猪miR-27b-3p作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用的制作方法

文档序号:15457446发布日期:2018-09-15 01:30

本发明属于动物免疫技术领域,具体涉及一种猪miR-27b-3p作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用。



背景技术:

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),又称蓝耳病,是由猪蓝耳病病毒(PRRSV)感染引起的一种危害极大的传染性免疫抑制性疾病,以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。由于PRRSV具有变异快且复杂、免疫抑制、存在抗体依赖性增强作用等特征,目前采用疫苗等手段未能取得满意的效果,PRRS防制需要探索新的途径。

PRRSV具有两个典型的生物学特征,一是具有严格的宿主和细胞嗜性,它只感染猪,不感染其他物种,且主要感染单核巨噬细胞系中分化完全的细胞,尤其是猪肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophages,PAM)。在体外,PRRSV可在PAM和猴肾细胞系及其衍生细胞系(Marc-145、MA-104等)中增殖。第二就是抑制宿主天然免疫,PRRSV可以通过多种途径抑制Ⅰ型干扰素激活,从而逃逸宿主天然免疫。

MicroRNA(miRNA)是一类长约22个碱基、高度保守的内源性非编码RNA分子,能够互补或部分互补的与靶mRNA结合,使mRNA降解或介导其翻译抑制,作为重要的转录后调节因子调控基因的表达。miRNA几乎参与调控了各个领域的所有细胞生命活动的发生,在哺乳动物中它们可能负责调控约50%的编码基因。在病毒感染和宿主天然免疫中,miRNA也发挥着重要作用,参与病毒与宿主的互作。

申请人利用高通量测序技术分析了PAMs在感染PRRSV前后差异表达miRNAs,发现ssc-miR-27b-3p在PRRSV感染后显著下调表达,进一步研究发现其可以显著抑制PRRSV在细胞中的增殖,本发明为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了设计靶点。



技术实现要素:

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,合成一个猪内源性miRNA ssc-miR-27b-3p序列,利用该序列作为抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在细胞中的复制与增殖,可作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用,例如可以制备成试剂盒或药物等的应用。

申请人发现了ssc-miR-27b-3p序列的新功能,它是猪miR-27b-3p的成熟序列,该序列如序列表SEQ ID NO:1所示(即:UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC)。将人工合成的ssc-miR-27b-3p序列转染Marc-145或PAM细胞,转染24h后采用猪蓝耳病病毒(PRRSV)毒株感染细胞,感染24h后收集细胞,用荧光定量PCR或Western Blot方法分别检测细胞内猪蓝耳病病毒RNA和蛋白含量,发现ssc-miR-27b-3p序列能显著抑制PRRSV在感染细胞中的增殖。

本发明的技术方案如下所述:

猪ssc-miR-27b-3p序列作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用,发明要点在于,转染ssc-miR-27b-3p模拟物序列到易感细胞,使其抑制猪蓝耳病病毒在易感细胞中复制,所述的步骤包括:

(1)将SEQ ID NO:1所示的人工合成的ssc-miR-27b-3p序列通过脂质体转染到Marc-145细胞中,利用荧光定量PCR检测细胞内ssc-miR-27b-3p表达情况,确定目标序列成功转入靶细胞中;

(2)转染24h后用猪蓝耳病病毒毒株感染Marc-145细胞,感染24h后收集Marc-145细胞,提取总RNA,利用荧光定量PCR检测Marc-145细胞内猪蓝耳病病毒的RNA含量;

(3)将人工合成的ssc-miR-27b-3p序列通过脂质体转染到PAM细胞中,转染24h后用猪蓝耳病病毒毒株感染PAM细胞,感染24h后收集PAM细胞,提取总RNA,利用Western Blot方法检测PAM细胞内猪蓝耳病病毒的非结构蛋白NSP2含量。

本发明为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了新的设计靶点。所述的序列可以作为制备防治猪蓝耳病病毒(PRRSV)药物或试剂的应用,例如可以制备成试剂盒或药物等的应用。

更详细的技术方案和发明效果如《具体实施方式》和《说明书附图》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是猪ssc-miR-27b-3p的成熟序列(或称之为ssc-miR-27b-3p序列)。图1:是ssc-miR-27b-3p的定量检测结果。附图标记说明:miR-27b NC表示转染阴性对照miRNA模拟物,miR-27b Mimics表示转染ssc-miR-27b-3p模拟物,**P<0.01。

图2:是猪蓝耳病病毒(PRRSV)RNA定量检测结果。附图标记说明:miR-27b NC表示转染阴性对照miRNA模拟物,10nm、20nm、80nm、100nm分别表示转染10nm、20nm、80nm、100nm浓度的ssc-miR-27b-3p模拟物,*P<0.05,**P<0.01。

图3:是猪蓝耳病病毒(PRRSV)非结构蛋白NSP2的检测结果。附图标记说明:N表示NSP2蛋白,GAPDH为内参蛋白,NC表示转染阴性对照,miR-27表示转染ssc-miR-27b-3p模拟物,miR-27-inhibitor表示转染ssc-miR-27b-3p的抑制物。

具体实施方式

实施例1利用ssc-miR-27b-3p序列抑制PRRSV在Marc-145细胞中的增殖

1.ssc-miR-27b-3p模拟物转染

转染前一天,消化Marc-145细胞(购自上海诺辰生物技术有限公司),并通过细胞计数板对细胞悬液进行计数,以每孔l×l05个细胞进行均匆地铺板,细胞长满80%时开始转染。ssc-miR-27b-3p模拟物按不同浓度稀释好后与脂质体Lipofectamine 3000(购自美国Invitrogen公司)共孵育制备混合液,将混合液加入细胞含有10%FBS(胎牛血清,购自美国Gibico公司)的DMEM培养基(高糖型,购自北京Hyclone公司)中,然后在5%CO2、37℃条件下培养24h后收集细胞。同时转染阴性对照模拟物(NC)最为阴性对照。

2.ssc-miR-27b-3p定量检测

Marc-145细胞转染ssc-miR-27b-3p模拟物24h后,收集细胞,利用Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA,经DNase I处理后去除基因组污染;利用设计的茎环引物与Thermo反转录试剂盒(购自赛默飞(中国)公司)反转录合成第一链的cDNA;采用荧光定量PCR技术检测ssc-miR-27b-3p表达量,内参基因为U6基因(GenBank登录号NC_010456.5)。miRNA的茎环引物序列及退火温度见表1。

表1定量PCR所用引物

2.PRRSV感染

接种PRRSV病毒(PRRSV病毒株由华中农业大学动物科技学院肖少波教授惠赠)前,先将PRRSV病毒原液放置冰上慢慢融化。Marc-145细胞转染24h后,用MOI 0.1的PRRSV感染细胞,感染24h后收集细胞,利用Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA。

3.PRRSV RNA定量检测

反转录采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(购自美国Thermo Scientific公司),荧光定量PCR采用Select Master Mix for CFX(购自美国Applied Biosystems公司)染料,相对定量PCR采用β-actin基因(GenBank登录号NC_010445.4)做内参,每个试验至少重复3次。定量PCR所用引物和退火温度见表1。

在Marc-145细胞系中转染ssc-miR-27b-3p序列后,转染细胞内ssc-miR-27b-3p表达水平上调表达了160倍(图1)。当PRRSV感染过表达ssc-miR-27b-3p的Marc-145细胞后,结果发现转染不同浓度的ssc-miR-27b-3p序列后,均可抑制PRRSV的RNA表达水平(图2)。与阴性对照组(NC)相比,转染80nM浓度的ssc-miR-27b-3p序列后,可使Marc-145细胞内PRRSV病毒含量下降45%(图2),说明ssc-miR-27b-3p具有良好的抗病毒效果。

实施例2利用ssc-miR-27b-3p序列抑制PRRSV在PAM细胞中的增殖

1.PAM细胞分离培养

(1)选择4-5周龄左右的健康大白猪(PRRSV等各病原检测为阴性),在干净无菌的环境中取全肺,用PBS缓冲液(加含1%青霉素和链霉素,购自美国Gibico)分批次缓慢灌入猪的肺中(灌入量大约为400-500mL),每次对灌满的肺进行肺部按摩,并用吸管轻轻吹打,使其细胞团及粘液块打散,用无菌纱布过滤收集灌洗液,于1600r/min离心10min后收集细胞。

(2)收集的细胞用含10%FBS、1%青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液(购自北京Hyclone公司)进行洗涤,在1600r/min下离心10min;重复洗涤1-2次。

(3)将洗涤好的细胞,培养于l0cm培养皿中,37℃,5%的CO2培养2h。

(4)除去未贴壁的细胞,余下细胞即可消化转入需要的6孔板进行后续试验。分离的细胞若用不完可以冻存于液氮中,细胞冻存液为90%FBS和10%DMSO(二甲基亚砜,购自美国Gibico公司)。

2.ssc-miR-27b-3p模拟物和抑制物的转染

在6孔板细胞中,ssc-miR-27b-3p模拟物或抑制物按60nM浓度稀释好后与脂质体Lipofectamine 3000(购自美国Invitrogen公司)共孵育制备成混合液,将混合液加入PAM细胞培养基中,然后在5%CO2、37℃条件下培养24h后收集细胞。同时转染阴性对照模拟物(NC)作为阴性对照。

3.PRRSV感染

PAM细胞转染24h后,用MOI 0.1的PRRSV感染细胞,感染24h后收集细胞,PBS洗3次后,利用RIPA裂解液(强)(购自碧云天生物技术公司)裂解细胞,冰上放置20min后收集裂解液,于12000r/min离心5min,取上清液体,采用BCA试剂盒(购自碧云天生物技术公司)测定蛋白浓度。

4.PRRSV蛋白定量检测

利用常规的Western Blot方法检测各处理组细胞内PRRSV非结构蛋白NSP2(GenBank登录号NP_740596.1)的表达水平,内参基因选择GAPDH(GenBank登录号XP_005652666.1)。NSP2和GAPDH的抗体购自美国爱博泰克生物公司。具体步骤如下:

(1)制胶:装好制胶架,对齐玻璃板后放入夹中卡紧,垂直卡在架子上准备灌胶,操作时要使两玻璃板对齐,以免漏胶。配制10%的分离胶,加入6ul TEMED(四甲基乙二胺)后立即摇匀即可灌胶,灌胶高度达7cm左右的分离胶即可,然后在胶上再加一层无水乙醇,灌胶时赢避免气泡的产生。灌胶后在室温下放置30min左右,当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已经凝固。倒掉胶上层的无水乙醇,用吸水纸吸干后,配制4%的浓缩胶,将剩余空间灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中,灌胶时避免气泡的产生,梳子保持水平,凝胶1h左右,待胶完全凝固,拔出梳子。

(2)SDS-PAGE凝胶电泳:用常规的电泳缓冲液(购自上海白赛生物技术有限公司)冲洗浓缩胶,将其放入电泳槽。计算含15μg蛋白质的溶液体积为上样量,加入5×SDS上样缓冲液(购自上海白赛生物技术有限公司)至终浓度为1×,上样前将蛋白质样品于PCR仪中在95℃下,处理5min后使蛋白质变性。将变性后的蛋白质样品加入电泳孔中,进行电泳。先用200V电压预电泳5min,再用120V电压电泳75min。

(3)转膜:转膜前,将海绵、滤纸、转膜板置于转膜缓冲液(购自上海白赛生物技术有限公司)中浸泡10min,将聚偏氟乙烯膜(PVDF)置于甲醇中浸泡10min后再转入转膜缓冲液中浸泡5min。打开转膜板使黑色一面与桌面保持水平,在黑色板子上垫一层海绵、三层滤纸。小心剥下分离胶盖于滤纸上,将膜盖于胶上,并用玻璃棒除去气泡。在膜上盖三层滤纸并除去气泡,再盖上一层海绵垫。合上夹子,置于转膜槽中,灌满转膜缓冲液。以120mA电流转膜,转膜时间视目的蛋白的大小而定。

(4)抗原抗体免疫反应:转膜结束后,将转好的膜于室温下置摇床上用1×TBST(购自北京索莱宝科技有限公司)洗3次,每次10min。用5%的脱脂牛奶于37℃封闭1h;用1×TBST稀释一抗,用一抗(GAPDH抗体或NSP2抗体,购自美国爱博泰克生物公司)封闭膜后,于4℃孵育过夜(至少为12h);用1×TBST在室温下将膜洗3次,每次10min,再用1×TBST洗1次,10min;用1×TBST稀释二抗(HRP Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)或HRP Goat Anti-Mouse IgG(H+L),购自美国爱博泰克生物公司),37℃孵育1h;将封闭膜用1×TBST在室温于摇床上洗3次,每次10min,再用1×TBST洗1次,洗10min。

(5)ECL化学发光检测:操作参照Bio-Rad ECL化学发光试剂盒的说明书。将该试剂盒自带的A和B两种试剂在离心管中等体积混合(现配现用)。用镊子将PVDF膜取出,滤纸吸干膜上液体后,将膜放在干净的保鲜膜上,滴加上述配好的A和B混合液加到转有蛋白的膜上,并使工作液均匀覆盖在膜上。放入暗盒,孵育1-3min。在完全避光的暗室中使用显影液和定影液进行显影和定影,胶片扫描,用ImageJ软件量化灰度值。目标蛋白的相对表达量=目标蛋白的灰度值/内参蛋白的灰度值。

结果表明,与转染阴性对照模拟物(NC)组相比,在PAM细胞系中转染60nM浓度剂量的ssc-miR-27b-3p序列后,可以显著降低细胞内PRRSV非结构蛋白NSP2的表达水平(见图3);而转染60nM浓度剂量的ssc-miR-27b-3p抑制物的序列后,则显著增加了细胞内PRRSV非结构蛋白NSP2的表达水平(见图3)。这说明,ssc-miR-27b-3p序列在PAM中也具有良好的抗猪蓝耳病病毒增殖的效果。

本发明为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了新的设计靶点。所述的序列可以作为制备防治猪蓝耳病的药物或试剂,例如可以制备成试剂盒或药物组合物等的应用。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 猪miR-27b-3p作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用

<141> 2018-04-11

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(21)

<400> 1

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