本发明属于动物免疫技术领域，具体涉及一种猪mir-27b-3p作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,prrs)，又称蓝耳病，是由猪蓝耳病病毒(prrsv)感染引起的一种危害极大的传染性免疫抑制性疾病，以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。由于prrsv具有变异快且复杂、免疫抑制、存在抗体依赖性增强作用等特征，目前采用疫苗等手段未能取得满意的效果，prrs防制需要探索新的途径。
prrsv具有两个典型的生物学特征，一是具有严格的宿主和细胞嗜性，它只感染猪，不感染其他物种，且主要感染单核巨噬细胞系中分化完全的细胞，尤其是猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolarmacrophages，pam)。在体外，prrsv可在pam和猴肾细胞系及其衍生细胞系(marc-145、ma-104等)中增殖。第二就是抑制宿主天然免疫，prrsv可以通过多种途径抑制ⅰ型干扰素激活，从而逃逸宿主天然免疫。
microrna(mirna)是一类长约22个碱基、高度保守的内源性非编码rna分子，能够互补或部分互补的与靶mrna结合，使mrna降解或介导其翻译抑制，作为重要的转录后调节因子调控基因的表达。mirna几乎参与调控了各个领域的所有细胞生命活动的发生，在哺乳动物中它们可能负责调控约50％的编码基因。在病毒感染和宿主天然免疫中，mirna也发挥着重要作用，参与病毒与宿主的互作。
申请人利用高通量测序技术分析了pams在感染prrsv前后差异表达mirnas，发现ssc-mir-27b-3p在prrsv感染后显著下调表达，进一步研究发现其可以显著抑制prrsv在细胞中的增殖，本发明为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了设计靶点。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，合成一个猪内源性mirnassc-mir-27b-3p序列，利用该序列作为抑制猪蓝耳病病毒(prrsv)在细胞中的复制与增殖，可作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用，例如可以制备成试剂盒或药物等的应用。
申请人发现了ssc-mir-27b-3p序列的新功能，它是猪mir-27b-3p的成熟序列，该序列如序列表seqidno：1所示(即：uucacaguggcuaaguucugc)。将人工合成的ssc-mir-27b-3p序列转染marc-145或pam细胞，转染24h后采用猪蓝耳病病毒(prrsv)毒株感染细胞，感染24h后收集细胞，用荧光定量pcr或westernblot方法分别检测细胞内猪蓝耳病病毒rna和蛋白含量，发现ssc-mir-27b-3p序列能显著抑制prrsv在感染细胞中的增殖。
本发明的技术方案如下所述：
猪ssc-mir-27b-3p序列作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用，发明要点在于，转染ssc-mir-27b-3p模拟物序列到易感细胞，使其抑制猪蓝耳病病毒在易感细胞中复制，所述的步骤包括：
(1)将seqidno：1所示的人工合成的ssc-mir-27b-3p序列通过脂质体转染到marc-145细胞中，利用荧光定量pcr检测细胞内ssc-mir-27b-3p表达情况，确定目标序列成功转入靶细胞中；
(2)转染24h后用猪蓝耳病病毒毒株感染marc-145细胞，感染24h后收集marc-145细胞，提取总rna，利用荧光定量pcr检测marc-145细胞内猪蓝耳病病毒的rna含量；
(3)将人工合成的ssc-mir-27b-3p序列通过脂质体转染到pam细胞中，转染24h后用猪蓝耳病病毒毒株感染pam细胞，感染24h后收集pam细胞，提取总rna，利用westernblot方法检测pam细胞内猪蓝耳病病毒的非结构蛋白nsp2含量。
本发明为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了新的设计靶点。所述的序列可以作为制备防治猪蓝耳病病毒(prrsv)药物或试剂的应用，例如可以制备成试剂盒或药物等的应用。
更详细的技术方案和发明效果如《具体实施方式》和《说明书附图》所述。
附图说明
序列表seqidno：1是猪ssc-mir-27b-3p的成熟序列(或称之为ssc-mir-27b-3p序列)。图1：是ssc-mir-27b-3p的定量检测结果。附图标记说明：mir-27bnc表示转染阴性对照mirna模拟物，mir-27bmimics表示转染ssc-mir-27b-3p模拟物，**p<0.01。
图2：是猪蓝耳病病毒(prrsv)rna定量检测结果。附图标记说明：mir-27bnc表示转染阴性对照mirna模拟物，10nm、20nm、80nm、100nm分别表示转染10nm、20nm、80nm、100nm浓度的ssc-mir-27b-3p模拟物，*p<0.05，**p<0.01。
图3：是猪蓝耳病病毒(prrsv)非结构蛋白nsp2的检测结果。附图标记说明：n表示nsp2蛋白，gapdh为内参蛋白，nc表示转染阴性对照，mir-27表示转染ssc-mir-27b-3p模拟物，mir-27-inhibitor表示转染ssc-mir-27b-3p的抑制物。
具体实施方式
实施例1利用ssc-mir-27b-3p序列抑制prrsv在marc-145细胞中的增殖
1.ssc-mir-27b-3p模拟物转染
转染前一天，消化marc-145细胞(购自上海诺辰生物技术有限公司)，并通过细胞计数板对细胞悬液进行计数，以每孔l×l05个细胞进行均匆地铺板，细胞长满80％时开始转染。ssc-mir-27b-3p模拟物按不同浓度稀释好后与脂质体lipofectamine3000(购自美国invitrogen公司)共孵育制备混合液，将混合液加入细胞含有10％fbs(胎牛血清,购自美国gibico公司)的dmem培养基(高糖型，购自北京hyclone公司)中，然后在5％co2、37℃条件下培养24h后收集细胞。同时转染阴性对照模拟物(nc)最为阴性对照。
2.ssc-mir-27b-3p定量检测
marc-145细胞转染ssc-mir-27b-3p模拟物24h后，收集细胞，利用trizol试剂(购自美国invitrogen公司)提取细胞总rna，经dnasei处理后去除基因组污染；利用设计的茎环引物与thermo反转录试剂盒(购自赛默飞(中国)公司)反转录合成第一链的cdna；采用荧光定量pcr技术检测ssc-mir-27b-3p表达量，内参基因为u6基因(genbank登录号nc_010456.5)。mirna的茎环引物序列及退火温度见表1。
表1定量pcr所用引物
2.prrsv感染
接种prrsv病毒(prrsv病毒株由华中农业大学动物科技学院肖少波教授惠赠)前，先将prrsv病毒原液放置冰上慢慢融化。marc-145细胞转染24h后，用moi0.1的prrsv感染细胞，感染24h后收集细胞，利用trizol试剂(购自美国invitrogen公司)提取细胞总rna。
3.prrsvrna定量检测
反转录采用revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(购自美国thermoscientific公司)，荧光定量pcr采用
在marc-145细胞系中转染ssc-mir-27b-3p序列后，转染细胞内ssc-mir-27b-3p表达水平上调表达了160倍(图1)。当prrsv感染过表达ssc-mir-27b-3p的marc-145细胞后，结果发现转染不同浓度的ssc-mir-27b-3p序列后，均可抑制prrsv的rna表达水平(图2)。与阴性对照组(nc)相比，转染80nm浓度的ssc-mir-27b-3p序列后，可使marc-145细胞内prrsv病毒含量下降45％(图2)，说明ssc-mir-27b-3p具有良好的抗病毒效果。
实施例2利用ssc-mir-27b-3p序列抑制prrsv在pam细胞中的增殖
1.pam细胞分离培养
(1)选择4-5周龄左右的健康大白猪(prrsv等各病原检测为阴性)，在干净无菌的环境中取全肺，用pbs缓冲液(加含1％青霉素和链霉素，购自美国gibico)分批次缓慢灌入猪的肺中(灌入量大约为400-500ml)，每次对灌满的肺进行肺部按摩，并用吸管轻轻吹打，使其细胞团及粘液块打散，用无菌纱布过滤收集灌洗液，于1600r/min离心10min后收集细胞。
(2)收集的细胞用含10％fbs、1％青霉素和链霉素的rpmi1640培养液(购自北京hyclone公司)进行洗涤，在1600r/min下离心10min；重复洗涤1-2次。
(3)将洗涤好的细胞，培养于l0cm培养皿中，37℃，5％的co2培养2h。
(4)除去未贴壁的细胞，余下细胞即可消化转入需要的6孔板进行后续试验。分离的细胞若用不完可以冻存于液氮中，细胞冻存液为90％fbs和10％dmso(二甲基亚砜，购自美国gibico公司)。
2.ssc-mir-27b-3p模拟物和抑制物的转染
在6孔板细胞中，ssc-mir-27b-3p模拟物或抑制物按60nm浓度稀释好后与脂质体lipofectamine3000(购自美国invitrogen公司)共孵育制备成混合液，将混合液加入pam细胞培养基中，然后在5％co2、37℃条件下培养24h后收集细胞。同时转染阴性对照模拟物(nc)作为阴性对照。
3.prrsv感染
pam细胞转染24h后，用moi0.1的prrsv感染细胞，感染24h后收集细胞，pbs洗3次后，利用ripa裂解液(强)(购自碧云天生物技术公司)裂解细胞，冰上放置20min后收集裂解液，于12000r/min离心5min，取上清液体，采用bca试剂盒(购自碧云天生物技术公司)测定蛋白浓度。
4.prrsv蛋白定量检测
利用常规的westernblot方法检测各处理组细胞内prrsv非结构蛋白nsp2(genbank登录号np_740596.1)的表达水平，内参基因选择gapdh(genbank登录号xp_005652666.1)。nsp2和gapdh的抗体购自美国爱博泰克生物公司。具体步骤如下：
(1)制胶：装好制胶架，对齐玻璃板后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶，操作时要使两玻璃板对齐，以免漏胶。配制10％的分离胶，加入6ultemed(四甲基乙二胺)后立即摇匀即可灌胶，灌胶高度达7cm左右的分离胶即可，然后在胶上再加一层无水乙醇，灌胶时赢避免气泡的产生。灌胶后在室温下放置30min左右，当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已经凝固。倒掉胶上层的无水乙醇，用吸水纸吸干后，配制4％的浓缩胶，将剩余空间灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中，灌胶时避免气泡的产生，梳子保持水平，凝胶1h左右，待胶完全凝固，拔出梳子。
(2)sds-page凝胶电泳：用常规的电泳缓冲液(购自上海白赛生物技术有限公司)冲洗浓缩胶，将其放入电泳槽。计算含15μg蛋白质的溶液体积为上样量，加入5×sds上样缓冲液(购自上海白赛生物技术有限公司)至终浓度为1×，上样前将蛋白质样品于pcr仪中在95℃下，处理5min后使蛋白质变性。将变性后的蛋白质样品加入电泳孔中，进行电泳。先用200v电压预电泳5min，再用120v电压电泳75min。
(3)转膜：转膜前，将海绵、滤纸、转膜板置于转膜缓冲液(购自上海白赛生物技术有限公司)中浸泡10min，将聚偏氟乙烯膜(pvdf)置于甲醇中浸泡10min后再转入转膜缓冲液中浸泡5min。打开转膜板使黑色一面与桌面保持水平，在黑色板子上垫一层海绵、三层滤纸。小心剥下分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，并用玻璃棒除去气泡。在膜上盖三层滤纸并除去气泡，再盖上一层海绵垫。合上夹子，置于转膜槽中，灌满转膜缓冲液。以120ma电流转膜，转膜时间视目的蛋白的大小而定。
(4)抗原抗体免疫反应：转膜结束后，将转好的膜于室温下置摇床上用1×tbst(购自北京索莱宝科技有限公司)洗3次，每次10min。用5％的脱脂牛奶于37℃封闭1h；用1×tbst稀释一抗，用一抗(gapdh抗体或nsp2抗体，购自美国爱博泰克生物公司)封闭膜后，于4℃孵育过夜(至少为12h)；用1×tbst在室温下将膜洗3次，每次10min，再用1×tbst洗1次，10min；用1×tbst稀释二抗(hrpgoatanti-rabbitigg(h+l)或hrpgoatanti-mouseigg(h+l)，购自美国爱博泰克生物公司)，37℃孵育1h；将封闭膜用1×tbst在室温于摇床上洗3次，每次10min，再用1×tbst洗1次，洗10min。
(5)ecl化学发光检测：操作参照bio-radecl化学发光试剂盒的说明书。将该试剂盒自带的a和b两种试剂在离心管中等体积混合(现配现用)。用镊子将pvdf膜取出，滤纸吸干膜上液体后，将膜放在干净的保鲜膜上，滴加上述配好的a和b混合液加到转有蛋白的膜上，并使工作液均匀覆盖在膜上。放入暗盒，孵育1-3min。在完全避光的暗室中使用显影液和定影液进行显影和定影，胶片扫描，用imagej软件量化灰度值。目标蛋白的相对表达量＝目标蛋白的灰度值/内参蛋白的灰度值。
结果表明，与转染阴性对照模拟物(nc)组相比，在pam细胞系中转染60nm浓度剂量的ssc-mir-27b-3p序列后，可以显著降低细胞内prrsv非结构蛋白nsp2的表达水平(见图3)；而转染60nm浓度剂量的ssc-mir-27b-3p抑制物的序列后，则显著增加了细胞内prrsv非结构蛋白nsp2的表达水平(见图3)。这说明，ssc-mir-27b-3p序列在pam中也具有良好的抗猪蓝耳病病毒增殖的效果。
本发明为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了新的设计靶点。所述的序列可以作为制备防治猪蓝耳病的药物或试剂，例如可以制备成试剂盒或药物组合物等的应用。
序列表
<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>猪mir-27b-3p作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用
<141>2018-04-11
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>rna
<213>猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(21)
<400>1
uucacaguggcuaaguucugc21