本发明属于生物和医疗领域，涉及脆性x染色体的检测。
背景技术：
：脆性x染色体综合征(fragilexsyndrome，fxs)，于1943年由martin和bell首次发现，因此又被称为martin-bell综合征。它主要表现为智力中度或者重度低下，语言表达能力障碍，行为注意力障碍，癫痫发作等表型。其发病率约1/2500，其中，男性发病率为1/1000，女性发病率为1/2000。而男性智力低下的患者中大概15％是由于该疾病引起的。目前已确认其分子致病基因为fmr1(fragilexmentalretardation1)。该基因在genbank编号为3129728，定位于染色体xq27.3，其5端非翻译区有cgg三核苷酸的重复序列，并具有多态性。acmgguidelines在2006年推出检测fmr1指南，并在2013年进行了指南更新。acmg依据cgg重复数将fxs分为4种类型：正常型nor，cgg重复数小于44；中间型int，cgg重复数介于45-54中间；前突型pm，cgg重复数介于55-200之间；全突型fm，cgg重复数大于200。fxs是一种不完全显性x连锁遗传病，男性的外显率为80％，女性为30％。女性前突变者和约50％全突变者表型正常，而男性全突变者几乎100％表现出不同程度的智力低下。男性前突变者会将突变基因传递给女儿时，cgg序列不会有大的扩增，但是到孙代可能会发展成全突变。fxs是x连锁先天性智力低下中最常见的疾病之一，在智力低下中仅次于唐氏综合征。目前常用的分子生物学检测方法有southernblot，但该技术繁琐费时，需要大量的高质量dna，不适合做常规的筛查。而pcr方法的引入给fxs的检测带来了很大变革。1991年，fu等用pcr扩增包括cgg在内的dna片段，进行琼脂糖凝胶电泳检测，为fxs的检测开拓了新的视野。1996年，warner等发明了tp-pcr的方式检测dm1基因的动态突变。然而，fmr1基因cgg重复序列高gc，并且部分存在重复数多于200，pcr难以进行有效扩增，也无法通过sanger测序的方式解决；而普通的琼脂糖电泳鉴定技术无法确定cgg重复数。因此，本领域依然存在准确检测fmr1基因cgg重复序列数量的需求。技术实现要素：本发明的目的是提供一种检测cgg重复度高的序列的新思路，以解决现有技术存在的问题。在第一个方面，本发明提供一种检测脆性x染色体综合征的试剂盒，所述试剂盒包括q扩增体系试剂和tp扩增体系试剂，其中，q扩增体系试剂包括扩增引物fmr1-f、fmr1-qr，tp扩增体系包括扩增引物tp、tp-r，其中fmr1-f的序列如seqidno:1～4任一项所示，fmr1-qr的序列如seqidno:5～7任一项所示，tp的序列如seqidno:8或9所示，tp-r的序列如seqidno:10所示。优选地，所述试剂盒中还包括dna聚合酶、dna聚合酶缓冲液、甜菜碱、dmso和dntp。进一步优选地，所述dna聚合酶为koddna聚合酶，所述dna聚合酶缓冲液为koddna聚合酶缓冲液。第二个方面，提供检测脆性x染色体综合征的系统，包括本发明的试剂盒和毛细管电泳体系。优选地，所述毛细管电泳体系为abi3130xl测序仪。进一步优选地，所述系统还包括genemarker软件。本发明中，fmr1被检测的参考序列如seqidno:11所示。本发明提供的试剂盒和系统能够进行q扩增和ip扩增，利用不同引物对对gc重复度高的模板进行检测，优化了扩增体系，结合利用高灵敏度的毛细管电泳，能够检测到200个以上cgg的重复，准确度高。本发明的试剂盒和系统所需要的dna量少，对dna纯度要求不高，适合做常规的筛查。附图说明图1为样品a、b、d扩增产物的凝胶电泳图；图2为样品c扩增产物的凝胶电泳图；图3为样品a的genemarker图谱；图4为样品b的genemarker图谱；图5为样品c的genemarker图谱；图6为样品d的genemarker图谱。具体实施方式下面将结合具体实施例详细描述本发明，但本发明的内容不限于此，本领域技术人员根据本文描述所作出的不背离本发明精神的改变、修饰都落入本发明保护的范围。如没有明确说明，以下实施例中所使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得。如没有明确说明，以下实施例中所使用的方法都是本领域常规方法，技术人员可以根据实施例的描述完成所述实验并获得相应的结果。以下实施例中使用的abcd四个样品来源于临床高度怀疑脆性x综合征患者，患者已知情同意。实施例1：静脉外周血dna提取按照以下dna提取步骤，提取abcd四个样品的dna：1、分装400μl红细胞裂解液(qiagen，cat：158904)到1.5ml离心管，分别加入200μl来自四个患者的静脉外周血，混匀；2、56℃孵育10min，其间混匀数次；3、13000g离心1min，弃上清，加入200μl细胞裂解液(qiagen，cat：158906)，混匀；4、加入10μl蛋白酶k(qiagen，cat：158918)，混匀；5、13000g离心1min，将上清转移至干净的1.5ml离心管中，加入400μl异丙醇，混匀，混匀后可看到dna沉淀析出；6、13000g离心1min，弃上清，加入400μl70％乙醇漂洗沉淀；7、13000g离心1min，弃上清，重复洗涤一次；8、开盖晾干使乙醇完全挥发，加入100μl无dna酶/rna酶的去离子水使沉淀完全溶解；9、使用分光光度计检测dna浓度，并将其稀释成30ng/μl的dna样品，备用。实施例2：pcr扩增采用以下表1所示的引物和表2所示的扩增体系对实施例1制备得到的dna样品进行扩增：表1：引物序列注：fam表示引物序列5’端进行fam类型的修饰，fam:6-羧基荧光素，信号显示颜色蓝色；no表示序列没有修饰。pcr扩增体系：每个样品进行两管扩增，分别标记为q体系和tp体系，其中扩增体系分别如下：表2：扩增体系pcr扩增程序如下所示：表3：pcr扩增程序反应完成后，回收扩增产物，备用。对得到的q方案的产物进行普通琼脂糖凝胶电泳，结果如图1和2所示。由图可知，样品a和b主要产物在400bp，样品c的主要产物为1000bp，样品d的主要产物为400bp。实施例3：对扩增的四个产物按照片段分析流程进行分析1、abi片段分析1)将q体系和tp体系产物以体积比2:1的比例混合；2)取1μl混合pcr加入到含有0.2μlliz1200内标(abi，cat：4379950，作为判断样本大小的参照)的9μl甲酰胺中；3)95℃变性4-10min，放入abi3130xl测序仪进行检测，得到原始毛细管电泳数据。2、数据分析1)打开genemarker2.2.0，导入原始毛细管电泳数据；2)点击左上角project，选择run；3)在runwizard界面中选择panel、sizestandard、standardcolor进行定义；4)在菜单中设置好x轴的范围为150-1000；5)采用genemarker读取数据生成图谱，获取全长片段大小，样品abcd的图谱分别如图3-6所示。依据峰位置分析cgg重复情况。3、根据测序仪读取cgg重复次数计算：计算公式为y＝2.75x+220.62(r2＝0.9998)(x代表重复次数，y表示片段大小)。并根据表4的依据对重复次数进行判读：表4：判读依据cgg重复次数fmr1基因突变n<45正常型n＝45～55中间型n＝55～200前突变型n>200全突变型通过计算公式计算每个样品的重复次数。a＝39；b＝55；c＞200；d＝84。根据结果判读标准，a为正常型nor，b为中间型int，c为全突型fm；d为前突型pm。这个结果与临床最终诊断结果一致。本发明在对基因进行全长扩增的基础上，增加了tp扩增，使得序列中间cgg的重复能够得到很好的直观效果。对于200个重复单元的扩增，由于序列的特殊性，扩增效率较低，采用毛细管代替普通琼脂糖电泳，实现了现有技术无法有效检测该基因高gc含量的问题，准确度得到提高。seqidno:11：ctggcacagggtgcacatacagtaggggcagaaatgaacctcaagtgcttaacacaatttttaaaaaatatatagtcaagtgaaagtatgaaaatgagttgaggaaaggcgagtacgtgggtcaaagctgggtctgaggaaaggctcacattttgagatcccgactcaatccatgtcccttaaagggcacagggtgtctccacagggccgcccaaaatctggtgagagagggcgtagacgcctcaccttctgcctctacgggtcacaaaagcctgggtcaccctggttgccactgttcctagttcaaagtcttcttctgtctaatccttcacccctattctcgccttccactccacctcccgctcagtcagactgcgctactttgaaccggaccaaaccaaaccaaaccaaaccaaaccaaaccagaccagacaccccctcccgcggaatcccagagaggccgaactgggataaccggatgcatttgatttcccacgccactgagtgcacctctgcagaaatgggcgttctggccctcgcgaggcagtgcgacctgtcaccgcccttcagccttcccgccctccaccaagcccgcgcacgcccggcccgcgcgtctgtctttcgacccggcaccccggccggttcccagcagcgcgcatgcgcgcgctcccaggccacttgaagagagagggcggggccgaggggctgagcccgcggggggagggaacagcgttgatcacgtgacgtggtttcagtgtttacacccgcagcgggccgggggttcggcctcagtcaggcgctcagctccgtttcggtttcacttccggtggagggccgcctctgagcgggcggcgggccgacggcgagcgcgggcggcggcggtgacggaggcgccgctgccagggggcgtgcggcagcgcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggaggcggcggcggcggcggcggcggcggcggctgggcctcgagcgcccgcagcccacctctcgggggcgggctcccggcgctagcagggctgaagagaagatggaggagctggtggtggaagtgcggggctccaatggcgctttctacaag<110>北京信诺佰世医学检验所有限公司<120>检测脆性x染色体综合征的试剂盒和系统<130>gw1183127df<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctcagctccgtttcggtttcacttcg26<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gctcagctccgtttcggtttcacttc26<210>3<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gtttgctcagctccgtttcggtttcacttccggt34<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggtggagggccgcctctgagcgggc25<210>5<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ccgcacttccaccaccagctcctccatcttc31<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gcacttccaccaccagctcctccat25<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cttctcttcagccctgctagcgccg25<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tcgtatgccgtcttctgct19<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tcgtatgccgtcttctgctt20<210>10<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tcgtatgccgtcttctgctcccgccgccgccgccg35<210>11<211>1099<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ctggcacagggtgcacatacagtaggggcagaaatgaacctcaagtgcttaacacaattt60ttaaaaaatatatagtcaagtgaaagtatgaaaatgagttgaggaaaggcgagtacgtgg120gtcaaagctgggtctgaggaaaggctcacattttgagatcccgactcaatccatgtccct180taaagggcacagggtgtctccacagggccgcccaaaatctggtgagagagggcgtagacg240cctcaccttctgcctctacgggtcacaaaagcctgggtcaccctggttgccactgttcct300agttcaaagtcttcttctgtctaatccttcacccctattctcgccttccactccacctcc360cgctcagtcagactgcgctactttgaaccggaccaaaccaaaccaaaccaaaccaaacca420aaccagaccagacaccccctcccgcggaatcccagagaggccgaactgggataaccggat480gcatttgatttcccacgccactgagtgcacctctgcagaaatgggcgttctggccctcgc540gaggcagtgcgacctgtcaccgcccttcagccttcccgccctccaccaagcccgcgcacg600cccggcccgcgcgtctgtctttcgacccggcaccccggccggttcccagcagcgcgcatg660cgcgcgctcccaggccacttgaagagagagggcggggccgaggggctgagcccgcggggg720gagggaacagcgttgatcacgtgacgtggtttcagtgtttacacccgcagcgggccgggg780gttcggcctcagtcaggcgctcagctccgtttcggtttcacttccggtggagggccgcct840ctgagcgggcggcgggccgacggcgagcgcgggcggcggcggtgacggaggcgccgctgc900cagggggcgtgcggcagcgcggcggcggcggcggcggcggcggcggcggaggcggcggcg960gcggcggcggcggcggcggctgggcctcgagcgcccgcagcccacctctcgggggcgggc1020tcccggcgctagcagggctgaagagaagatggaggagctggtggtggaagtgcggggctc1080caatggcgctttctacaag1099当前第1页12