面红、头痛和恶心等不愉快反应而不易酗酒，有力地保护了aldh2(2)携带者。相反，aldh2(1)能及时代谢血中乙醛，饮酒出现轻松愉快感，易成为酗酒人群。目前人类aldh2基因上共发现了84个snp位点,但国内外研究主要集中在rs671snp位点上。根据aldh-2(rs671)的多态性，aldh2有三种基因型:aldh2*1/*1(gg型，野生型)、aldh2*1/*2(ga型，杂合型)、aldh2*2/*2(aa型，突变型)。乙醇脱氢酶1b(alcoholdehydrogenase-1b，adh1b或adh-2)、乙醛脱氢酶2(aldehydedehydrogenase-2，aldh-2)和吸烟、饮酒都是食管癌的独立危险因素。aldh-2(rs671)多态性与心肌梗死ami的发生密切相关，其中等位基因a可能对青年心梗的发生起着促进作用本发明采用sanger测序法检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性，并且设计的引物分别扩增包含乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性位点的dna片段，通过测序结果的分析，可以很直观的了解乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性位点的突变情况，扩增引物设计时加上了m13接头，并使用m13作为测序引物，简化操作步骤和节约了检测成本。技术实现要素：本发明提供检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性位点的引物，采用sanger测序法，可用于快速检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性位点的情况。本发明的目的在于提供检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性的引物，包括：扩增覆盖检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性位点的正、反向引物，其碱基序列为：adh1b-f：tgtaaaacgacggccagtggaatagtagggattagtagc；adh1b-r：aacagctatgaccatgctcctgaagtcctggct；aldh2-f：tgtaaaacgacggccagtcataacccccaagagtgatttc；aldh2-r：aacagctatgaccatgagagcagaggctgggtctttac；引物还包括一对测序引物，其碱基序列为：m13f：tgtaaaacgacggccagtm13r：aacagctatgaccatg。进一步地，所述正、反向引物的浓度比为：adh1b-f:adh1b-r＝1:1,aldh2-f:aldh2-r＝1:1。进一步地，所述测序引物的浓度比为：m13f:m13r＝1:1。本发明的另一个目的是提供检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2多态性位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：(1)样品dna抽提试剂；(2)检测体系pcr反应液；包括扩增覆盖检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性位点的正、反向引物，其碱基序列为：adh1b-f：tgtaaaacgacggccagtggaatagtagggattagtagc；adh1b-r：aacagctatgaccatgctcctgaagtcctggct；aldh2-f：tgtaaaacgacggccagtcataacccccaagagtgatttc；aldh2-r：aacagctatgaccatgagagcagaggctgggtctttac；(3)测序体系反应液，包括一对测序引物，其碱基序列为：m13f：tgtaaaacgacggccagtm13r：aacagctatgaccatg；(4)阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。进一步地，所述检测体系pcr反应液还包括2×pcrbuffer；dntps；kodfxdnapolymerase。进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、edta、无水乙醇、75％乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶i。本发明的目的还在于提供一种非诊断目的的检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取样品dna；(2)利用扩增引物adh1b-f/adh1b-r，aldh2-f/aldh2-r，对(1)中的dna进行扩增，获得盖检测adh1b和aldh2基因多态性的扩增产物；(3)利用测序引物m13f与m13r，对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与野生型adh1b和aldh基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中，扩增覆盖检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性位点的正、反向引物的碱基序列为：adh1b-f：tgtaaaacgacggccagtggaatagtagggattagtagc；adh1b-r：aacagctatgaccatgctcctgaagtcctggct；aldh2-f：tgtaaaacgacggccagtcataacccccaagagtgatttc；aldh2-r：aacagctatgaccatgagagcagaggctgggtctttac；测序引物的碱基序列为：m13f：tgtaaaacgacggccagtm13r：aacagctatgaccatg。本发明设计了扩增乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2多态性位点的正、反向引物，并创新性的在pcr扩增上游引物前端和下游引物前端分别加了一段长18bp的的m13f引物序列和长16bp的m13r引物序列。这样扩增以后的产物两端都会带上所引入的m13f及m13r引物序列，随后进行测序反应的时候，所有的扩增产物可以使用统一的m13f和m13r引物就可以进行正反向测序了。对送检样本进行pcr扩增，采用sanger测序法，对pcr产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2多态性位点的突变情况。通过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。有益效果：利用本发明所述扩展引物和测序引物，可以扩增乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2多态性位点，通过测序结果的分析，可以很直观的了解乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2多态性位点基因突变情况，并不受基因突变多样化的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具有很高的特异性及准确性；采用pcr方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。附图说明图1样品1adh1b的测序结果。图2样品1aldh2的检测结果图。图3样品2adh1b的测序结果。图4样品2aldh2的检测结果图。图5样品3adh1b的测序结果。图6样品3aldh2的检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例1检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2多态性位点的引物，包括：扩增检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2多态性位点的正、反向引物；所述扩展引物的碱基序列为：adh1b-ftgtaaaacgacggccagtggaatagtagggattagtagcadh1b-raacagctatgaccatgctcctgaagtcctggctaldh2-ftgtaaaacgacggccagtcataacccccaagagtgatttcaldh2-raacagctatgaccatgagagcagaggctgggtctttac所述引物还包括测序引物，其碱基序列为m13f：tgtaaaacgacggccagtm13r：aacagctatgaccatg在检测中，先利用上述正、反向引物对乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2的dna片段进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2多态性位点位点的试剂盒，包括：组织dna抽提试剂盒(例如使用天根生物的提取试剂盒)；无水乙醇；检测体系pcr反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系pcr反应液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；检测目的基因用的上、下游引物。测序体系包括：测序纯化液、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：m13f(3.2μm)与m13r(3.2μm)，以及bigdyeterminatorv3.1(购买自美国appliedbiosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(sap)0.6u和核酸外切酶i(exoni)1.2u。检测体系pcr反应液配制如下：阳性对照品：含有adh和aldh序列的溶液。阴性对照品：无adh和aldh序列的溶液。空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。实施例2血液dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：(1)抽提血液中的基因组dna:1)抽取500ul血液加入1000ul红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200ul缓冲液ga，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份18μl分装：x＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)n为检测标本数。(3)加样：向pcr反应液中各2μldna；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：(5)sanger测序：取9μlpcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：将1μl纯化产物分别与测序引物：m13-f(3.2μm)与m13-r(3.2μm)按照如下体系进行混合：测序反应程序：沉淀环节：向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlhidi后进行变性试验。变性程序：变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序。(7)结果判断：将测序结果与野生型参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。实施例3取临床全血样本3份，检测该2份样本酒精代谢相关的两个基因乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2的多态性情况。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系pcr反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通pcr仪检测，时间为160分钟。从检测结果可以看出，本发明所述引物能够检测出乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩增出乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因，无论是野生型还是突变型。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因突变。序列表<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司<120>检测乙醇脱氢酶adh1b和乙醇脱乙醛脱氢酶aldh2基因多态性的引物和方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>39<212>dna<213>人工序列()<400>1tgtaaaacgacggccagtggaatagtagggattagtagc39<210>2<211>33<212>dna<213>人工序列()<400>2aacagctatgaccatgctcctgaagtcctggct33<210>3<211>40<212>dna<213>人工序列()<400>3tgtaaaacgacggccagtcataacccccaagagtgatttc40<210>4<211>38<212>dna<213>人工序列()<400>4aacagctatgaccatgagagcagaggctgggtctttac38<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列()<400>5tgtaaaacgacggccagt18<210>6<211>16<212>dna<213>人工序列()<400>6aacagctatgaccatg16当前第1页12