检测脆性X染色体综合征的试剂盒和系统的制作方法

文档序号:15457537发布日期:2018-09-15 01:32
本发明属于生物和医疗领域,涉及脆性X染色体的检测。
背景技术
:脆性X染色体综合征(FragileXSyndrome,FXS),于1943年由Martin和Bell首次发现,因此又被称为Martin-Bell综合征。它主要表现为智力中度或者重度低下,语言表达能力障碍,行为注意力障碍,癫痫发作等表型。其发病率约1/2500,其中,男性发病率为1/1000,女性发病率为1/2000。而男性智力低下的患者中大概15%是由于该疾病引起的。目前已确认其分子致病基因为FMR1(fragileXmentalretardation1)。该基因在Genbank编号为3129728,定位于染色体Xq27.3,其5端非翻译区有CGG三核苷酸的重复序列,并具有多态性。ACMGguidelines在2006年推出检测FMR1指南,并在2013年进行了指南更新。ACMG依据CGG重复数将FXS分为4种类型:正常型NOR,CGG重复数小于44;中间型INT,CGG重复数介于45-54中间;前突型PM,CGG重复数介于55-200之间;全突型FM,CGG重复数大于200。FXS是一种不完全显性X连锁遗传病,男性的外显率为80%,女性为30%。女性前突变者和约50%全突变者表型正常,而男性全突变者几乎100%表现出不同程度的智力低下。男性前突变者会将突变基因传递给女儿时,CGG序列不会有大的扩增,但是到孙代可能会发展成全突变。FXS是X连锁先天性智力低下中最常见的疾病之一,在智力低下中仅次于唐氏综合征。目前常用的分子生物学检测方法有southernblot,但该技术繁琐费时,需要大量的高质量DNA,不适合做常规的筛查。而PCR方法的引入给FXS的检测带来了很大变革。1991年,Fu等用PCR扩增包括CGG在内的DNA片段,进行琼脂糖凝胶电泳检测,为FXS的检测开拓了新的视野。1996年,Warner等发明了TP-PCR的方式检测DM1基因的动态突变。然而,FMR1基因CGG重复序列高GC,并且部分存在重复数多于200,PCR难以进行有效扩增,也无法通过Sanger测序的方式解决;而普通的琼脂糖电泳鉴定技术无法确定CGG重复数。因此,本领域依然存在准确检测FMR1基因CGG重复序列数量的需求。技术实现要素:本发明的目的是提供一种检测CGG重复度高的序列的新思路,以解决现有技术存在的问题。在第一个方面,本发明提供一种检测脆性X染色体综合征的试剂盒,所述试剂盒包括Q扩增体系试剂和TP扩增体系试剂,其中,Q扩增体系试剂包括扩增引物FMR1-F、FMR1-QR,TP扩增体系包括扩增引物TP、TP-R,其中FMR1-F的序列如SEQIDNO:1~4任一项所示,FMR1-QR的序列如SEQIDNO:5~7任一项所示,TP的序列如SEQIDNO:8或9所示,TP-R的序列如SEQIDNO:10所示。优选地,所述试剂盒中还包括DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、甜菜碱、DMSO和dNTP。进一步优选地,所述DNA聚合酶为KODDNA聚合酶,所述DNA聚合酶缓冲液为KODDNA聚合酶缓冲液。第二个方面,提供检测脆性X染色体综合征的系统,包括本发明的试剂盒和毛细管电泳体系。优选地,所述毛细管电泳体系为ABI3130XL测序仪。进一步优选地,所述系统还包括GeneMarker软件。本发明中,FMR1被检测的参考序列如SEQIDNO:11所示。本发明提供的试剂盒和系统能够进行Q扩增和IP扩增,利用不同引物对对GC重复度高的模板进行检测,优化了扩增体系,结合利用高灵敏度的毛细管电泳,能够检测到200个以上CGG的重复,准确度高。本发明的试剂盒和系统所需要的DNA量少,对DNA纯度要求不高,适合做常规的筛查。附图说明图1为样品A、B、D扩增产物的凝胶电泳图;图2为样品C扩增产物的凝胶电泳图;图3为样品A的GeneMarker图谱;图4为样品B的GeneMarker图谱;图5为样品C的GeneMarker图谱;图6为样品D的GeneMarker图谱。具体实施方式下面将结合具体实施例详细描述本发明,但本发明的内容不限于此,本领域技术人员根据本文描述所作出的不背离本发明精神的改变、修饰都落入本发明保护的范围。如没有明确说明,以下实施例中所使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器,可以通过商购方式获得。如没有明确说明,以下实施例中所使用的方法都是本领域常规方法,技术人员可以根据实施例的描述完成所述实验并获得相应的结果。以下实施例中使用的ABCD四个样品来源于临床高度怀疑脆性X综合征患者,患者已知情同意。实施例1:静脉外周血DNA提取按照以下DNA提取步骤,提取ABCD四个样品的DNA:1、分装400μL红细胞裂解液(QIAGEN,Cat:158904)到1.5mL离心管,分别加入200μL来自四个患者的静脉外周血,混匀;2、56℃孵育10min,其间混匀数次;3、13000g离心1min,弃上清,加入200μL细胞裂解液(QIAGEN,Cat:158906),混匀;4、加入10μL蛋白酶K(QIAGEN,Cat:158918),混匀;5、13000g离心1min,将上清转移至干净的1.5mL离心管中,加入400μL异丙醇,混匀,混匀后可看到DNA沉淀析出;6、13000g离心1min,弃上清,加入400μL70%乙醇漂洗沉淀;7、13000g离心1min,弃上清,重复洗涤一次;8、开盖晾干使乙醇完全挥发,加入100μL无DNA酶/RNA酶的去离子水使沉淀完全溶解;9、使用分光光度计检测DNA浓度,并将其稀释成30ng/μl的DNA样品,备用。实施例2:PCR扩增采用以下表1所示的引物和表2所示的扩增体系对实施例1制备得到的DNA样品进行扩增:表1:引物序列注:FAM表示引物序列5’端进行FAM类型的修饰,FAM:6-羧基荧光素,信号显示颜色蓝色;NO表示序列没有修饰。PCR扩增体系:每个样品进行两管扩增,分别标记为Q体系和TP体系,其中扩增体系分别如下:表2:扩增体系PCR扩增程序如下所示:表3:PCR扩增程序反应完成后,回收扩增产物,备用。对得到的Q方案的产物进行普通琼脂糖凝胶电泳,结果如图1和2所示。由图可知,样品A和B主要产物在400bp,样品C的主要产物为1000bp,样品D的主要产物为400bp。实施例3:对扩增的四个产物按照片段分析流程进行分析1、ABI片段分析1)将Q体系和TP体系产物以体积比2:1的比例混合;2)取1μl混合PCR加入到含有0.2μlLiz1200内标(ABI,Cat:4379950,作为判断样本大小的参照)的9μl甲酰胺中;3)95℃变性4-10min,放入ABI3130XL测序仪进行检测,得到原始毛细管电泳数据。2、数据分析1)打开GeneMarker2.2.0,导入原始毛细管电泳数据;2)点击左上角Project,选择Run;3)在Runwizard界面中选择Panel、SizeStandard、StandardColor进行定义;4)在菜单中设置好X轴的范围为150-1000;5)采用GeneMarker读取数据生成图谱,获取全长片段大小,样品ABCD的图谱分别如图3-6所示。依据峰位置分析CGG重复情况。3、根据测序仪读取CGG重复次数计算:计算公式为Y=2.75X+220.62(R2=0.9998)(X代表重复次数,Y表示片段大小)。并根据表4的依据对重复次数进行判读:表4:判读依据CGG重复次数FMR1基因突变N<45正常型N=45~55中间型N=55~200前突变型N>200全突变型通过计算公式计算每个样品的重复次数。A=39;B=55;C>200;D=84。根据结果判读标准,A为正常型NOR,B为中间型INT,C为全突型FM;D为前突型PM。这个结果与临床最终诊断结果一致。本发明在对基因进行全长扩增的基础上,增加了TP扩增,使得序列中间CGG的重复能够得到很好的直观效果。对于200个重复单元的扩增,由于序列的特殊性,扩增效率较低,采用毛细管代替普通琼脂糖电泳,实现了现有技术无法有效检测该基因高GC含量的问题,准确度得到提高。SEQIDNO:11:ctggcacagggtgcacatacagtaggggcagaaatgaacctcaagtgcttaacacaatttttaaaaaatatatagtcaagtgaaagtatgaaaatgagttgaggaaaggcgagtacgtgggtcaaagctgggtctgaggaaaggctcacattttgagatcccgactcaatccatgtcccttaaagggcacagggtgtctccacagggccgcccaaaatctggtgagagagggcgtagacgcctcaccttctgcctctacgggtcacaaaagcctgggtcaccctggttgccactgttcctagttcaaagtcttcttctgtctaatccttcacccctattctcgccttccactccacctcccgctcagtcagactgcgctactttgaaccggaccaaaccaaaccaaaccaaaccaaaccaaaccagaccagacaccccctcccgcggaatcccagagaggccgaactgggataaccggatgcatttgatttcccacgccactgagtgcacctctgcagaaatgggcgttctggccctcgcgaggcagtgcgacctgtcaccgcccttcagccttcccgccctccaccaagcccgcgcacgcccggcccgcgcgtctgtctttcgacccggcaccccggccggttcccagcagcgcgcatgcgcgcgctcccaggccacttgaagagagagggcggggccgaggggctgagcccgcggggggagggaacagcgttgatcacgtgacgtggtttcagtgtttacacccgcagcgggccgggggttcggcctcagtcaggcgctcagctccgtttcggtttcacttccggtggagggccgcctctgagcgggcggcgggccgacggcgagcgcgggcggcggcggtgacggaggcgccgctgccagggggcgtgcggcagcgcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggaggcggcggcggcggcggcggcggcggcggctgggcctcgagcgcccgcagcccacctctcgggggcgggctcccggcgctagcagggctgaagagaagatggaggagctggtggtggaagtgcggggctccaatggcgctttctacaag<110>北京信诺佰世医学检验所有限公司<120>检测脆性X染色体综合征的试剂盒和系统<130>GW1183127DF<160>11<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1ctcagctccgtttcggtttcacttcg26<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2gctcagctccgtttcggtttcacttc26<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3gtttgctcagctccgtttcggtttcacttccggt34<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>4ggtggagggccgcctctgagcgggc25<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>5ccgcacttccaccaccagctcctccatcttc31<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列(A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