一种耐热酯酶基因、含有该基因的工程菌及其编码蛋白和应用的制作方法

文档序号:15469487发布日期:2018-09-18 19:56阅读:185来源:国知局
本发明属于生物工程
技术领域
,涉及基因、编码蛋白工程
技术领域
,具体涉及一种耐热酯酶基因、含有该基因的工程菌及其编码蛋白和应用。
背景技术
:酯酶(Esterases,EC3.1.1.X)是一类能够催化酯键水解和形成的酶类,广泛分布于动物、植物和微生物。作为重要的工业用酶,酯酶目前已被广泛应用于医药化工、食品工业、精细化工、生物能源、农业和环境治理等领域。随着酯酶应用范围的不断拓宽,现己成为世界工业酶制剂市场上继蛋白酶、淀粉酶之后第三大工业用酶。但是酯酶工业生产条件较为粗放,因此为了节省生产成本,寻求高热稳定性、高催化效率的酯酶一直是人们努力的目标。链霉菌(Streptomyces)属于放线菌目链霉菌科链霉菌属,是一类存在于土壤中的好氧、丝状、产孢子的革兰氏阳性细菌。链霉菌具有丰富的次级代谢途径,可以产生大量的具有重要经济价值的次级代谢物,如抗生素、水解酶类、酶抑制剂、除草剂和抗肿瘤药物等,是极其重要的工业生产菌。链霉菌基因组的大小为5.5Mb-8.6Mb,约为大肠杆菌基因组的2倍,G+C含量高达70%-74%。链霉菌中含有丰富的酯酶基因,这些序列信息为研究者们提供了丰富的资源,但对它们的研究目前还比较少。研究者可根据这些序列信息克隆相应的酯酶基因,并对它们进行异源表达和酶学性质研究。但由于链霉菌基因的高GC含量及较为复杂的蛋白质翻译系统,使链霉菌的基因在异源宿主中的表达常常受限。目前只有少数种类的酯酶基因在异源表达系统如大肠杆菌(Escherichiacoli)、变铅青链霉菌、酿酒酵母(Saccharomvcescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中获得较好的表达。酯酶基因的非翻译区,酯酶前肽和信号肤的存在、密码子的差异以及不同表达系统表达重组酯酶的糖基化等都会影响酯酶基因的异源表达。特别是大肠杆菌,其作为低等的原核生物,缺乏完善的翻译后修饰系统,酯酶在其中常无法表达或以包涵体形式存在,极少获得活性蛋白。变铅青链霉菌(Streptomyceslividands)TK24全基因组(CompleteGenome)核苷酸序列在GenBank数据库,登录号(Accessionnumber)为CP009124,该基因组大小为8.3Mb,G+C含量高达72.2%。本发明所研究基因为染色体(NZ_CP009124)上的基因座(Locustag)SLIV_RS27090,在染色体上的核苷酸序列起始位点(Start)为6057885,终止位点(Stop)为6058688。依据基因组序列诠释该段核苷酸序列所编码蛋白质产物为酯酶,蛋白质产物(Proteinproduct)编号(Accession)为WP_003976692,在GenBank中的蛋白质登录号为AIJ16329。该段序列全长804bp,起始密码子(Initiationcodon)为TCA,终止密码子(Stopcodon)为CAC,GC含量为72.5%,体现了链霉菌基因组的高GC含量特征。技术实现要素:根据以上现有技术的不足,本发明所要解决的技术问题是提出了一种耐热酯酶基因,含有该基因的工程菌及其编码蛋白和应用,为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:一种耐热酯酶基因,该耐热酯酶基因具有SEQIDNO.1的碱基序列,且能在异源宿主大肠杆菌中成功表达。一种重组质粒,该重组质粒含有所述的耐热酯酶基因的pET-28b(+)重组质粒。一种耐热酯酶基因重组工程菌,该工程菌为大肠杆菌且含有所述的重组质粒表达载体。优选的,该工程菌表达耐热酯酶蛋白的条件为0.01-0.5mM的IPTG诱导浓度及16℃-30℃的诱导温度。一种耐热酯酶基因的编码蛋白,该编码蛋白具有SEQIDNO.2的氨基酸序列。优选的,该编码蛋白的反应温度为30-60℃,反应pH为7-9,100℃下活性半衰期≥6h。优选的,该编码蛋白的反应温度为55℃,反应pH为8.5,100℃下活性半衰期为6h。一种耐热酯酶基因的编码蛋白的应用,该编码蛋白应用在医药、食品和精细化工领域。与现有技术相比,本发明的有益效果:1.本发明将变铅青链霉菌TK24染色体上的基因座SLIV_RS27090核苷酸序列进行优化,获得了核苷酸序列所编码氨基酸保持不变,但804个核苷酸序列中609个核苷酸发生了变化,占整个基因的75.7%,GC含量也由菌株中的原始核苷酸占比的72.5%下降至53.4%,有利于优化基因在大肠杆菌的表达。2.本发明将优化后的基因estA'与pET28b质粒连接,成功构建具Kan抗性的重组表达载体pET28b-estA'。3.本发明将该重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞,成功构建用于estA'表达的基因工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estA',该重组工程菌同时具备Kan和Cam抗性。4.本发明采用Co2+离子亲和层析法及SDS-PAGE电泳,获得高度纯化酯酶蛋白EstA,获得的酯酶蛋白EstA具有高度热稳定性,可应用于医药、食品和精细化工等领域。附图说明1.图1是酯酶estA基因与优化后的estA'的序列比对图;2.图2是SDS-PAGE分析EstA的表达;3.图3是EstA活性与反应pH趋势图;4.图4是EstA活性与反应温度趋势图;5.图5是EstA在55℃下的热稳定性趋势图;6.图6是EstA在100℃下的热稳定性趋势图。M、蛋白质Marker,1、IPTG诱导的粗酶液,2、纯化的EstA蛋白,■、pH6.0-7.0的Na-citratebuffer,●、pH7.0-9.0的Tris-HClbuffer,▲、pH9.0-10.5的KH2PO4-NaOHbuffer。具体实施方式下面通过对实施例的描述,作进一步详细的说明,以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。需要阐明的:本发明将基因座(Locustag)SLIV_RS27090编码酯酶基因命名为estA,优化后的酯酶基因命名为estA',由于estA及estA'所编码蛋白质的氨基酸组成相同,故将其编码的氨基酸统一命名为EstA。实施例中用到的标准测定体系为1mL,由980μL50mMpH8.0的Tris-HCl,10μL0.5mM的对硝基苯酚丁酸酯,10μL的酶液构成。实施例11.对变铅青链霉菌TK24酯酶基因estA进行优化、合成理论指导:变铅青链霉菌TK24酯酶estA基因全长804bp,起始密码子为TCA,终止密码子为CAC;A碱基122个,占比15.2%;T碱基99个,占比12.3%;C碱基297个,占比36.9%;G碱基286个,占比35.6%;GC含量为72.5%,体现了变铅青链霉菌基因组的高GC含量特征。由于estA基因高的GC含量,严重影响该蛋白在大肠杆菌中的表达,且变铅青链霉菌酯酶为次生代谢蛋白,在表达过程中可能需要分子伴侣协助其折叠,因而该基因在大肠杆菌中的表达出现障碍,无法完成在大肠杆菌中的异源表达,为了解决这一问题,在表达相同氨基酸序列的前提下,我们对酯酶estA基因的核苷酸序列进行了优化,尽量降低该基因的GC含量,同时以大肠杆菌偏爱密码子代替其稀有密码子,此外,为使该基因与载体pET-28b(+)连接,在优化后的基因estA'序列上游和下游分别添加NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)对应酶切位点的碱基。由金斯瑞生物科技公司合成。2.优化后酯酶基因的序列分析优化后的酯酶基因estA'全长仍为804bp,但在核苷酸特征方面表现为起始密码子ATG,终止密码子TAA;A碱基162个,占比20.1%;T碱基208个,占比25.9%;C碱基201个,占比25.0%;G碱基233个,占比29.0%。将变铅青链霉菌TK24酯酶estA基因核苷酸序列与优化后的该基因的核苷酸序列estA'进行比对如图1所示,804个碱基中仅有195个碱基保持不变,仅占全部氨基酸序列的24.3%。在GC含量方面,相比原始序列,优化后的碱基GC含量下降至53.4%,从而克服了GC含量过高导致该酯酶无法表达的缺陷,为使优化后的目的基因在大肠杆菌中的异源表达提供了保障。实施例2表达质粒及表达工程菌的构建:对优化后的基因estA'序列和载体pET-28b(+)分别进行NdeI和XhoI对应酶切,酶切条件为37℃,反应6h,酶切体系为:将双酶切的基因estA'与载体pET-28b(+)进行连接,构建表达质粒pET28b-estA'。连接条件为16℃反应过夜,连接体系为:将表达质粒pET28b-estA'与E.coliRosetta(DE3)感受态细胞混合,冰浴30min,中间轻摇数次,防止菌体沉淀,42℃热休克90s,避免摇动,构建重组工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estA',该工程菌具有Kan和Cam抗性,可在具Kan和Cam抗性的LB培养基上筛选重组工程菌。实施例31.EstA的表达挑取重组工程菌于含5mLLB液体培养基的试管中,37℃,225rpm,过夜扩大培养;培养物以1:100接种于含50mLLB液体培养基的锥心瓶中,37℃,225rpm,振荡培养至OD600为0.4-1.0时(最好为0.6);加入低浓度0.01-0.5mM的IPTG,在低温16℃-30℃,180rpm,诱导表达24h;然后在4℃,5000rpm下,离心5min,收集菌体,超声波破碎,得酯酶EstA。2.酯酶EstA的纯化酯酶EstA共有267个氨基酸组成,分子量(MolecularWeight)为28.5kDa,等电点(isoelectricpoint)为6.9,脂肪族氨基酸指数(Aliphaticindex)为96.8%,用Co2+离子亲和层析柱纯化,Co2+离子亲和层析柱纯化使用Clontech公司的Co2+离子亲和柱纯化收集带6个His-tag的融合蛋白EstA,纯化后的蛋白质经12%SDS-PAGE鉴定,该蛋白在对应酯酶EstA分子量处有一特异性很高的条带如图2,说明该蛋白在大肠杆菌中成功获得了异源表达且通过Co2+离子亲和层析柱纯化获得了纯度较高的蛋白,对纯化蛋白进行蛋白质浓度检测,以牛血清蛋白为标准,纯化后的酯酶蛋白浓度为0.807mg/mL。实施例41.EstA最适pH检测EstA的酶活检测采用标准体系,使用可以自动控温的Cary300UV分光光度计,检测波长为410nm,以不加酶的混合液作为对照,反应温度25℃,反应时间5min,在相应的pH范围使用相应的缓冲液,pH6.0-7.0,50mMsodiumcitratebuffer;pH7.0-9.0,50mMTris-HClbuffer;pH9.0-10.5,50mMK2HPO4-NaOHbuffer,检测波长为OD410,试验独立重复3次,结果显示该酶的最适pH是8.5,趋势变化如图3。2.EstA最适温度检测采用标准测定体系,反应pH为8.5,设置反应温度10℃-60℃,试验独立重复3次,取平均值,结果表明该酶的最适温度是55℃,趋势变化如图4。3.酯酶EstA最适底物测定在25℃,pH8.5条件下,采用标准测定体系,检测不同链长C4-C16对硝基苯酚酯类底物的比活力,重组酶活通过对硝基苯酚标准曲线计算得出,一个酶活单位(U)定义为25℃条件下每分钟从对硝基苯酚酯催化产生1μmoL对硝基苯酚所需的酶量,酶比活力单位是U/mg,表示每毫克酶蛋白所具有的酶活力;结果显示底物对硝基苯酚丁酸酯酶的比活力最高,达1409.5U/mg,如下表1所示:表1酯酶EstA的比活力CompoundsSpecificactivity(U/mg)±SDpNPB41409.5±31.5pNPC6760.5±29.6pNPC8580.1±12.2pNPC10566.0±6.7pNPL12523.1±21.4pNPM14393.2±11.1pNPP16286.6±14.14.酯酶EstA热稳定性检测将EstA纯酶在55℃和100℃分别温育一定时间,采用标准测定体系,25℃检测残余酶活,确定热稳定性,以未处理的纯酶活性设为100%。结果表明,该酶在55℃放置337h后酶活性仍无明显变化如图5,100℃下EstA放置5.5h,酶活仍在80%以上,6h以后逐渐达到半衰期如图6。实施例51.金属离子、EDTA和PMSF对EstA酶活的影响在25℃,pH8.5条件下,采用标准测定体系,分别添加金属离子、EDTA和PMSF检测EstA酶活力,所用缓冲液终浓度为50mMTris-HCl,以不加化学试剂的酶活力设为100%,实验独立重复3次,如表2所示,1mM的K+、Fe2+、Mn2+、Ca2+和Na+对酶有较强的激活效应,均可使酶活提高20%以上,尤其是K+、Fe2+和Mn2+可使酶活分别升高53.3%、48.6%和44.2%;Zn2+和Mg2+对酶活也有一定的激活作用,可使酶活分别提高13.7%和11.3%;10mM的K+、Fe2+、Mn2+、Ca2+及Na+对酶仍有一定程度的激活效应,但除Ca2+和Na+对酶的激活效应基本无变化外其他三类离子均随浓度增加有一定程度的降低;10mM的Mg2+对酶的激活效应相对于1mM的Mg2+无显著变化,相对酶活为109.1%;10mM的Zn2+、Cu2+及Ni2+强烈抑制酶活,使酶活分别降至35.2%、34.4%及10.2%;1mM的EDTA和PMSF对酯酶酶活基本无影响,当浓度增加至10mM时,酶活分别降低至86.0%和72.6%。表2金属离子、EDTA和PMSF对EstA活性的影响2.有机溶剂对EstA酶活的影响在25℃,pH8.5条件下,采用标准测定体系,分别不同有机溶剂检测EstA酶活力,所用缓冲液终浓度为50mMTris-HCl,以不加化学试剂的酶活力设为100%,实验独立重复3次,如表3所示,在所有被检测的有机溶剂中,浓度为15%和30%的二甲基亚砜以及浓度为15%的异丙醇对酯酶酶活均无明显影响,但当异丙醇浓度达到30%时,会对酯酶酶活产生强烈的抑制作用,使酶活降至51.6%;15%和30%的乙醇、甲醇、二甲基酰胺都能在一定程度上抑制酶活性,且随其浓度的增加抑制酶活作用增强,但增幅不大;15%和30%的乙腈和丙酮均对酶活有较强的抑制作用,且随其有机溶剂浓度的增加抑制酶活作用也增强。表3有机溶剂对EstA活性的影响3.去垢剂对EstA酶活的影响在25℃,pH8.5条件下,采用标准测定体系,分别不同有机溶剂检测EstA酶活力,所用缓冲液终浓度为50mMTris-HCl,以不加化学试剂的酶活力设为100%,实验独立重复3次,如表4所示,在所有被检测的0.1%的去垢剂中,Span-20对酯酶的酶活具有较强的激活作用,使其增加了37.2%;Tween-20在一定程度上提高了酯酶酶活,但作用效果不甚明显;SDS和TritonX-100对酯酶的活性基本无影响,1%的去垢剂中,Span-20、SDS和CTAB对酯酶的酶活具有强烈的抑制作用,使酶活分别降至30.8%、35.6%和44.2%。表4去垢剂对EstA活性的影响上面结合具体实施例对本发明进行了示例性描述,显然本发明具体实现并不受上述方式的限制,只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进,或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。序列表<110>安徽师范大学<120>一种耐热酯酶基因、含有该基因的工程菌及其编码蛋白和应用<130>2018.04.12<160>2<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>804<212>DNA<213>变铅青链霉菌(Streptomyceslividands)<400>1atgtcagtgttaccgggtgctgaaccatttcgtcatgaaggcggagatgtgggcgtttta60ctgtgtcatggctttacgggttctccacagtctctgcgtccttgggctcgctacttagcc120gcacgcggcctgacagtttcactgccattattaccaggccacggtacacgttggcaggat180atgcaggtgaccggttggcaggattggtatgcagaagtggatcgcgaacttagagccctg240cgcgaacgctgcgaacgagtgtttgttgcgggtctgtcaatgggcggcgcactggccctg300cgcttagcagctaaacatggggatgccgtttcaggcgtggttgtggttaatccggctaac360aagatgcatggcgttgctcaacacgccctgcctgtgctgcgccatttggttccagcgacc420aaaggcatcgcaagcgatattgcaaaacctctgagtacggaactgggctatgatcgtgtt480ccgttacatagcgcacatagcttacgcgccttctttcgtctggccgatggggatctccct540caggtgacacagccactgttattattgcgcagtcctcaggatcatgttgttcctccagcc600gatagtgctcgtatcttaggtcgcgtgtcttctacagatgtgacggaaattctgctggaa660cagagctatcatgtggcaaccttagatcatgatgcagatcgtatctttgctgaatcagtt720gccttcatcggtcgcttagctccgggtagtgtgggtgaaccagaaagcggcttaggcaaa780gaaggaaccgccgccggcggttaa804<210>2<211>267<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichiacoli)<400>2MetSerValLeuProGlyAlaGluProPheArgHisGluGlyGlyAsp151015ValGlyValLeuLeuCysHisGlyPheThrGlySerProGlnSerLeu202530ArgProTrpAlaArgTyrLeuAlaAlaArgGlyLeuThrValSerLeu354045ProLeuLeuProGlyHisGlyThrArgTrpGlnAspMetGlnValThr505560GlyTrpGlnAspTrpTyrAlaGluValAspArgGluLeuArgAlaLeu65707580ArgGluArgCysGluArgValPheValAlaGlyLeuSerMetGlyGly859095AlaLeuAlaLeuArgLeuAlaAlaLysHisGlyAspAlaValSerGly100105110ValValValValAsnProAlaAsnLysMetHisGlyValAlaGlnHis115120125AlaLeuProValLeuArgHisLeuValProAlaThrLysGlyIleAla130135140SerAspIleAlaLysProLeuSerThrGluLeuGlyTyrAspArgVal145150155160ProLeuHisSerAlaHisSerLeuArgAlaPhePheArgLeuAlaAsp165170175GlyAspLeuProGlnValThrGlnProLeuLeuLeuLeuArgSerPro180185190GlnAspHisValValProProAlaAspSerAlaArgIleLeuGlyArg195200205ValSerSerThrAspValThrGluIleLeuLeuGluGlnSerTyrHis210215220ValAlaThrLeuAspHisAspAlaAspArgIlePheAlaGluSerVal225230235240AlaPheIleGlyArgLeuAlaProGlySerValGlyGluProGluSer245250255GlyLeuGlyLysGluGlyThrAlaAlaGlyGly260265当前第1页1 2 3 
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