一种用于HLA-B基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法与流程

文档序号:15457529发布日期:2018-09-15 01:32
本发明属于基因检测领域,具体涉及一种用于HLA-B基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法。
背景技术
:人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,简称HLA),编码基因位于6号染色体短臂上,全长约4000Kb,是目前所知人类最复杂的遗传多态性系统,与人类的免疫系统功能密切相关。HLA又被称为移植抗原,是决定移植排斥反应高低的重要因素。在进行器官移植时,供者和受者之间HLA相容程度越高,排斥反应的发生率就越低,移植成功率和移植器官患者长期存活率就越高;反之,就越容易发生排斥反应。因此,对HLA进行高效准确的分型对器官移植至关重要。HLA基因分成三类:I类、II类和III类基因。其中,I类包括:HLA-A、HLA-B、HLA-C基因;II类包括:HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1基因。HLA分型方法包括血清学分型法、细胞学分型法以及分子生物学分型法。随着分子生物学技术的飞速发展,传统的血清学和细胞学分型方法已逐步被分子生物学分型方法所取代。现阶段,HLA分子分型方法主要有:多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP),多聚酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP),多聚酶链反应-序列特异性寡核苷酸反应(PCR-SSOP),基因芯片和测序分型(PCR-SBT)等。以聚合酶链反应(PCR)为基础的HLA-B测序分型(PCR-SBT)方法是最准确可靠HLA-B基因分型方法,是世界卫生组织(WHO)推荐的HLA-B基因分型方法的“金标准”。国际专利文献WO2011035550A1公开一种HLA基因扩增和基因分型方法及其相关引物,该专利还提供了HLA基因分型的方法以及所述方法中使用的扩增引物对和测序引物,应用本发明提供的扩增引物对和测序引物以及基因分型方法,能够在扩增全长基因的基础上进行基因分型,但是该技术使用一对引物对HLA-B基因的8个外显子进行扩增,HLA-B的全长基因为2.5kb,片段相对较长,因此扩增难度比较大,对DNA模板的要求较高,同时需要高保真的酶,高保真酶的成本较高,不能满足大规模样本HLA-B基因分型的需求。因此,需要一种成本较低,准确率和分辨率高的HLA-B基因分型方法,用于大规模样本的HLA-B基因分型。技术实现要素:本发明要解决的技术问题在于存在的HLA-B基因全长片段较长,DNA模板完整性要求高,扩增难度大,成本高,不能满足大规模样本HLA-B分型的问题,本发明提供一种用于HLA-B基因扩增、高分辨分型的引物组、试剂盒和方法。为此,本发明提供了一种用于HLA-B基因扩增的引物组,根据HLA-B基因的8个外显子区设计至少两组引物,利用所述引物对所述HLA-B基因进行PCR扩增,得到基因片段长度小于1.5kb的产物。所述的用于HLA-B基因扩增的引物组,根据HLA-B基因的8个外显子区设计两组引物,采用第一组引物PCR扩增HLA-B基因第1个外显子至第3个外显子,采用第二组引物PCR扩增HLA-B基因第4个外显子至第8个外显子。所述的用于HLA-B基因扩增的引物组,所述第一组引物的核苷酸序列包括如下(a1)-(a4)序列中的任意一种:(a1)序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示;或(a2)为(a1)中所述的序列中至少一个序列的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列;或(a3)为(a1)中所述的序列中至少一个序列的在5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列;或(a4)为(a1)中所述的序列中至少一个序列的中部增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列;所述第二组引物的核苷酸序列包括如下(b1)-(b4)序列中的任意一种:(b1)序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示;或(b2)为(b1)中所述的序列中至少一个序列的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列;或(b3)为(b1)中所述的序列中至少一个序列的在5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列;或(b4)为(b1)中所述的序列的中部增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列。优选的,所述的用于HLA-B基因扩增的引物组,上述增加、减少和/或取代的核苷酸选自A、T、C或G。所述的用于HLA-B基因扩增的引物组,所述第一组引物PCR扩增HLA-B基因片段长度为1.2kb,所述第二组引物PCR扩增HLA-B基因片段长度为1.4kb。本发明提供了一种用于HLA-B基因扩增的试剂盒,包括所述的用于HLA-B基因扩增的引物组。所述的用于HLA-B基因扩增的试剂盒,包括HLA-B基因扩增的PCR反应体系,以20μL为计,如下:2×PCRbuffer,10μl;引物B-F1,5μM,0.8μl;引物B-R1,5μM,0.8μl;引物B-F2,5μM,0.8μl;引物B-R2,5μM,0.8μl;DNA模板,20-50ng/μl,2μl;Taq酶,5U/μL,0.15μl;余量用纯水补足至20μL。优选的,所述的用于HLA-B基因扩增的试剂盒,所述HLA-B基因扩增的PCR反应体系中,引物用Invitrogen10XPCRBuffer(-MgCl2)的100倍稀释液稀释至5μM。优选的,所述的用于HLA-B基因扩增的试剂盒,所述HLA-B基因扩增的PCR反应体系中,2×PCRbuffer配方如下,以10μl为计:dNTP,25mM,0.16μl;MgCl2,20-30mM,1.8μl;DTT,1M,0.03μl;100%DMSO,0.27μl;Betain,5M,2.16μl;BSA,20mg/ml,0.01μl;Thermo10XTaqBufferwith(NH4)2SO4,2μl;余量以纯水补足至10μL。本发明提供了一种HLA-B基因扩增的方法,包括利用所述的用于HLA-B基因扩增的引物组或所述的用于HLA-B基因扩增的试剂盒PCR扩增HLA-B基因。所述的HLA-B基因扩增的方法,所述HLA-B基因扩增的PCR反应程序如下:96℃预变性2min;96℃保持30Sec(秒),65℃保持30Sec(秒),72℃保持2min,反应5个循环;96℃保持30Sec(秒),62℃保持30Sec(秒),72℃保持2min,反应35个循环;10℃保存。本发明提供了一种HLA-B基因高分辨分型的方法,包括如下步骤:S1、从人离体的组织或血液中获取待测样品DNA;S2、利用所述的用于HLA-B基因扩增的引物组、所述的用于HLA-B基因扩增的试剂盒和/或所述的HLA-B基因扩增的方法PCR扩增HLA-B基因;S3、将S2步骤中扩增出的PCR产物进行纯化并测序;S4、将步骤S3中的测序结果与标准HLA-B基因序列进行比对,确定待测样本的HLA-B基因的型别。所述的HLA-B基因高分辨分型的方法,在S3步骤中,采用Sanger法测序。所述的HLA-B基因高分辨分型的方法,在S3步骤中采用的Sanger测序引物的核苷酸序列包括如下序列中的任意一种:(c1)序列如SEQIDNO.5-SEQIDNO.10所示;或(c2)为(c1)中所述的序列中至少一个序列的5’端、3’端和/或中部增加、减少和/或取代1个核苷酸的序列。所述的HLA-B基因高分辨分型的方法,在S3步骤中,Sanger测序扩增反应体系,以10μL为计为:测序引物,5μM,0.75μl;测序模板DNA,2.0μl;BigDyeTerminatorv3.1ReadyReactionMix(ABI),0.25μl;Sequencingbuffer,3.0μl;加ddH2O至10μl。优选的,所述的HLA-B基因高分辨分型的方法,所述Sanger测序引物用Invitrogen10XPCRBuffer(-MgCl2)的100倍稀释液稀释至5μM。优选的,所述的HLA-B基因高分辨分型的方法,所述Sequencingbuffer配方如下:5XsequencingBuffer(ABI),2μl;Betain,5M,1μl;dNTPs,20-25mM,0.0005μl。所述的HLA-B基因高分辨分型的方法,在S3步骤中,Sanger测序扩增程序如下:96℃预变性1min;96℃保持10Sec,60℃保持2min,反应40个循环;10℃保存。优选的,所述的HLA-B基因高分辨分型的方法,在S3步骤中,Sanger测序包括如下步骤:Q1、将步骤S2得到的扩增产物进行酶切纯化,所使用的酶为ThermoFisherFastAP热敏感碱性磷酸酶和NEBExonucleaseI(E.coli);Q2、利用所述测序引物,将步骤Q1得到的纯化产物进行PCR反应;Q3、将步骤Q2得到的扩增产物采用乙醇/EDTA法纯化,然后进行毛细管电泳测序。本发明提供了一种用于HLA-B基因高分辨分型的测序引物组,包括如下序列中的任意一种:(c1)序列如SEQIDNO.5-SEQIDNO.10所示;或(c2)为(c1)中所述的序列中至少一个序列的5’端、3’端和/或中部增加、减少和/或取代1个核苷酸的序列的序列。其中,测序引物SEQIDNO.5-SEQIDNO.6用于测序HLA-B基因的2号外显子,测序引物SEQIDNO.7-SEQIDNO.8用于测序HLA-B基因的3号外显子,测序引物SEQIDNO.9-SEQIDNO.10用于测序HLA-B基因的4号外显子。优选的,所述的用于HLA-B基因扩增的引物组,上述增加、减少和/或取代的核苷酸选自A、T、C或G。本发明提供了一种用于HLA-B基因高分辨分型的试剂盒,包括所述的用于HLA-B基因扩增的引物组、所述的用于HLA-B基因扩增的试剂盒和/或所述的用于HLA-B基因高分辨分型的测序引物组。所述的用于HLA-B基因高分辨分型的试剂盒,还包括测序扩增反应体系,以10μL为计为:测序引物,5μM,0.75μl;测序模板DNA,2.0μl;BigDyeTerminatorv3.1ReadyReactionMix(ABI),0.25μl;Sequencingbuffer,3.0μl;加ddH2O至10μl。本发明技术方案,具有如下优点:1、本发明提供的用于HLA-B基因扩增的引物组,根据HLA-B基因的8个外显子区设计至少两组引物,利用所述引物对所述HLA-B基因进行PCR扩增,得到基因片段长度小于1.5kb的产物;通过上述引物PCR扩增HLA-B基因,使得扩增产物的基因片段长度小于1.5kb,对模板的完整性要求降低,扩增效率高,扩增反应时间短,成本降低,可以满足大规模样本HLA-B基因的扩增或基因分型的需求。2、本发明提供的用于HLA-B基因扩增的引物组,根据HLA-B基因的8个外显子区设计两组引物,采用第一组引物PCR扩增HLA-B基因第1个外显子至第3个外显子,采用第二组引物PCR扩增HLA-B基因第4个外显子至第8个外显子;采用上述引物组分别对HLA-B基因的外显子1-3和外显子4-8进行特异性扩增,保证了扩增的两个片段的基因长度相近,避免基因长度差距过大,致使扩增系统不稳定,增加扩增难度,进一步的提高扩增效率,缩短扩增反应时间。3、本发明提供的用于HLA-B基因扩增的引物组,所述第一组引物的核苷酸序列包括如下(a1)-(a4)序列中的任意一种:(a1)序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示;或(a2)为(a1)中所述的序列中至少一个序列的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列;或(a3)为(a1)中所述的序列中至少一个序列的在5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列;或(a4)为(a1)中所述的序列中至少一个序列的中部增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列;所述第二组引物的核苷酸序列包括如下(b1)-(b4)序列中的任意一种:(b1)序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示;或(b2)为(b1)中所述的序列中至少一个序列的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列;或(b3)为(b1)中所述的序列中至少一个序列的在5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列;或(b4)为(b1)中所述的序列中至少一个序列的中部增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列;为了能够扩增出HLA-B基因的全外显子,保证所有HLA-B基因的等位基因都被扩增,并提高扩增效率,简化扩增体系,降低扩增成本,上述的引物是按照下述思路进行设计的:(1)要保证所有HLA-B的等位基因都被扩增,需要选取保守区序列设计引物,同时还考虑了HLA基因的多态性,尽量将引物设于无突变位点的保守区,如果找不到合适的保守区,则采用兼并碱基或增设引物以保证所有等位基因的有效扩增,避免漏检基因型。(2)扩增效率最大化,首先控制引物的碱基组成,避免重复序列,控制GC含量在40%-60%范围内,并且引物两端碱基避免出现A/T。同时,同一体系内的引物间的溶解温度差异不宜过大。其次,控制扩增产物长度,扩增产物长度要小于1500bp。(3)扩增体系最简化,要减少同一扩增体系内目标片段的数目,如果扩增片段过多,会造成体系内引物条数过多,会增大引物间相互干扰的可能,并且还增加了试验操作的复杂度。(4)扩增成本最小化,需要通过两方面实现,首先提高引物的扩增效率,这样可以避免使用昂贵的特殊的DNA聚合酶。另外,还要控制扩增产物的长度,如果长度过长,则需要使用价格比较昂贵的长片段扩增专用酶,从而增加了成本。(5)通过对HLA-B基因序列进行分析,综合以上因素,确定最佳扩增方案如下:将HLA-B基因的扩增分两个片段进行,这两个片段分别是外显子1-3(1200bp)和外显子4-8(1400bp)。原因如下:首先,将HLA-B基因的扩增分成上述两个片段,不仅在降低扩增片段长度的同时也考虑了减少扩增片段的要求。如果不分段扩增,则扩增片段过长(>3000bp),造成扩增难度较大。如果按其它方式分段如分成外显子1-2和外显子3-8,则造成其中一个片段过长,也增大扩增难度。如果分成3段或更多段扩增,则需要增设更多引物,增大引物间的相互干扰作用,从而降低扩增效率。其次,在HLA-B的5’NCR、内含子3和3’NCR内存在保守区,该保守区序列符合上述的引物序列要求。因此,通过综合和平衡各种因素,确定了上述的引物序列。4、本发明提供的一种用于HLA-B基因扩增的试剂盒,包括所述的用于HLA-B基因扩增的引物组,利用所述引物组对所述HLA-B基因进行PCR扩增,得到基因片段长度小于1.5kb的产物;通过上述引物PCR扩增HLA-B基因,使得扩增产物的基因片段长度小于1.5kb,对模板的完整性要求降低,扩增效率高,扩增反应时间短,成本降低,可以满足大规模样本HLA-B基因的扩增或基因分型的需求。5、本发明提供的一种用于HLA-B基因扩增的试剂盒,包括HLA-B基因扩增的PCR反应体系,以20μl为计,如下:2×PCRbuffer,10μl;引物B-F1,5μM,0.8μl;引物B-R1,5μM,0.8μl;引物B-F2,5μM,0.8μl;引物B-R2,5μM,0.8μl;Taq酶,5U/μL,0.15μl;余量用纯水补足至20μl;上述的PCR反应体系中不需要使用长片段扩增专用的昂贵、高热稳定和高保真性的DNA聚合酶,并且一个反应体系内即可完成两个片段的同时性扩增,因此在不增加操作步骤的基础上,有效地降低了成本。6、本发明提供的HLA-B基因扩增的方法,包括利用所述的用于HLA-B基因扩增的引物组或所述的用于HLA-B基因扩增的试剂盒PCR扩增HLA-B基因,扩增的产物较短(<1.5kb),对模板的完整性要求降低,扩增效率高,扩增反应时间短。7、本发明提供的HLA-B基因高分辨分型的方法,包括如下步骤:S1、从人离体的组织或血液中获取待测样品DNA;S2、利用所述的用于HLA-B基因扩增的引物组、所述的用于HLA-B基因扩增的试剂盒和/或所述的HLA-B基因扩增的方法PCR扩增HLA-B基因;S3、将步骤S2中扩增出的PCR产物进行纯化并测序;S4、将步骤S3中的测序结果与标准HLA-B基因序列进行比对,确定待测样本的HLA-B基因的型别;通过上述方法中的引物组PCR扩增HLA-B基因,使得扩增产物的基因片段长度小于1.5kb,对模板的完整性要求降低,扩增效率高,扩增反应时间短,成本降低,可以满足大规模样本HLA-B基因的扩增或基因分型的需求,为临床HLA配型提供更加准确的依据,为患者提供合适的移植供者,降低移植过程中的排异反应,提高器官移植的成功率和患者生存率。8、本发明提供的用于HLA-B基因高分辨分型的试剂盒包括了所述的用于HLA-B基因扩增的引物组、所述的用于HLA-B基因扩增的试剂盒和/或所述的用于HLA-B基因高分辨分型的测序引物组,可以与市面上大多数Taq酶配套使用,不仅有效降低了成本,同时增加了试剂盒适用性。9、本发明提供的用于HLA-B基因高分辨分型的试剂盒可以满足大规模HLA-B基因分型的需求,具有高效、快速等优点。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例1中引物组扩增区域示意图;其中E,Exon外显子;In,intron内含子;F,fragment,扩增片段;图2为本发明实施例1中8个样本HLA-B基因1-8号外显子多重PCR产物电泳检测结果;图3为本发明实施例8中对96个样本进行HLA-B基因高分辨分型的结果;附图标记说明:E-外显子;In-内含子;F-扩增片段。具体实施方式实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。下述实施例中所涉及的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。实施例1HLA-B基因的扩增1.样本DNA提取使用QlAamp血液提取试剂盒(QIAGEN)对96份已知HLA-B基因型别的血液样本提取DNA。采用紫外分光光度计对提取的DNA样品进行浓度测定,将提取得到DNA样品浓度调整至20-50ng/μl。2.设计HLA-B基因扩增引物根据IMGT/HLA数据库(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)中最新的HLA-B基因序列,如图1所示,HLA-B基因有8个外显子,寻找多组(每组两个)合适的保守区域,并且保证每组保守区域能够覆盖HLA-B基因的8个外显子区。在找到的多组保守区域内,分别设计合适的扩增引物,当遇到几种等位基因序列不一致时,采用简并碱基,或设计一条新的等位基因组特异性扩增引物。最重要的是,保证设计出的每组候选引物具有相似的物理特性和反应动力学,以便能在同一条件下进行扩增反应。经过筛选确定两组引物,第一组扩增引物为B-F1和B-R1(B-R1序列中存在S,S是表示C或G,核心序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示,其中SEQIDNO.2(引物B-R1)序列中存在的S是表示核苷酸C或G,利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3,第二组扩增引物为B-F2和B-R2,核心序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示,利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子4-8。3.HLA-B基因PCR扩增(1)向标记好的离心管加入表1所示的PCR反应混合液。首先将2×PCRbuffer、B-F1、B-R1、B-F2、和B-R2配制成PCR扩增预混液,然后将稀释好的DNA样品、PCR扩增预混液和Taq酶配成PCR反应液。表1中的引物用Invitrogen10XPCRBuffer(-MgCl2)的100倍稀释液稀释至5μM。其中,引物B-R1的稀释液中包括2种等量的B-R1引物,即第一种为序列SEQIDNO.2中的S为碱基C;第二种为序列SEQIDNO.2中的S为碱基G。表1:PCR扩增反应体系试剂名称体积2×PCRbuffer10μlB-F1(5μM)0.8μlB-R1(5μM)0.8μlB-F2(5μM)0.8μlB-R2(5μM)0.8μlDNA模板(20-50ng/μl)2μlTaq酶(5U/μL)0.15μlddH2O4.65μl总体积20μL上述的表1中的2×PCRbuffer配方如下表2,表2:2×PCRbuffer配方(2)将步骤(1)中的PCR反应液放到GeneAmpPCRsystem9700仪上进行PCR反应,扩增条件如下:(3)将步骤(2)得到的PCR反应产物取5μl进行1.6%的琼脂糖凝胶电泳检测。图2显示了其中8个样品的HLA-B基因PCR扩增条带:每一个扩增样品均有两条特异性扩增条带,下方条带长度为1.2kb,表示第1外显子至第3外显子的长度;上方条带长度为1.4kb,表示第4外显子至第8外显子的长度。其他样品的结果与此相同。上述结果表明两组扩增引物能够分别对HLA-B基因的外显子1-3和外显子4-8进行特异性扩增,同时两个反应可在同一个反应体系内进行,因此大大缩短了扩增时间,简化了反应步骤,有效地降低了成本。实施例2HLA-B基因的扩增本实施例与实施例1基本相同,区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和B-R1的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F1和B-R1的5’端和3’端各增加8个核苷酸,所述核苷酸可选自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤),在本实施例中5’端的5’→3’增加GGCTACAT,3’端的5’→3’增加TTTGAACC,利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3,第二组扩增引物为B-F2和B-R2的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F2和B-R2的5’端和3’端增加1个核苷酸的序列,在本实施例中5’端的5’→3’增加G,3’端的5’→3’增加C,利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。实施例3HLA-B基因的扩增本实施例与实施例1基本相同,区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和B-R1的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F1和B-R1的5’端和3’端增加1个核苷酸,所述核苷酸可选自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤),在本实施例中5’端增加C,3’端增加G,利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3,第二组扩增引物为B-F2和B-R2的5’端和/或3’端增加小于或等于8个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F2和B-R2的5’端和3’端增加8个核苷酸的序列,在本实施例中5’端的5’→3’增加CACAGTGT,3’端的5’→3’增加CCCAGAAG,利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。实施例4HLA-B基因的扩增本实施例与实施例1基本相同,区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和B-R1的5’端和/或3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F1和B-R1的5’端和3’端减少3个核苷酸,利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3,第二组扩增引物为B-F2和B-R2的5’端和3’端减少小于或等于3个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F2和B-R2的5’端和3’端减少1个核苷酸的序列,利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。实施例5HLA-B基因的扩增本实施例与实施例1基本相同,区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和B-R1的中部增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F1和B-R1的中部增加2个核苷酸所述核苷酸可选自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤),利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3,第二组扩增引物为B-F2和B-R2的中部减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F2和B-R2的中部减少1个核苷酸的序列,利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。实施例6HLA-B基因的扩增本实施例与实施例1基本相同,区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和B-R1的中部增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F1和B-R1的中部减少1个核苷酸,利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3,第二组扩增引物为B-F2和B-R2的中部减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F2和B-R2的中部增加1个核苷酸的序列,在本实施例中两引物中部均增加T,利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。实施例7HLA-B基因的扩增本实施例与实施例1基本相同,区别仅在于第一组扩增引物为B-F1和B-R1的中部增加、减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F1和B-R1的中部取代1个核苷酸,利用第一组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子1-3,第二组扩增引物为B-F2和B-R2的中部减少和/或取代小于或等于2个核苷酸的序列,在本实施例中为分别在B-F2和B-R2的中部取代2个核苷酸的序列,利用第二组扩增引物能够扩增出HLA-B基因的外显子4-8。采用上述引物进行基因扩增的结果与实施例1中的扩增结果一致。实施例8基于一代(Sanger法)测序技术的HLA-B基因分型(1)PCR产物纯化和稀释分别取1.6μlThermoFisherFastAP和0.4μlNEBExonucleaseI(E.coli)加入到实施例1中的得到的各PCR扩增产物中,将样品板放到PCR仪上,启动酶纯化程序:37℃温育15min,85℃酶灭活15min。纯化程序完成后,用无菌水按照1:3比例对样品进行稀释。(2)测序扩增分别配制HLA-B基因外显子2、3和4的测序扩增反应体系,反应体系如表3所示。表3:测序扩增反应体系HLA-B基因外显子2、3和4的测序正向引物分别为SB-2F、SB-3F和SB-4F,核心序列分别如SEQIDNO.5、SEQIDNO.7和SEQIDNO.9所示;外显子2、3和4的测序反向引物分别为SB-2R、SB-3R和SB-4R,核心序列分别如SEQIDNO.6、SEQIDNO.8和SEQIDNO.10所示。其中SB-3R引物(SEQIDNO.8)中的S是表示核苷酸C或G,该引物稀释液为包括2种等量SB-3R引物,即SB-3R引物(SEQIDNO.8)中的S表示核苷酸C和SB-3R引物(SEQIDNO.8)中的S表示核苷酸G的两种引物。上述测序引物用Invitrogen10XPCRBuffer(-MgCl2)的100倍稀释液稀释至5μM。上述表2中的Sequencingbuffer配方如下:5XsequencingBuffer(ABI)2μl、5MBetain1μl、20-25mMdNTPs0.0005μl。将测序引物、Sequencingbuffer和ddH2O预先配置成测序预混液,之后将7.75μl测序预混液(表3),0.25μlBigDyeTMTerminatorMix(CycleSequencingKitVersion3.1),2μl步骤(1)中纯化稀释的PCR产物混合,震荡混匀后,瞬时离心,将样品放在GeneAmpPCRsystem9700(AppliedBiosystems)仪器上,按照以下测序扩增程序进行测序扩增:(3)测序扩增产物纯化将步骤(2)中得到的测序扩增产物采用乙醇/EDTA法进行纯化,具体步骤如下:a.向测序扩增产物中加入2.5μl的125mMEDTA,震荡混匀,最大转速离心15s;b.加入30μl无水乙醇,充分混匀,室温避光放置10min;c.在4℃下,2250g离心30min;d.将反应管倒扣,转速100g离心1min;e.向反应管中加入50μl新鲜配制的80%乙醇,之后在4℃,2250g离心30min;f.将反应管倒扣,100g离心1min;g.取出反应管,室温避光放置10min,至乙醇彻底挥发;h.向反应管中加入10μl高纯甲酰胺,充分震荡混匀后,瞬时离心,准备上机测序。(4)上机测序将步骤(3)中纯化好的样品放入ABI3130xl测序仪中进行测序;作为进一步的变性,还可以将步骤(3)中纯化好的样品放入ABI3730xl测序仪中进行测序。实施例9基于一代(Sanger法)测序技术的HLA-B基因分型本实施例与实施例8基本相同,区别仅在于所述测序引物SB-2F、SB-3F、SB-4F、SB-2R、SB-3R和SB-4R的5’端、3’端和/或中部增加、减少和/或取代1个核苷酸的序列,在本实施例中所述测序引物SB-2F、SB-3F、SB-4F、SB-2R、SB-3R和SB-4R的5’端增加1个核苷酸,所述核苷酸可选自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤),在本实施例中选择A。采用上述引物进行基因测序的结果与实施例8的测序结果一致。实施例10基于一代(Sanger法)测序技术的HLA-B基因分型本实施例与实施例8基本相同,区别仅在于所述测序引物SB-2F、SB-3F、SB-4F、SB-2R、SB-3R和SB-4R的5’端、3’端和/或中部增加、减少和/或取代1个核苷酸的序列,在本实施例中所述测序引物SB-2F、SB-3F、SB-4F、SB-2R、SB-3R和SB-4R的3’端增加1个核苷酸,所述核苷酸可选自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤),在本实施例中选择T。采用上述引物进行基因测序的结果与实施例8的测序结果一致。实施例11基于一代(Sanger法)测序技术的HLA-B基因分型本实施例与实施例8基本相同,区别仅在于所述测序引物SB-2F、SB-3F、SB-4F、SB-2R、SB-3R和SB-4R的5’端、3’端和/或中部增加、减少和/或取代1个核苷酸的序列,在本实施例中所述测序引物SB-2F、SB-3F、SB-4F、SB-2R、SB-3R和SB-4R的5’端和3’端各增加1个核苷酸,所述核苷酸可选自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤),在本实施例中5’端选择C,3’端选择G。采用上述引物进行基因测序的结果与实施例8的测序结果一致。实施例12基于一代(Sanger法)测序技术的HLA-B基因分型本实施例与实施例8基本相同,区别仅在于所述测序引物SB-2F、SB-3F、SB-4F、SB-2R、SB-3R和SB-4R的5’端、3’端和/或中部增加、减少和/或取代1个核苷酸的序列,在本实施例中所述测序引物SB-2F、SB-3F、SB-4F、SB-2R、SB-3R和SB-4R的中部增加1个核苷酸,所述核苷酸可选自A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)或G(鸟嘌呤),在本实施例中选择G。采用上述引物进行基因测序的结果与实施例8的测序结果一致。实施例13结果分析参考IMGT的最新HLA数据库,使用专业分型软件JSISeqPilot对实例8的测序结果进行分析比对,得到HLA-B基因的分型结果,如图3所示。本实施的所有96个样本的分型结果均达到了高分辨分型结果标准,且与已知的样本HLA-B分型结果完全一致。对比例1采用国际专利文献WO2011035550A1实施例1所公开的基因分型方法(记为X1)进行基因分型。用已知分型的样品,采用本发明方法及X1分型方法对比,均与已知分型结果一致。PCR扩增:用X1方法,基因扩增难度大,且必须用高保真Taq酶,而本发明方法,仅需要用普通Taq酶即可以扩增出目的条带。本发明方法扩增效果好,如图2所示,电泳图中可以清晰的看到PCR扩增产物为1.2kb(外显子1-3)和1.4kb(外显子4-8)两条特异性条带。显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。序列表<110>北京诺诗康瀛基因技术股份有限公司<120>一种用于HLA-B基因扩增、基因分型的引物组、试剂盒和方法<130>HA201800466<160>10<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工合成(B-F1)<400>1ggtcccagttctaaagtccccacg24<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成(B-R1)<400>2tccattcaasggagggcgac20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成(B-F2)<400>3tgttccccgctcagagactc20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工合成(B-R2)<400>4cacacgcgaaacatcccaatc21<210>5<211>17<212>DNA<213>人工合成(SB-2F)<400>5gcgccgggaggagggtc17<210>6<211>19<212>DNA<213>人工合成(SB-2R)<400>6ggatggggagtcgtgacct19<210>7<211>17<212>DNA<213>人工合成(SB-3F)<400>7acggggctgaccgcggg17<210>8<211>20<212>DNA<213>人工合成(SB-3R)<400>8aasggagggcgacattctag20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工合成(SB-4F)<400>9ggtcacatgggtggtcctag20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工合成(SB-4R)<400>10ggctcctgctttccctgaga20当前第1页1 2 3 
再多了解一些
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