本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种快速高效的ppcs细胞培养方法。
背景技术：
：可编程的多能细胞(programmablepluripotentcells,ppcs)是一种通过现代细胞技术和分子生物学技术，开发成功的一种来源于外周血单核细胞，经过诱导和逆转，具有多能细胞特性的细胞。这种细胞的前身是外周血的单核细胞，经过特殊的去分化和扩增技术，使其生长为具有多能细胞的再生功能的新型细胞，然后回输体内，可以对组织结构和功能进行再生和修复，另外，还可以激活组织器官内处于休眠或抑制状态的前体细胞，取代并修复体内因病变而受损和失去功能的组织细胞，重新恢复建立重要生命器官的生理功能，以达到治疗各种慢性疾病和抗衰老及保健的目的。目前，ppcs的建立是基于德国fandrich教授的技术。该技术存在许多缺陷，例如：1.一次性抽血量达500ml左右，对个体的影响比较大；2.培养基的选择更倾向于淋巴细胞的培养，而非类干细胞的培养；3.培养基内添加了动物成份的血清。技术实现要素：本发明为解决现有技术中的上述问题提出的提供一种区别于传统培养法的人ppcs细胞的培养方法，低氧环境和成纤维细胞上清液使得ppcs细胞纯度高，生长良好，细胞增殖快，细胞得率和存活率均大大提高同时能够尽可能地避免动物成分对细胞培养的影响，为多能细胞的培养提供一种新的思路和方法。为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：一种快速高效的ppcs细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：使用0.1％的明胶稀释液37℃培养箱中过夜包被培养容器；步骤2：分离单个核细胞，然后洗涤、离心并重悬；分离单个核细胞的洗涤和重悬过程，使用成纤维细胞的细胞上清液进行，优选使用成纤维细胞培养3天后的细胞上清液；步骤3：将所述步骤1处理的培养容器内的明胶吸除，并将步骤2获得的单个核细胞接种到培养容器中，放置在氧浓度为0.5％-7％的细胞培养箱中培养。为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：优选地，步骤3中的培养容器中的氧浓度为5％；优选地，培养细胞所使用的培养基中一半体积为成纤维细胞的细胞上清液，另一半体积为包含有5-12％knockout血清替代品、0.5％双抗、0.007ul/mlb-巯基乙醇、10ng/mlscf以及100u/mlil-3的dmem/f12培养基。优选地，上述成纤维细胞的细胞上清液，是将成纤维细胞培养3天后的上清液用0.22μm滤膜过滤后获得。优选地，上述成纤维细胞以4×106/瓶接种于t75瓶中，培养基为10％knockout血清替代品的dmem/f12培养基，在37℃下，放置于5％co2的培养箱中培养。优选地，上述培养容器为细胞培养瓶或细胞培养板。优选地，上述步骤2中采集的细胞使用0.01mpbs洗涤3次，然后进行离心，离心条件为200g离心10分钟，然后进行重悬。更优选地，步骤2中人外周血中采集分离单个核细胞的使用美国泰尔茂比斯特医疗产品贸易(上海)有限公司生产的血细胞单采机(spectraoptia血液分离系统)进行单核细胞的采集(血浆和红细胞回输人体)：优选地，上述步骤2中采集的细胞使用0.01mpbs洗涤3次，然后进行离心，离心条件为200g离心10分钟，然后进行重悬。优选地，上述培养容器为t75细胞培养瓶，每个t75细胞培养瓶使用3ml0.1％的明胶稀释液包被。优选地，上述单个核细胞接种密度为3×106/瓶，置于37℃，5％co2的培养箱中进行培养，每3天更换新的培养基，每天在显微镜下观察细胞的生长情况，至细胞融合度达70％-80％，进行传代培养。本发明的第二个方面还提供根据上述方法培养得到的ppcs细胞。本发明最后一方面还提供上述的ppcs细胞在制备抗衰老药物中的应用。本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：(1)传统的培养ppcs细胞的方法中，ppcs细胞活性低，生长慢。本发明中，发明人意外的发现，在低氧环境中培养ppcs细胞，能在一定程度上增加多能细胞的活性，影响多能细胞的细胞周期，显著的促进多能细胞的增殖，这为ppcs细胞的培养提供了一种新的思路和方向，对其临床上的应用有着重要的指导意义；(2)成纤维细胞作为饲养细胞，其上清液中包含成纤维细胞分泌的多种生长因子，为多能细胞提供更好的营养，更能模拟体内环境，并且能够调控多能细胞增殖的akt信号通路，显著的促进多能细胞的增殖；(3)避免了传统方法手采单核细胞过程中，需要一次性抽血500ml，采集单核细胞后，剩余的血液成份全部浪费，对机体造成极大影响，且不能在短时间内多次实施，以致无法满足对某些慢性疾病的治疗需求的缺陷；(4)使用dmem/f12培养基代替rmpi1640培养基，可以更好的促进多能细胞的生长和增殖，因为rmpi1640培养基是淋巴细胞的基础培养基，并不能很好地满足这种类干细胞的生长需要；(5)使用knockoutserumreplacement代替胎牛血清，既能满足营养地需要，又能最大程度地避免血清中不明确的动物成份，对人体细胞的影响；(6)分离单个核细胞的洗涤和重悬过程，使用成纤维细胞的细胞上清液进行，进一步保证了多能细胞的活性。附图说明图1为本发明培养方法培养的ppcs细胞显微镜图片。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1一、在1％氧浓度的条件下，本方法与常规方法的细胞扩增倍数的比较本实施例中实验组培养ppcs细胞的方法，具体步骤如下：1.培养瓶的包被将t75培养瓶用0.1％的明胶包被，在细胞培养的前一天，将3ml0.1％的明胶溶液均匀地铺满瓶底，37℃培养箱中过夜。2.细胞培养基配制细胞培养基为包含有10％knockoutserumreplacement(gibco-brl,cat.no.10828)、1％双抗、0.007ul/mlb-巯基乙醇(sigma,cat.no.m7522)、10ng/mlscf以及100u/mlil-3的dmem/f12(1:1)(gibco-brl,cat.no.11330)的培养基。3.人单核细胞的提取由于治疗用多能细胞需要从约500ml外周血中进行单核细胞的提取，因此，本实施例中选用美国泰尔茂比斯特医疗产品贸易(上海)有限公司生产的血细胞单采机(spectraoptia血液分离系统)进行单核细胞的采集。使用机器采集代替人工采集的优势是，只取我们需要的单核细胞，而不需要的其它成份，血浆和红细胞等，直接回输人体，从而将对个体造成的影响降低到最小。将机器采集的单核细胞洗涤和重悬，使用成纤维细胞的细胞上清液进行，使用成纤维细胞培养3天后的细胞上清液，每次的离心条件为200g离心10分钟。4.二维培养将预包被的t75培养瓶取出，吸弃多余的明胶溶液。将离心所得的单核细胞用上述细胞培养基重悬。转移到处理后的t75培养瓶中进行培养，接种密度为3×106/瓶。置于氧浓度为1％的细胞培养箱中进行培养。从接种时间开始计时，每3天更换新的细胞培养基，每天在显微镜下观察细胞生长情况，至细胞融合度为70％-80％时，进行传代培养，细胞显微镜下的照片如附图1所示。本实施例实验对象分为实验组和常规组两组。其中，实验组培养细胞过程中，细胞培养箱中氧浓度维持在1％。常规组按传统的fandrich教授的技术培养，在第12天分别从两组中获取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第0天)，数值即为细胞的扩增倍数。结果如表1所示：在培养的第12天，本法的细胞扩增倍数均显著高于常规组，p<0.05。表1本方法中氧浓度为1％与常规方法的细胞扩增倍数的比较由表1的数据就可以分析得出，1％氧浓度下的低氧环境能在一定程度上增加多能细胞的活性，影响多能细胞的细胞周期，进而显著的促进多能细胞的增殖，多能细胞的细胞生长速度比常规方法培养的细胞生长速度更快。实施例2一、在5％氧浓度的条件下，本方法与常规方法的细胞扩增倍数的比较本实施例实验对象分为实验组和常规组两组。其中，实验组按实施例1的培养方法培养ppcs细胞，唯一区别在于，细胞培养箱中氧浓度维持在5％。常规组按传统的fandrich教授的技术培养，在第12天从两组取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第0天)，数值即为细胞的扩增倍数。结果如表1所示：在培养的第12天，本法的细胞扩增倍数均显著高于常规组，p<0.05。培养天数(天)012常规组127.73±1.85实验组156.44±2.24表2本方法中氧浓度为5％与常规方法的细胞扩增倍数的比较由表2的数据就可以分析得出，5％氧浓度下的低氧环境能在一定程度上增加多能细胞的活性，影响多能细胞的细胞周期，进而显著的促进多能细胞的增殖，多能细胞的细胞生长速度比常规方法培养的细胞生长速度更快。实施例3一、成纤维细胞上清液对ppcs细胞增殖的影响本实施例中实验组培养ppcs细胞的方法，具体步骤如下：1.培养瓶的包被将t75培养瓶用0.1％的明胶包被，在细胞培养的前一天，将3ml0.1％的明胶溶液均匀地铺满瓶底，37℃培养箱中过夜。2.成纤维细胞上清液的配制成纤维细胞以4×106/瓶接种于t75瓶中，培养基为10％knockout血清替代品的dmem/f12培养基，在37℃下，放置于5％co2的培养箱中培养。三天后，收集培养瓶中的上清液，1000g下离心5分钟，去除漂浮的细胞和细胞碎片，上清转移到新的离心管中，用0.22微米的无菌滤膜过滤，分装保存在冰箱中。3.细胞培养基配制培养细胞所使用的培养基中一半体积为成纤维细胞的细胞上清液，另一半体积为包含有10％knockoutserumreplacement(gibco-brl,cat.no.10828)、1％双抗、0.007ul/mlb-巯基乙醇(sigma,cat.no.m7522)、10ng/mlscf以及100u/mlil-3的dmem/f12(1:1)(gibco-brl,cat.no.11330)的培养基。4.人单核细胞的提取由于治疗用多能细胞需要从约500ml外周血中进行单核细胞的提取，因此，本实施例中选用美国泰尔茂比斯特医疗产品贸易(上海)有限公司生产的血细胞单采机(spectraoptia血液分离系统)进行单核细胞的采集。使用机器采集代替人工采集的优势是，只取我们需要的单核细胞，而不需要的其它成份，血浆和红细胞等，直接回输人体，从而将对个体造成的影响降低到最小。将机器采集的单核细胞洗涤和重悬，使用成纤维细胞的细胞上清液进行，使用成纤维细胞培养3天后的细胞上清液，每次的离心条件为200g离心10分钟。5.二维培养将预包被的t75培养瓶取出，吸弃多余的明胶溶液。将离心所得的单核细胞用上述细胞培养基重悬。转移到处理后的t75培养瓶中进行培养，接种密度为3×106/瓶。置于氧浓度为1％-5％的细胞培养箱中进行培养。从接种时间开始计时，每3天更换新的细胞培养基，每天在显微镜下观察细胞生长情况，至细胞融合度为70％-80％时，进行传代培养。本实施例实验对象分为实验组和常规组两组，其中，常规组与实验组相比唯一区别是培养基中不含有成纤维细胞上清液，全部为包含有10％knockout血清替代品、1％双抗、0.007ul/mlb-巯基乙醇、10ng/mlscf以及100u/mlil-3的dmem/f12培养基。在第12天从两组中取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第0天)，数值即为细胞的扩增倍数。结果如表3所示：在培养的第12天，本法的细胞扩增倍数均显著高于常规组，p<0.05。培养天数(天)012常规组120.05±1.54实验组155.28±1.05表3本方法与常规方法的细胞扩增倍数的比较由表3的数据就可以分析得出，成纤维细胞作为饲养细胞，其上清液中包含成纤维细胞分泌的多种生长因子，为多能细胞提供更好的营养，更能模拟体内环境，显著的促进多能细胞的增殖。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。当前第1页12