一种DNA编码技术与纳米孔技术联用的癌症标志物检测方法与流程

文档序号:15457553发布日期:2018-09-15 01:33

本发明涉及一种DNA编码技术与纳米孔技术联用的癌症标志物检测方法。



背景技术:

近年来,肿瘤标志物快速灵敏的检测,在肿瘤的早期临床诊断具有非常重要的意义。对肿瘤标志物的实时检测,可以为临床中的肿瘤的发生、监测、在治疗中对药物的反应、以及预估肿瘤复发概率提供帮助。然而对单一标志物的检测不足以确定某一癌症的发生,癌症的发生常常伴随着多种癌症标志物含量的升高,实现癌症标志物的同时检测可以提高临床上癌症诊断的效率。因此开发高通量核酸和蛋白质检测技术变得愈发迫切。高通量检测技术是指一次可检测多个样品或对同一样品进行多种检测的技术,目前高通量检测技术包括酶联免疫吸附技术,多重PCR技术,生物芯片检测技术,而无论哪种高通量检测技术都要依赖于编码技术,其DNA编码技术是众多编码技术的一种,主要是利用DNA的多样性和互补配对的特性构建编码。2003年,Mirkin等人最早提出生物编码分子的概念,并结合金标银染法对前列腺抗原PSA进行检测。随后的几年,生物编码技术在金属离子,DNA,microRNA,蛋白,氨基酸的检测中得到应用。2006年,Mirkin等人通过编码DNA同时检测PSA、AFP、HCG抗原,三种抗原检测限都可以达到fM级,检测方法适用于稀释的血清样本中。目前基于DNA编码的检测大多将DNA修饰荧光分子或用纳米粒子探针对DNA阵列的扫描,这些方法最终还是依赖于光学信号,而不论什么荧光分子或纳米材料都存在荧光漂白,荧光寿命短,背景干扰,编码微球之间的荧光干扰等等问题,因此开发研究出基于不同技术和不同物理化学性质的编码材料的高通量多组分检测平台势在必行。

纳米孔单通道技术是自二十世纪九十年代中期起在电生理学研究的基础上发展起来的新兴检测手段。纳米孔,指的是孔径尺寸在纳米尺度的孔道,通常为1-100纳米。当两个充满电解液的相互绝缘的隔室通过纳米级孔道连通,在外加电场作用下,溶液中的电解质离子定向迁移并穿过纳米孔从而产生电流,经膜片钳系统测量、放大和转换后被记录。当溶液中存在待检测物质时,该物质在扩散作用或电压驱动下穿越纳米孔,此时孔道内通过的离子数目由于待测物的占据而产生变化,从而导致记录到的电流发生改变,电流信号包含两个特征量:电流阻滞振幅(amplitude)和电流阻滞时间(dwell time),从中可以分析得出丰富的物性信息:物质的种类、结构、构象变化和分子组成等。2016年Nature nanotechnology发表了基于玻璃孔的DNA编码分子的构建。该方法用DNA折纸技术构建了5个哑铃结构密集的区域,这些区域间隔相同长度的双链DNA,哑铃结构密集的区域产生比双链DNA更大的阻滞电流,每个区域相对于第一个区域穿越纳米孔的时间是相对固定的,因此以双链DNA为0,哑铃结构密集的区域为1,建立八种基于玻璃孔的DNA编码分子,再在这种编码分子上修饰抗原,用来同时检测4种抗体。因为玻璃孔的孔径大约14nm左右,它只适合检测比较大的蛋白质例如抗体,而相对于抗原不太适用。另外,这些DNA编码分子区分取决于穿越时间的相对固定,而纳米孔每个分子的穿越时间都不相同,其穿越时间是在一定范围内的统计结果,因此编码就会产生相应的误差。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一种DNA编码技术与纳米孔技术联用的癌症标志物检测方法。

本发明首先提供了探针组合甲,由探针I、探针Ⅱ、探针Ⅲ、探针Ⅳ和探针Ⅴ组成;

所述探针I是将瓜环借助连接臂修饰于序列表的序列1所示的单链DNA分子自5’端第11位碱基得到的;所述连接臂由磷酸基团、三氮唑和二茂铁组成;

所述探针Ⅱ是将瓜环借助连接臂修饰于序列表的序列1所示的单链DNA分子自5’端第11位碱基得到的;所述连接臂由磷酸基团、酰胺键和二茂铁组成;

所述探针Ⅲ是将瓜环借助连接臂修饰于序列表的序列2所示的单链DNA分子自5’端第6位碱基得到的;所述连接臂由磷酸基团、三氮唑和二茂铁组成;

所述探针Ⅳ是将瓜环借助连接臂修饰于序列表的序列1所示的单链DNA分子5’末端得到的;所述连接臂由磷酸基团、三氮唑和二茂铁组成;

所述探针Ⅴ是将瓜环借助连接臂修饰于序列表的序列1所示的单链DNA分子5’末端得到的;所述连接臂由磷酸基团、spacer18官能团、三氮唑和二茂铁组成。

所述探针组合甲的用途为如下(a1)-(a4)中的任一种:

(a1)检测单一抗原;

(a2)同时检测两种或三种或四种或五种抗原;

(a3)制备检测单一抗原的试剂盒;

(a4)制备同时检测两种或三种或四种或五种抗原的试剂盒。

本发明还保护所述探针组合甲的应用,为如下(a1)-(a4)中的任一种:

(a1)检测单一抗原;

(a2)同时检测两种或三种或四种或五种抗原;

(a3)制备检测单一抗原的试剂盒;

(a4)制备同时检测两种或三种或四种或五种抗原的试剂盒。

本发明还保护含有所述探针组合甲的试剂盒,所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2):

(b1)检测单一抗原;

(b2)同时检测两种或三种或四种或五种抗原。

本发明还保护用于检测一种抗原的组合物甲,包括组件A、组件B和组件C;

所述组件A为探针组合甲中的任一所述探针;

所述组件B为偶联有捕获抗体的磁珠;

所述组件C为偶联有检测抗体和特异DNA的纳米金颗粒;

所述捕获抗体和检测抗体能够与待测抗原分子形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体夹心复合物;所述特异DNA能够与所述探针结合。

本发明还保护用于同时检测n种抗原的组合物乙,包括n种组合物;

每种组合物包括所述组件A、组件B和组件C;

n种组成物检测的抗原不同;

n种组成物中的探针不同;

n为2-5之间的任意自然数。

本发明还保护系统甲或系统乙或系统丙。

所述系统甲包括探针组合甲和样品池系统。

所述系统乙包括所述试剂盒和样品池系统。

所述系统丙包括所述组合物乙和样品池系统。

所述样品池系统包括两个隔室,两个隔室被聚四氟乙烯膜分隔;所述聚四氟乙烯膜中间具有一个直径为100-150μM的孔,所述通孔被磷脂双分子层充满,在所述磷脂双分子层中存在一个由α-溶血素七聚体蛋白形成的纳米孔;样品池系统中应用Ag/AgCl电极组成闭合回路。

所述聚四氟乙烯膜的厚度为20μm。

所述两个隔室(cis和trans)的体积均为1.5mL。

所述样品池系统的构建方法具体如下:

用玻璃毛细管将1体积份正十六烷和10体积份正戊烷组成的混合溶液滴入聚四氟乙烯薄膜的小孔周围(滴加量约为2至3微升),然后将两个隔室中加入电解质缓冲液(3M KCl,10mM Tris,pH 5.0)和1,2-二植烷酰卵磷脂(lipids)(1,2-二植烷酰卵磷脂以磷脂原液的形式加入,磷脂原液的浓度为10毫克/毫升,加入量约为15微升;电解质缓冲液的加入量为1mL),并用移液枪混匀,使其自组装形成磷脂双分子层。然后向cis隔室的溶液中加入1微升野生型α-溶血素七聚体蛋白溶液(蛋白溶液的浓度约为0.3毫克/毫升),蛋白自发插入磷脂双分子层形成纳米孔,应用Ag/AgCl电极(连接有高频采样探头,高频采样探针连接有膜片钳放大器)在样品池系统中形成闭合回路。

本发明还保护所述系统的应用,为如下(c1)或(c2):

(cb1)检测单一抗原;

(c2)同时检测两种或三种或四种或五种抗原。

本发明还保护探针组合乙,为如下(a)-(d)中的任一种:

(a)探针I或探针Ⅱ或探针Ⅲ或探针Ⅳ或探针Ⅴ;

(b)探针I或探针Ⅱ或探针Ⅲ或探针Ⅳ或探针Ⅴ中任意两种的组合;

(c)探针I或探针Ⅱ或探针Ⅲ或探针Ⅳ或探针Ⅴ中任意三种的组合;

(d)探针I或探针Ⅱ或探针Ⅲ或探针Ⅳ或探针Ⅴ中任意四种的组合;

所述探针I是将瓜环借助连接臂修饰于序列表的序列1所示的单链DNA分子自5’端第11位碱基得到的;所述连接臂由磷酸基团、三氮唑和二茂铁组成;

所述探针Ⅱ是将瓜环借助连接臂修饰于序列表的序列1所示的单链DNA分子自5’端第11位碱基得到的;所述连接臂由磷酸基团、酰胺键和二茂铁组成;

所述探针Ⅲ是将瓜环借助连接臂修饰于序列表的序列2所示的单链DNA分子自5’端第6位碱基得到的;所述连接臂由磷酸基团、三氮唑和二茂铁组成;

所述探针Ⅳ是将瓜环借助连接臂修饰于序列表的序列1所示的单链DNA分子5’末端得到的;所述连接臂由磷酸基团、三氮唑和二茂铁组成;

所述探针Ⅴ是将瓜环借助连接臂修饰于序列表的序列1所示的单链DNA分子5’末端得到的;所述连接臂由磷酸基团、spacer18官能团、三氮唑和二茂铁组成。

本发明还保护一种检测单一抗原的方法,包括如下步骤:

(1)将待测样本与偶联有捕获抗体的磁珠反应;

(2)将所述探针组合甲中任一种探针与偶联有检测抗体和特异DNA的胶体金颗粒反应;所述特异DNA能够与所述探针结合;

(3)将步骤(1)和步骤(2)的产物混合,形成磁珠-捕获抗体-待测抗原-检测抗体-探针-胶体金复合物,分离复合物上的探针,得到待测样品;将待测样品加入所述样品池系统中,通过分析是否产生特征电信号实现对目的抗原的检测。

所述特征电信号采集在室温25±2℃条件下进行。

信号采样频率:100kHz,Bessel低通滤波截至频率:10kHz。

膜片钳电流信号分析应用Clampfit 10.2软件进行分析,特征信号手动提取并手动测量,使用Origin 8.5对数据进行处理及拟合。

所述分离复合物上的探针可通过63-65℃加热实现。

所述步骤(1)中,将待测样本和磁珠加入assaybuffer中,室温下涡旋振动1h。

所述步骤(2)中,将探针与胶体金颗粒混合4℃孵育1h。

所述步骤(3)中,将步骤(1)和步骤(2)的产物混合后室温下涡旋1h形成形成磁珠-捕获抗体-待测抗原-检测抗体-探针-胶体金复合物,分离复合物,然后将复合物采用水溶解后加热至65℃,用磁力架迅速进行磁珠(复合物)分离后回收上清液(含探针),在超滤管(3KD)中离心浓缩(14000g,15min),得到待测样品。

如果能够检测到某一探针对应的特征信号,说明待测样本中含有所述探针对应的待测抗原,进一步可通过特征信号出现的频率对待测样本中的抗体进行定量。

本发明还保护一种同时检测n种抗原的方法,包括如下步骤:

(1)将待测样本与n种磁珠的混合物反应;每一种磁珠偶联有可与一种待测抗原结合的捕获抗体;n种磁珠偶联的捕获抗体针对不同的待测抗原;

(2)将所述探针组合甲中的任意n个探针与n种胶体金颗粒一对一混合,即每一种探针与一种胶体金颗粒混合,共形成n组混合物;每一种胶体金颗粒偶联有可与一种待测抗原结合的检测抗体和特异DNA;n种胶体金颗粒偶联的检测抗体针对不同的待测抗原;所述特异DNA能够与探针结合;

(3)将步骤(2)得到的n组混合物混合;

(4)将步骤(1)和步骤(3)的产物混合,形成磁珠-捕获抗体-待测抗原-检测抗体-探针-胶体金复合物,分离复合物上的探针,得到待测样品;将待测样品加入所述样品池系统中,通过分析是否产生特征电信号实现对目的抗原的检测;

n为2-5之间的任意自然数。

所述特征电信号采集在室温25±2℃条件下进行。

信号采样频率:100kHz,Bessel低通滤波截至频率:10kHz。

膜片钳电流信号分析应用Clampfit 10.2软件进行分析,特征信号手动提取并手动测量,使用Origin 8.5对数据进行处理及拟合。

所述分离复合物上的探针可通过63-65℃加热实现。

所述步骤(1)中,将待测样本和磁珠加入assaybuffer中,室温下涡旋振动1h。

所述步骤(2)中,将探针与胶体金颗粒混合4℃孵育1h。

所述步骤(4)中,将步骤(1)和步骤(3)的产物混合后室温下涡旋1h形成磁珠-捕获抗体-待测抗原-检测抗体-探针-胶体金复合物,分离复合物,然后将复合物采用水溶解后加热至65℃,用磁力架迅速进行磁珠(复合物)分离后回收上清液(含探针),在超滤管(3KD)中离心浓缩(14000g,15min),得到待测样品。

n种探针的信号不同且差异很大,纳米孔通道每次只允许单个探针穿越,即同一时间只产生一种特征信号。检测结束后,对说是有特征信号进行分析,如果能够检测到某一探针对应的特征信号,说明待测样本中含有所述探针对应的待测抗原,进一步可通过特征信号出现的频率对待测样本中的抗体进行定量。

以上任一所述偶联有检测抗体和特异DNA的胶体金颗粒的制备方法具体如下:

(I)取1ml胶体金溶液(粒径30nm,浓度2×1011粒/mL),用01M的NaHCO3水溶液调节胶体金溶液pH到9.2,向溶液中一种检测抗体,10℃、90r/min放置30min,得到修饰检测抗体的胶体金溶液;

不同检测抗体在胶体金溶液体系中的浓度具体为:PSA检测抗体(2μg/mL)、AFP检测抗体(4μg/mL)、CEA检测抗体(2μg/mL)、NSE检测抗体(4μg/mL)、CA19-9检测抗体(4μg/mL)。

(Ⅱ)将特异DNA加至DTT溶液(0.1M,磷酸缓冲液中)中室温下用混合振荡器震动0.5h,加入步骤(I)得到的修饰检测抗体的胶体金溶液中(加至胶体金溶液中后DNA6终浓度:3~4μM),10℃搅拌5min,纳米金置于1mL PB缓冲液中(10mM PB,0.02%Tween 20,pH=7.2),放入恒温摇床上,90r/min放置1h;

(Ⅲ)完成步骤(Ⅱ)后,向溶液中加入1.5M NaCl水溶液(每隔半小时加入20μL),直至NaCl在溶液中的浓度为0.15M,继续陈化1h后取出;

(Ⅳ)将步骤(Ⅲ)处理后的胶体金溶液10000rpm、10℃离心10min,收集沉淀,加入assay buffer(0.1M NaCl,0.025%Tween 20,0.1%BSA,10mM phosphate buffer,pH 7.2)重复洗涤胶体金,最后采用assay buffer溶解后4℃保存。

以上任一所述偶联有捕获抗体的磁珠可采用氨基化磁珠试剂盒(具体可为Polysciences,货号:86000-1的产品)制备,具体如下:

(A)取100μL氨基修饰磁珠(50mg/mL),加入1mL吡啶清洗缓冲液(PWB)涡旋后在磁力架上分离,清洗步骤重复三次;

(B)完成步骤(A)后,将25%(体积百分比)戊二醛水溶液用PWB稀释至体积百分含量为5%,加入到磁珠中,放在Multi-Rotator混匀装置中(转速:36转/min)摇动3h;

(C)完成步骤(B)后,使用PWB缓冲液清洗磁珠,反复清洗3次后,加入含有100μg捕获抗体的assay buffer(0.1M NaCl,0.025%Tween 20,0.1%BSA,10mM PB,pH 7.2),加入BSA 1mg,放在Multi-Rotator混匀装置中(转速:36转/min),摇动20h。

(D)完成步骤(C)后,加入0.8mL PWB缓冲液和0.4mL淬灭缓冲液(1M甘氨酸溶液,pH 8.0),放在Multi-Rotator混匀装置中(转速:36转/min),摇动30min。

(E)完成步骤(D)后,将磁珠和上清液分离,使用1mL清洗缓冲液(wash buffer)清洗磁珠,重复清洗三次,最后将磁珠溶于1mL清洗缓冲液中,磁珠终浓度5mg/mL,并将磁珠溶液保存在4℃冰箱中。

以上任一所述特异DNA具体可为序列表的序列3所示的单链DNA分子(5’端磷酸基团巯基修饰)。

以上任一所述待测样本具体可为血清。

以上任一所述瓜环具体可为七元瓜环。

以上任一所述探针I的制备方法具体包括如下步骤:

(a)取3.3μL序列1所示的单链DNA分子(自5’端第11位碱基炔基修饰)溶液(溶剂为水,单链DNA分子的浓度为100μM),1.2μL去离子水,2μL叠氮二茂铁溶液(溶剂为乙腈,叠氮二茂铁的浓度为200mM),1μL抗坏血酸钠溶液(溶剂为水,抗坏血酸钠的浓度为20mM),0.5μL硝酸铜溶液(溶剂为水,硝酸铜的浓度为20mM),2μL HEPES缓冲液(200mM)混合,混合溶液共10μL。

(b)将步骤(a)得到的混合溶液室温下涡旋反应2h,然后加入2μL EDTA溶液(100mM)终止反应。

(c)完成步骤(b)后,使用Micro bio-spin 6凝胶排阻色谱柱,按说明书操作进行除盐。

(d)将步骤(c)除盐后得到的样品加入10μL瓜环﹛Q[7]﹜(5mM)孵育2h,得到探针I。

将序列1所示的单链DNA分子(自5’端第11位碱基氨基修饰)替代序列1所示的单链DNA分子(自5’端第11位碱基炔基修饰),按照(a)-(d)进行操作,得到探针Ⅱ。

将序列2所示的单链DNA分子(自5’端第6位碱基炔基修饰)替代序列1所示的单链DNA分子(自5’端第11位碱基炔基修饰),按照(a)-(d)进行操作,得到探针Ⅲ。

将序列1所示的单链DNA分子(5’末端磷酸基团炔基修饰)替代序列1所示的单链DNA分子(自5’端第11位碱基炔基修饰),按照(a)-(d)进行操作,得到探针Ⅳ。

将序列1所示的单链DNA分子(5’末端磷酸基团修饰炔基和spacer18官能团)替代序列1所示的单链DNA分子(自5’端第11位碱基炔基修饰),按照(a)-(d)进行操作,得到探针Ⅴ。

以上任一所述探针I对应的特征信号由两部分组成,第一部分的电流较为平坦,阻塞在基线电流99.5%的位置;第二部分为电流震荡,其靠上部分(电流震荡是指电流在某一区间范围内来回摆动,而该信号靠上部分较为平坦,因此以靠上部分的电流值作为统计参数)的电流阻塞在基线电流72.6%的位置。

以上任一所述探针Ⅱ对应的特征信号由三部分组成,第一部分的电流较为粗糙,有毛刺,阻塞在基线电流86.5%的位置;第二部分的电流较为平坦,阻塞在基线电流99.8%的位置;第三部分的电流较为粗糙,且持续时间较短,阻塞在基线电流75.8%的位置。

以上任一所述探针Ⅲ对应的特征信号由两部分组成,第一部分的电流较为粗糙,阻塞在基线电流92.9%的位置;第二部分为电流震荡(电流震荡是指电流在某一区间范围内来回摆动,而该信号靠上部分较为平坦,因此以靠上部分的电流值作为统计参数),其靠上部分的电流阻塞在基线电流70.9%的位置。

以上任一所述探针Ⅳ对应的特征信号由两部分组成,第一部分的电流较为平坦,阻塞在基线电流73.2%的位置;第二部分为电流震荡,(电流震荡是指电流在某一区间范围内来回摆动,而该信号靠下部分较为平坦,因此以靠下部分的电流值作为统计参数),其靠下部分的电流阻塞在基线电流98.2%的位置。

以上任一所述探针Ⅴ对应的特征信号由两部分组成,第一部分的电流较为平坦,阻塞在基线电流67.6%的位置;第二部分为电流震荡,(电流震荡是指电流在某一区间范围内来回摆动,而该信号靠下部分较为平坦,因此以靠下部分的电流值作为统计参数),其靠下部分的电流阻塞在基线电流97.9%的位置。

以上任一所述捕获抗体或检测抗体均为单抗。

以上任一所述待测抗原可为PSA(前列腺特异抗原)和/或AFP(甲胎蛋白)和/或CEA(癌胚抗原)和/或NSE(神经元特异性烯醇化酶)和/或CA19-9(癌抗原CA19-9)。

当待测抗原为PSA(前列腺特异抗原)时,使用的捕获抗体具体可为Abcam,货号:Ab403的产品,使用的检测抗体具体可为RD Systems,货号:AF1344的产品。

当待测抗原为CEA(癌胚抗原)时,使用的捕获抗体具体可为Fitzgerald,货号:10-C10D的产品,使用的检测抗体具体可为Fitzgerald,货号:10-C10E的产品。

当待测抗原为AFP(甲胎蛋白)时,使用的捕获抗体具体可为Fitzgerald,货号:10-A05B的产品,使用的检测抗体具体可为Fitzgerald,货号:70-xg05的产品。

当待测抗原为NSE(神经元特异性烯醇化酶)时,使用的捕获抗体具体可为Fitzgerald,货号:10-N15C的产品,使用的检测抗体具体可为Fitzgerald,货号:10-N15D的产品。

当待测抗原为CA19-9(癌抗原CA19-9)时,使用的捕获抗体具体可为Fitzgerald,货号:10-CA19B的产品,使用的检测抗体具体可为Fitzgerald,货号:10-CA19A的产品。

本发明将DNA编码技术和纳米孔技术相结合,构建了对五种癌症标志物同时检测的方法。首先合成了DNA编码分子,通过对改变DNA碱基的化学修饰,修饰基团及DNA长度,当其穿越纳米孔时产生区分度较高的特征电流信号。结合免疫分析技术,癌症标志物加入后,与磁珠、纳米金形成夹心结构,然后释放纳米金表面编码DNA,实现癌症标志物单独及同时检测。基于纳米孔单分子技术的高通量多组分检测平台以不同的DNA编码分子输出对应的特征电流信号,不仅没有背景干扰,而且DNA编码分子之间也不存在信号干扰,即可以克服传统方法中荧光编码的荧光漂白,荧光寿命短,背景干扰,编码微球之间的荧光干扰等等缺点。

附图说明

图1为五种编码DNA的特征电流信号和穿越机理。

图2为五种癌症标志物同时检测原理图。

图3为实施例2中步骤四检测结果。a-e为五种抗原分别在缓冲液体系和血清体系的定量检测图,f为五种抗原单独检测和五种同时检测的比较图(抗原浓度统一为10nM)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。

本发明人工制备五种用于检测不同抗原的探针,五种探针在穿过纳米孔通道时会产生不同的特征信号。在进行待测抗原检测时,将待测抗原与捕获抗体修饰的磁珠结合,使其与结合了检测抗体和探针的纳米金发生相互作用,形成捕获抗体-待测抗原-检测抗体夹心复合物,通过加热释放探针,探针经过纳米孔通道,根据不同探针产生的特征信号完成不同抗原的检测。

实施例中使用的抗原和抗体信息如下:

PSA抗原:Sigma,货号:P3235。

PSA捕获抗体:Abcam,货号:Ab403。

PSA检测抗体:RD Systems,货号:AF1344。

CEA抗原:Fitzgerald,货号:30-AC32。

CEA捕获抗体:Fitzgerald,货号:10-C10D。

CEA检测抗体:Fitzgerald,货号:10-C10E。

AFP抗原:Fitzgerald,,货号:30C-CP1007U。

AFP捕获抗体:Fitzgerald,货号:10-A05B。

AFP检测抗体:Fitzgerald,货号:70-xg05。

NSE抗原:Fitzgerald,货号:30-AN10。

NSE捕获抗体:Fitzgerald,货号:10-N15C。

NSE检测抗体:Fitzgerald,货号:10-N15D。

CA19-9抗原:Fitzgerald,货号:30-AC09。

CA19-9捕获抗体:Fitzgerald,货号:10-CA19B。

CA19-9检测抗体:Fitzgerald,货号:10-CA19A。

实施例1、五种探针分子的合成

1、人工合成表1中的五种单链DNA分子。

表1五种编码DNA序列及修饰方式

2、将步骤1合成的五种单链DNA分子分别进行下述操作:

(1)取3.3μL DNA分子溶液(溶剂为水,步骤1制备的单链DNA分子的浓度为100μM),1.2μL去离子水,2μL叠氮二茂铁溶液(溶剂为乙腈,叠氮二茂铁的浓度为200mM),1μL抗坏血酸钠溶液(溶剂为水,抗坏血酸钠的浓度为20mM),0.5μL硝酸铜溶液(溶剂为水,硝酸铜的浓度为20mM),2μL HEPES缓冲液(200mM)混合,混合溶液共10μL。

(2)将步骤(1)得到的混合溶液室温下涡旋反应2h,然后加入2μL EDTA溶液(100mM)终止反应。

(3)完成步骤(2)后,使用Micro bio-spin 6凝胶排阻色谱柱,按说明书上步骤除盐。

(4)将步骤(3)除盐后得到的样品加入10μL瓜环﹛Q[7]﹜(5mM)孵育2h,得到探针。

DNA1得到的探针命名为探针探针是将瓜环﹛Q[7]﹜修饰于DNA1自5’端第11位碱基T得到的;连接臂由磷酸基团、三氮唑和二茂铁形成。瓜环通过主客体超分子作用与二茂铁连接。

DNA2得到的探针命名为探针探针是将瓜环﹛Q[7]﹜修饰于DNA2自5’端第11位碱基T得到的;连接臂由磷酸基团、酰胺键和二茂铁形成。瓜环通过主客体超分子作用与二茂铁连接。

DNA3得到的探针命名为探针探针是将瓜环﹛Q[7]﹜修饰于DNA3自5’端第6位碱基T得到的;连接臂由磷酸基团、三氮唑和二茂铁形成。瓜环通过主客体超分子作用与二茂铁连接。

DNA4得到的探针命名为探针探针是将瓜环﹛Q[7]﹜修饰于DNA4的5’末端得到的;连接臂由磷酸基团、三氮唑和二茂铁形成。瓜环通过主客体超分子作用与二茂铁连接。

DNA5得到的探针命名为探针探针是将瓜环﹛Q[7]﹜修饰于DNA5的5’末端得到的;连接臂由磷酸基团、spacer18官能团、三氮唑和二茂铁共同组成。瓜环通过主客体超分子作用与二茂铁连接。

上述五种探针在通过样品池系统(样品池系统详见实施例2的三)时,室温25±2℃条件下利用膜片钳放大器进行信号采集,产生的特征信号不同(图1)。

探针产生的信号如图1a中的(i)所示。信号由两部分组成,第一部分的电流较为平坦,阻塞在基线电流99.5%的位置;第二部分为电流震荡,其靠上部分(电流震荡是指电流在某一区间范围内来回摆动,而该信号靠上部分较为平坦,因此以靠上部分的电流值作为统计参数)的电流阻塞在基线电流72.6%的位置。

探针产生的信号如图1b中的(i)所示。相比于探针产生了新的level 1’,新的level 1’平均残余电流I1’=13.5%I0。信号由三部分组成,第一部分的电流较为粗糙,有毛刺,阻塞在基线电流86.5%的位置;第二部分的电流较为平坦,阻塞在基线电流99.8%的位置;第三部分的电流较为粗糙,且持续时间较短,阻塞在基线电流75.8%的位置。

探针产生的信号如图1c中的(i)所示。level 1平均残余电流I1=7.1%I0。信号由两部分组成,第一部分的电流较为粗糙,阻塞在基线电流92.9%的位置;第二部分为电流震荡(电流震荡是指电流在某一区间范围内来回摆动,而该信号靠上部分较为平坦,因此以靠上部分的电流值作为统计参数),其靠上部分的电流阻塞在基线电流70.9%的位置。

探针产生的信号如图1d中的(i)所示。level 1平均残余电流I1=26.8%I0。信号由两部分组成,第一部分的电流较为平坦,阻塞在基线电流73.2%的位置;第二部分为电流震荡,(电流震荡是指电流在某一区间范围内来回摆动,而该信号靠下部分较为平坦,因此以靠下部分的电流值作为统计参数),其靠下部分的电流阻塞在基线电流98.2%的位置。

探针产生的信号如图1e中的(i)所示。level 1平均残余电流I1=32.4%I0。信号由两部分组成,第一部分的电流较为平坦,阻塞在基线电流67.6%的位置;第二部分为电流震荡,(电流震荡是指电流在某一区间范围内来回摆动,而该信号靠下部分较为平坦,因此以靠下部分的电流值作为统计参数),其靠下部分的电流阻塞在基线电流97.9%的位置。

实施例2、检测方法的建立

利用上述五种探针同时检测五种抗原的原理见图2。待测抗原可为任意抗原分子。

下述实验以五种癌症标志物PSA(前列腺特异抗原)、AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)和CA19-9(癌抗原CA19-9)为例。

一、检测抗体修饰纳米金

1、取1ml胶体金溶液(粒径30nm,浓度2×1011粒/mL),用0.1M的NaHCO3水溶液调节胶体金溶液pH到9.2,向溶液中加入一种待测抗原对应的检测抗体,10℃、90r/min放置30min,得到修饰检测抗体的胶体金溶液。

不同抗体在胶体金溶液体系中的浓度具体为:PSA检测抗体(2μg/mL)、AFP检测抗体(4μg/mL)、CEA检测抗体(2μg/mL)、NSE检测抗体(4μg/mL)、CA19-9检测抗体(4μg/mL)。

2、将DNA6加至DTT溶液(0.1M,磷酸缓冲液中)中室温下用混合振荡器震动0.5h,加入步骤1得到的修饰检测抗体的胶体金溶液中(加至胶体金溶液中后DNA6终浓度:3~4μM),10℃搅拌5min,纳米金置于1mL PB缓冲液中(10mM PB,0.02%Tween 20,pH=7.2),放入恒温摇床上,90r/min放置1h。

DNA6:5’-AAAAAAAAAAGAGTCGTGAGAGTGTAATATG-3’(序列表的序列3);5’端磷酸基团巯基修饰。DNA6可与实施例1制备的探针发生互补配对,进而起到捕捉探针分子的作用,即DNA6与纳米金结合后便固定在纳米金表面,随后DNA6与后续加入的探针发生互补配对而被修饰在纳米金上。

3、完成步骤3后,向溶液中加入1.5M NaCl水溶液(每隔半小时加入20μL),直至NaCl在溶液中的浓度为0.15M,继续陈化1h后取出。

4、将步骤3处理后的胶体金溶液10000rpm、10℃离心10min,收集沉淀,加入assay buffer(0.1M NaCl,0.025%Tween 20,0.1%BSA,10mM phosphate buffer,pH7.2)重复洗涤胶体金,最后采用assay buffer溶解后4℃保存。

二、捕获抗体修饰磁珠

磁珠偶联蛋白抗体采用氨基化磁珠试剂盒(Polysciences,货号:86000-1),具体如下:

1、取100μL氨基修饰磁珠(50mg/mL),加入1mL吡啶清洗缓冲液(PWB)涡旋后在磁力架上分离,清洗步骤重复三次。

2、完成步骤1后,将25%(体积百分比)戊二醛水溶液用PWB稀释至体积百分含量为5%,加入到磁珠中,放在Multi-Rotator混匀装置中(转速:36转/min)摇动3h。

3、完成步骤3后,使用PWB缓冲液清洗磁珠,反复清洗3次后,加入含有100μg捕获抗体的assay buffer(0.1M NaCl,0.025%Tween 20,0.1%BSA,10mM PB,pH 7.2),加入BSA 1mg,放在Multi-Rotator混匀装置中(转速:36转/min),摇动20h。

捕获抗体为PSA捕获抗体或AFP捕获抗体或CEA捕获抗体或NSE捕获抗体或CA19-9捕获抗体。

4、完成步骤3后,加入0.8mL PWB缓冲液和0.4mL淬灭缓冲液(1M甘氨酸溶液,pH 8.0),放在Multi-Rotator混匀装置中(转速:36转/min),摇动30min。

5、完成步骤4后,将磁珠和上清液分离,使用1mL清洗缓冲液(wash buffer)清洗磁珠,重复清洗三次,最后将磁珠溶于1mL清洗缓冲液中,磁珠终浓度5mg/mL,并将磁珠溶液保存在4℃冰箱中。

通过280nm的紫外吸收的变化检测反应效率,蛋白反应效率=偶联前蛋白溶液在280nm的吸光度值减去偶联后蛋白溶液在280nm的吸光度值,该差值除以偶联前蛋白溶液在280nm的吸光度值,再乘以100。

经计算各蛋白的反应效率分别是:PSA捕获抗体:72.3%,AFP捕获抗体:81.2%,CEA捕获抗体:71.0%,NSE捕获抗体:75.6%,CA19-9捕获抗体:78.7%。

以上各缓冲液由氨基修饰试剂盒中提供,其中吡啶缓冲液(PWB)0.1M使用前用超纯水按1:10稀释,并调节pH到6.0。清洗缓冲液(wash buffer)使用前按1:10稀释,并将pH调到7.4。

三、样品池系统

样品池系统包括两个隔室(cis和trans),两个隔室的体积均为1.5mL,两个隔室采用20μm厚的聚四氟乙烯薄膜隔开(薄膜中间有一个直径约为100-150μM的小孔),用玻璃毛细管将1体积份正十六烷和10体积份正戊烷组成的混合溶液滴入聚四氟乙烯薄膜的小孔周围(滴加量约为2至3微升),然后将两个隔室中加入电解质缓冲液(3MKCl,10mM Tris,pH 5.0)和1,2-二植烷酰卵磷脂(lipids)(1,2-二植烷酰卵磷脂以磷脂原液的形式加入,磷脂原液的浓度为10毫克/毫升,加入量约为15微升;电解质缓冲液的加入量为1mL),并用移液枪混匀,使其自组装形成磷脂双分子层。然后向cis隔室的溶液中加入1微升α-溶血素七聚体蛋白溶液(蛋白浓度约为0.3毫克/毫升),蛋白自发插入磷脂双分子层形成纳米孔,应用Ag/AgCl电极(连接有高频采样探头,高频采样探针连接有膜片钳放大器)在样品池系统中形成闭合回路。

上述α-溶血素七聚体蛋白溶液的制备方法如下:

1、野生型α-溶血素质粒(WT-D8H6):参考文献:Bhakdi,S.;Fiissle,R.;Tranum-Jensen,J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1981,78,5475–5479.;公众可以从中国科学院化学研究所获得。

2、将步骤1中的野生型α-溶血素质粒(WT-D8H6)导入大肠杆菌系统内(E.coliBL21(DE3)pLysS strain)(参考文献Bhakdi,S.;Fiissle,R.;Tranum-Jensen,J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1981,78,5475–5479.)进行表达,将表达的利用SDS变性的8%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后得到单体,之后将单体加入至兔血红细胞中,单体将自发聚合成七聚体;最后对蛋白进行纯化,用8%SDS-PAGE变性胶进行纯化,得到纯化后的野生型α-溶血素七聚体蛋白溶液(α-溶血素七聚体蛋白溶液的具体制备方法可参照文献:卓丽霞,王莹,张春萍,等.α-溶血素的表达及其纳米孔的制备[J].中国生物工程杂志,2017,37(1):53-57.)。

四、检测方法

1、缓冲液体系中的单独检测

(1)取待测抗原对应的步骤二制备的捕获抗体修饰磁珠50μl,加入500μl assaybuffer反复清洗3次,然后将磁珠置于500μl的assaybuffer中,加入不同浓度的抗原,室温下涡旋振动1h。

待测抗原为PSA(前列腺特异抗原)、AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)或NSE(神经元特异性烯醇化酶)时,抗原在assaybuffer中的浓度为:10nM、1nM、10pM、1pM、100fM、8fM、0fM。

待测抗原为CA19-9(癌抗原CA19-9)时,抗原在assaybuffer中的浓度为:380U/mL、100U/mL、10U/mL、1U/mL、0.1U/mL、0.01U/mL、0.001U/mL、0U/mL。

(2)取待测抗原对应的步骤一制备的检测抗体修饰纳米金,加入实施例一制备的探针20μl(50μM),4℃孵育1h。

待测抗原为PSA(前列腺特异抗原)时,探针为

待测抗原为AFP(甲胎蛋白)时,探针为

待测抗原为CEA(癌胚抗原)时,探针为

待测抗原为NSE(神经元特异性烯醇化酶)时,探针为

待测抗原为CA19-9(癌抗原CA19-9)时,探针为

实际应用中,单独检测某一种抗原时,可在五种探针中任意选择一种使用。

(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的体系混合,室温下涡旋1h。

(4)完成步骤(3)后,分离磁珠,并用assay buffer重复清洗3次后,再次用wash buffer(0.15M NaCl,10mM PB)清洗,清洗后分离磁珠。

(5)向磁珠中加入300μl超纯水,然后加热至65℃,用磁力架迅速进行磁珠分离后回收上清液,反复三次,最后将上清液合并,在超滤管(3KD)中离心浓缩(14000g,15min),得到待测样品。

(6)将步骤(5)得到的待测样品加入至实施例2制备的样品池的cis隔室,反复抽吸溶液约15次,将溶液混合均匀,室温25±2℃条件下利用膜片钳放大器进行信号采集,并由数模转换器将电流信号转换为数字信号。

信号采样频率:100kHz,Bessel低通滤波截至频率:10kHz。

膜片钳电流信号分析应用Clampfit 10.2软件进行分析,特征信号手动提取并手动测量,使用Origin 8.5对数据进行处理及拟合。

2、牛血清体系中的单独检测

(1)取待测抗原对应的步骤二制备的捕获抗体修饰磁珠50μl,加入500μl assaybuffer反复清洗3次,然后将磁珠至于500μl的assaybuffer中,加入不同浓度的抗原,加入500μl血清,室温下涡旋振动1h。

待测抗原为PSA(前列腺特异抗原)、AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)或NSE(神经元特异性烯醇化酶)时,抗原在assaybuffer中的浓度为:10nM、1nM、10pM、1pM、100fM、8fM、0fM。

待测抗原为CA19-9(癌抗原CA19-9)时,抗原在assaybuffer中的浓度为:380U/mL、100U/mL、10U/mL、1U/mL、0.1U/mL、0.01U/mL、0.001U/mL、0U/mL。

按照1中的(2)-(6)进行操作。

3、缓冲液体系中的混合检测

五种待测抗原分别进行步骤(1)和步骤(2);

(1)取待测对应的步骤二制备的捕获抗体修饰磁珠各50μl,加入500μl assay buffer反复清洗3次,然后将磁珠至于500μl的assaybuffer中,加入待测抗原,室温下涡旋振动1h;

PSA(前列腺特异抗原)、AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)在assaybuffer中的浓度为100nM,CA19-9(癌抗原CA19-9)在assaybuffer中的浓度为100U/mL。

(2)取待测抗原对应的步骤二制备的检测抗体修饰纳米金,加入实施例一制备的探针20μl(50μM),4℃孵育1h(一种检测抗体修饰纳米金与一种探针混合孵育),孵育完成后将结合有不同探针的检测抗体修饰纳米金混合。

待测抗原为PSA(前列腺特异抗原)时,探针为

待测抗原为AFP(甲胎蛋白)时,探针为

待测抗原为CEA(癌胚抗原)时,探针为

待测抗原为NSE(神经元特异性烯醇化酶)时,探针为

待测抗原为CA19-9(癌抗原CA19-9)时,探针为

实际应用中,当同时检测多种抗原时,每种待测抗原可以匹配五种探针中的任一种,但不同的抗原要匹配不同的探针。

(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的体系混合,4℃反应半个小时后将磁珠快速分离。

(4)完成步骤(3)后,分离磁珠,并用assay buffer重复清洗3次后,再次用wash buffer(0.15M NaCl,10mM PB)清洗10次,清洗后分离磁珠。

(5)向磁珠中加入300μl超纯水,63℃水浴中放置15min后分离回收上清液,反复三次,最后将上清液合并,在超滤管(3KD)中离心浓缩(14000g,15min),得到待测样品。

(4)完成步骤(3)后,分离磁珠,并用assay buffer重复清洗3次后,再次用wash buffer(0.15M NaCl,10mM PB)清洗,清洗后分离磁珠。

(6)将步骤(5)得到的待测样品加入至实施例2制备的样品池的cis隔室,反复抽吸溶液约15次,将溶液混合均匀,室温25±2℃条件下利用膜片钳放大器进行信号采集,并由数模转换器将电流信号转换为数字信号。

信号采样频率:100kHz,Bessel低通滤波截至频率:10kHz。

膜片钳电流信号分析应用Clampfit 10.2软件进行分析,特征信号手动提取并手动测量,使用Origin 8.5对数据进行处理及拟合。

4、牛血清体系中的混合检测

(1)取5种抗原对应的步骤二制备的捕获抗体修饰磁珠各50μl,加入500μl assaybuffer反复清洗3次,然后将磁珠至于500μl的assaybuffer中,加入待测抗原,加入1ml牛血清,室温下涡旋振动1h;

PSA(前列腺特异抗原)、AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)在assaybuffer中的浓度为100nM,CA19-9(癌抗原CA19-9)在assaybuffer中的浓度为100U/mL。

按照3中的(2)-(6)进行操作。

检测结果见图3。五种癌症标志物在缓冲液体系中的检测限分别为PSA:8fM、AFP:。20fM、CEA:100fM、NSE:50fM、CA19-9:1mU/mL。在混合血清实验中检测限都可以达到pM级,对于CA19-9抗原检测限可以达到0.1U/mL。并且五种癌症标志物同时检测时无论在缓冲液体系还是混合血清体系与单独检测时差别很小。说明检测时彼此之间干扰很小,可以实现同时定量检测。

序列表

<110> 中国科学院化学研究所

中国科学院高能物理研究所

<120> 一种DNA编码技术与纳米孔技术联用的癌症标志物检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catattacac tctcacgact c 21

<210> 2

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacactctca c 11

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaaaaaaa gagtcgtgag agtgtaatat g 31

再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1