一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法与流程

文档序号:15457389发布日期:2018-09-15 01:28

本发明涉及微生物肥料添加剂加工领域,特别是一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法。



背景技术:

共生固氮菌是指能与宿主植物的根部形成特定固氮组织结构—根瘤的一类微生物。它们彼此共生在一起,植物向微生物提供光合产物,供微生物生长发育固氮所需,微生物则向植物提供固定的氮素营养,双方互为有利。这类固氮菌有豆科植物根瘤固氮菌和弗兰克氏菌。据测定,根瘤菌每年每公顷可固定纯氮约为13.3公斤,约折合标准化肥130斤,这些氮素几乎都被可被植物利用。

弗兰克氏菌是放线菌目中的一个唯一能固定大气中氮素的属。它的固氮量又大于豆科根瘤菌的3-5倍以上,占共生固氮总量的60%以上,占地球上氮素来源的80%以上。像桤木根部弗兰克菌固氮量为85-300公斤氮/公顷/年,红枝桤木为140-209公斤氮/公顷/年,沙棘为47-179公斤氮/公顷/年。固定大气中1kg氮素相当于施2.5kg的尿素肥,这些植物一年的固氮量相当于亩施24-50kg的尿素肥,而大豆只相当于亩施14kg尿素。随着放线菌植物树龄的增长,每年都有新增50%以上的新生根瘤,所以固氮总量随树龄的增加成递增式增长。可见,弗兰克氏菌结瘤固氮,对地球上可利用化合态氮的来源与陆地生态系统中氮循环和生态平衡起着极为重要的作用,同时也绿化了大地,提高了土壤肥力,创建和改善了人类生存条件和质量,起到了巨大的生态学效益。

在自然生长环境下,弗兰克菌在300多种放线菌结瘤植物的根部含量很高,但在普通土壤中含量很少,用DNA法测定,一般土壤中弗兰克菌的含量只有106个/克土壤干重,在雨林、耐旱森林和草原土壤中弗兰克菌和丛枝菌根真菌合起来最高含量是340个/克土壤干重,在沿海沼泽森林地是145个/克土壤干重,草原沼泽湿地缺乏到只有61个/克土壤干重,而且绝大多数弗兰克菌不能共生结瘤固氮。普通土壤中弗兰克菌的含量少于细菌上千倍以上,所以,在普通土壤中起不到自生固氮培土增肥的作用。弗兰克菌在100年以前就发现了,但人工培养成功是1976年美国从香蕨木首次分离出来,但它却是一个典型的“慢生菌”,一个繁殖周期需要13-15个小时,要想拿到1g干菌粉,需要几个月的时间。至今为止,世界上科学家们只能进行理论研究,而不能进行应用研究,这就是40年来一直没有解决的瓶颈难题。



技术实现要素:

为了克服现有技术的上述缺点,本发明的目的是提供一种接种效果好、生长速度快、易于大规模工业化生产的速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法,该菌粉作为生物肥料添加剂使用,能固氮配肥,促进植物生长,增肥土壤,杀伤有害菌类,改造退化土壤盐碱土和重金属污染土壤。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:

一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法,包括如下步骤:

S1.选育弗兰克氏菌种:选取放线菌结瘤植物的根部根瘤,通过菌种选育方法进行处理培养,最终筛选得到弗兰克氏菌的纯菌种;

S2.将步骤S1得到的弗兰克氏菌的纯菌种通过基因诱变方法进行处理,得到速生弗兰克氏菌种;

S3.将步骤S2得到的速生弗兰克氏菌种接种到发酵罐里灭过菌的发酵原料

中,形成菌体培养料,设置发酵罐温度为28~32℃,对菌体培养料进行5~7天的发酵培养,形成菌丝;

S4.将步骤S3得到的菌丝进一步分化出孢子,用无菌水进行洗脱,得到菌

液,在菌液中加入无菌活性炭用于吸附孢子,待孢子吸附完成后,将含有孢子的活性炭与液体分离,得到以活性炭为载体的菌体;

S5.将步骤S4得到的菌体通过真空冷冻干燥法进行冻干处理,获得菌粉。

优选地,所述步骤S3中,所述菌体培养料由以下重量比的成分组成:玉米淀粉50-70份、蛋白胨10-50份、酵母浸膏5-10份、磷酸二氢钾1-3份、磷酸氢二钾3-6份、硫酸镁1-4份、氯化钾1-3份、1%的柠檬酸铁1-10份、微量元素液1-10份,速生弗兰克氏菌种0.1-0.5份,无菌活性炭5-10份。

另一种优选地,所述步骤S3中,所述菌体培养料由以下重量比的成分组成:豆粕40-60份、麦麸20-40份、氯化钾1-10份、磷酸二氢钾1-3份、磷酸氢二钾3-6份、硫酸镁1-4份,速生弗兰克氏菌种0.1-0.5份,无菌活性炭10-20份。

优选地,所述步骤S1中,所述菌种选育方法包括根瘤切片法、摇床培养法、酶处理法或蔗糖密度梯度离心法。

优选地,所述步骤S2中,所述基因诱变方法包括紫外线-氯化钾-硫酸二乙酯复合诱变方法或紫外线-失重环境复合诱变方法。

作为本发明的进一步改进:所述步骤S1中,所述放线菌结瘤植物的根部根瘤采用在6~8月份时间采集的2年生的沙棘根部根瘤。

具体地,所述根瘤切片法包括如下步骤:将所述根部根瘤清洗干净,放入95%乙醇中消毒5min;再转入0.1%的氯化汞中进一步消毒灭菌5~10min;然后用无菌水彻底清洗,切成1~3mm的薄片接入QMOD培养基中,在28~30℃条件下培养。

具体地,所述摇床培养法包括如下步骤:将所述根部根瘤清洗干净,挑选出健壮饱满的瘤瓣,用75%的乙醇真空渗入15min;再用无菌的浓度0.15mol/L且pH为7.0的磷酸盐缓冲液洗去残留乙醇;转入0.1%氯化汞溶液中真空渗入消毒10~15min;放入无菌研钵中,加入少量石英砂制成匀浆;经过400目尼龙网过滤,滤液接入QMOD培养基中,在摇床上以28℃且140~180r/min的条件进行震荡培养。

具体地,所述酶处理法包括如下步骤:将所述根部根瘤清洗干净,挑选出健壮饱满的瘤瓣;将瘤瓣表面消毒后,置于0.5%纤维素酶和2%果胶酶的0.65mol/L的甘露醇酶解液中,25℃保温15小时;然后切片,用解剖针破去皮层使菌体释放出来,然后将菌液接种到平板上,在28℃条件下进行划线培养。

具体地,所述蔗糖密度梯度离心法包括如下步骤:将所述根部根瘤清洗干净,在无菌条件下制备得到根瘤匀浆悬液;将得到的根瘤匀浆悬液加入已制备好的10000g不同浓度的蔗糖溶液(25%,30%,35%,40%,45%,50%等),在0~4℃条件下,离心3小时;再在不同浓度蔗糖溶液夹层中吸取菌液,在28℃条件下培养。

进一步具体地,根据所述的一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法制备的一种速生弗兰克氏菌菌粉,作为生物肥料添加剂使用。

优选的,一种速生弗兰克氏菌菌粉的应用。

与现有技术相比,本发明的有益效果是:一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法,其突破了弗兰克菌的“慢生”关,使它的繁殖系数由13小时一代,缩短到30-60分钟一代,得到繁殖速率提高了25倍的速生弗兰克氏菌种,该菌种具有繁殖速度快、抗逆性强,固氮酶活性高等特性,在适合的发酵环境和原料条件下5-7天即可长出菌丝,分化出孢子,接种效果好、生长速度快、易于大规模工业化生产;又通过细胞工程全自动连续发酵方法,在5-7天内即可以获得3-3.5%的速生弗兰克氏菌菌粉,该菌粉作为生物肥料添加剂使用,能固氮配肥,促进植物生长,增肥土壤,杀伤有害菌类,改造退化土壤盐碱土和重金属污染土壤。

具体实施方式

现结合实施案例对本发明进一步说明:

实施案例一:一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法,包括如下步骤:

S1.选育弗兰克氏菌种:选取6~8月份时间采集的2年生的沙棘根部根瘤,通过根瘤切片法进行处理培养,最终筛选得到弗兰克氏菌的纯菌种;

所述根瘤切片法包括如下步骤:将所述根部根瘤清洗干净,放入95%乙醇中消毒5min;再转入0.1%的氯化汞中进一步消毒灭菌8min;然后用无菌水彻底清洗,切成2mm的薄片接入QMOD培养基中,在28℃条件下培养。

S2.将步骤S1得到的弗兰克氏菌的纯菌种通过紫外线-氯化钾-硫酸二乙酯复合诱变方法进行处理,得到速生弗兰克氏菌种;

S3.将步骤S2得到的速生弗兰克氏菌种接种到灭过菌的发酵原料中,得到菌体培养料;所述菌体培养料由以下重量比的成分组成:玉米淀粉70份、蛋白胨10份、酵母浸膏5份、磷酸二氢钾1份、磷酸氢二钾3份、硫酸镁1份、氯化钾1.5份、1%的柠檬酸铁1份、微量元素液2份,速生弗兰克氏菌种0.5份,无菌活性炭5份,将得到的菌体培养料放入发酵罐中,在28℃条件下,进行5天的发酵培养,菌体培养料形成菌丝;

S4.待发酵罐中的菌丝再进一步分化出孢子后,用无菌水进行洗脱,得到菌液,在菌液中加入无菌活性炭用于吸附孢子,待孢子吸附完成后,将含有孢子的活性炭与液体分离,得到以活性炭为载体的菌体;

S5.将步骤S4得到的菌体通过真空冷冻干燥法进行冻干处理,获得菌粉。

实施案例二:一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法,包括如下步骤:

S1.选育弗兰克氏菌种:选取6~8月份时间采集的2年生的沙棘根部根瘤,通过摇床培养法进行处理培养,最终筛选得到弗兰克氏菌的纯菌种;

所述摇床培养法包括如下步骤:将所述根部根瘤清洗干净,挑选出健壮饱满的瘤瓣,用75%的乙醇真空渗入15min;再用无菌的浓度0.15mol/L且pH为7.0的磷酸盐缓冲液洗去残留乙醇;转入0.1%氯化汞溶液中真空渗入消毒12min;放入无菌研钵中,加入少量石英砂制成匀浆;经过400目尼龙网过滤,滤液接入QMOD培养基中,在摇床上以28℃且160r/min的条件进行震荡培养。

S2.将步骤S1得到的弗兰克氏菌的纯菌种通过紫外线-失重环境复合诱变方法进行处理,得到速生弗兰克氏菌种;

S3.将步骤S2得到的速生弗兰克氏菌种接种到灭过菌的发酵原料中,得到菌体培养料;所述菌体培养料由以下重量比的成分组成:玉米淀粉50份、蛋白胨10份、酵母浸膏10份、磷酸二氢钾3份、磷酸氢二钾6份、硫酸镁4份、氯化钾3份、1%的柠檬酸铁3.5份、微量元素液5份,速生弗兰克氏菌种0.5份,无菌活性炭5份,将菌体培养料放入发酵罐中,在32℃条件下,进行7天的发酵培养,形成菌丝;

S4.待发酵罐中的菌丝再进一步分化出孢子后,用无菌水进行洗脱,得到菌液,在菌液中加入无菌活性炭用于吸附孢子,待孢子吸附完成后,将含有孢子的活性炭与液体分离,得到以活性炭为载体的菌体;

S5.将步骤S4得到的菌体通过真空冷冻干燥法进行冻干处理,获得菌粉。

实施案例三:一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法,包括如下步骤:

S1.选育弗兰克氏菌种:选取6~8月份时间采集的2年生的沙棘根部根瘤,通过酶处理法进行处理培养,最终筛选得到弗兰克氏菌的纯菌种;

所述酶处理法包括如下步骤:将所述根部根瘤清洗干净,挑选出健壮饱满的瘤瓣;将瘤瓣表面消毒后,置于0.5%纤维素酶和2%果胶酶的0.65mol/L的甘露醇酶解液中,25℃保温15小时;然后切片,用解剖针破去皮层使菌体释放出来,然后将菌液接种到平板上,在28℃条件下进行划线培养。

S2.将步骤S1得到的弗兰克氏菌的纯菌种通过紫外线-氯化钾-硫酸二乙酯复合诱变方法进行处理,得到速生弗兰克氏菌种;

S3.将步骤S2得到的速生弗兰克氏菌种接种到灭过菌的发酵原料中,得到菌体培养料;所述菌体培养料由以下重量比的成分组成:豆粕50份、麦麸20份、氯化钾10份、磷酸二氢钾3份、磷酸氢二钾5.5份、硫酸镁1份,速生弗兰克氏菌种0.5份,无菌活性炭10份,将得到的菌体培养料放入发酵罐中,在30℃条件下,进行6天的发酵培养,形成菌丝;

S4.待发酵罐中的菌丝再进一步分化出孢子后,用无菌水进行洗脱,得到菌液,在菌液中加入无菌活性炭用于吸附孢子,待孢子吸附完成后,将含有孢子的活性炭与液体分离,得到以活性炭为载体的菌体;

S5.将步骤S4得到的菌体通过真空冷冻干燥法进行冻干处理,获得菌粉。

实施案例四:一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法,包括如下步骤:

S1.选育弗兰克氏菌种:选取6~8月份时间采集的2年生的沙棘根部根瘤,通过蔗糖密度梯度离心法进行处理培养,最终筛选得到弗兰克氏菌的纯菌种;

所述蔗糖密度梯度离心法包括如下步骤:将所述根部根瘤清洗干净,在无菌条件下制备得到根瘤匀浆悬液;将得到的根瘤匀浆悬液加入已制备好的10000g不同浓度的蔗糖溶液(25%,30%,35%,40%,45%,50%等),在0~4℃条件下,离心3小时;再在不同浓度蔗糖溶液夹层中吸取菌液,在28℃条件下培养。

S2.将步骤S1得到的弗兰克氏菌的纯菌种通过紫外线-失重环境复合诱变方法进行处理,得到速生弗兰克氏菌种;

S3.将步骤S2得到的速生弗兰克氏菌种接种到灭过菌的发酵原料中,得到菌体培养料;所述菌体培养料由以下重量比的成分组成:豆粕40份、麦麸30份、氯化钾5份、磷酸二氢钾2份、磷酸氢二钾4.5份、硫酸镁3.2份,速生弗兰克氏菌种0.3

份,无菌活性炭15份,将菌体培养料放入发酵罐中,在31℃条件下,进行7天的发酵培养,形成菌丝;

S4.待发酵罐中的菌丝再进一步分化出孢子后,用无菌水进行洗脱,得到菌

液,在菌液中加入无菌活性炭用于吸附孢子,待孢子吸附完成后,将含有孢子的活性炭与液体分离,得到以活性炭为载体的菌体;

S5.将步骤S4得到的菌体通过真空冷冻干燥法进行冻干处理,获得菌粉。

根据所述的一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法制备的一种速生弗兰克氏菌菌粉,作为生物肥料添加剂使用。

实施案例五,弗兰克菌发酵液叶面施肥对几种蔬菜的增产实验:

在10㎡种植面积的不同蔬菜上,喷洒弗兰克菌发酵液14天后,弗兰克菌发酵液的浓度由低到高,可使韭菜增重28.6%~107.1%,菠菜增重20.0%~120.0%,黄瓜直径增幅20%~110.0%,番茄直径增幅27.9%~72.1%。此外,实验还测定了发酵液处理后的4种蔬菜叶片的叶绿素含量,其提高了0.13%~0.16%。说明叶面喷施弗兰克菌发酵液的液体肥,还能提高叶片的光合效率,有利于干物质的积累与增加。弗兰克菌所以能促进植物生长发育,是它能自我合成植物生长激素苯乙酸,苯乙酸具有促进植物生长发育的功能。

实施案例六,白茬地施入速生弗兰克氏菌菌粉后对土壤的增肥作用实验:在20㎡贫瘠的白茬地上,施入速生弗兰克氏菌菌粉,混合到20cm土层后,6个月内观察对土壤肥效的作用,按照施入弗兰克菌量由低到高,可使土壤有机质含量提高了0.22%~0.76%;水解氮提高了8.81%~14.28%;可溶性有机磷提高了1.21%~4.85%;速效钾提高了1.3%~2.61%。实验结果表明,当人工加入土壤中大量弗兰克菌,使土壤微生物菌群以弗兰克菌占优势后,它的功能不仅能自身大量固氮,而且还能提高了土壤有机质和水解氮的含量,还能使土壤中原来难溶的磷、钾元素部分转化为可溶性植物利用的营养。

同时,弗兰克菌的提取液,对金黄色葡萄球菌、白菜黑斑病、大肠杆菌和酵母菌都有一定的杀伤能力。其杀伤力的大小(即抑菌圈直径)随提取液浓度的增加而扩大,尤其是对白菜黑斑病、大肠杆菌杀伤力更强。弗兰克菌所以能杀伤有害菌类的原因是弗兰克菌可分泌抗生素,如卡西霉素、乙级噻唑霉素,这些抗生素既保护了以弗兰克菌为主的有益菌群的生存和功能,同时又杀灭了有害菌类,起到了生物农药的作用。

而且弗兰克菌提取液基本上不具毒性,属于无毒级,对人、畜植物和土壤是无毒的,保证了应用安全性。

人类活动,特别是工业生产,已经改变了自然生态环境,形成了环境压力。其中包括盐碱、重金属污染和过量化肥的使用,都减少和杀灭了土壤中有益的微生物种群,恶化了土壤理化特性,影响了植物生长和降低了生产能力。从而使土壤退化、板结和土地肥力降低。弗兰克菌不仅可以和宿主植物共生结瘤固氮,还能在土壤中通过固氮细胞器自生固氮,这些固定的初级产物氮素是NH4,它可以通过生物酶转化为氨基酸和蛋白质,供土壤中植物、微生物、动物利用,同时又能熟化土壤,增加有机质,形成水溶性的团粒结构,修复土壤板结,改善土壤理化性能和营养,配肥地力,使贫土变沃土,改良盐碱、消除重金属污染等作用。

进一步地,弗兰克菌能约束和隔离几种有毒的重金属,如镍、铜、铅、锌、镉及钼。水培实验表明,在铜、镍、锌、铅和镉的存在下,植物根、芽和总重都会降低。弗兰克菌受镍的影响较少,因为镍是固氮酶和氢化酶活性成分;弗兰克菌株已经被证明是具有抗铅性的,它可以和大量铅结合减轻了铅对植物的伤害。这些机制的累积相互作用,可能解释弗兰克菌的非凡作用。研究表明,弗兰克菌能耐受500摩尔/升的锰,10摩尔/升的铜,10摩尔/升的锌,10摩尔/升的铝,0.33-0.65毫摩尔/升的钴,对以上重金属有很高的抵抗力。土壤中铁元素的存在是有益的,它能最大程度地减少因金属胁迫而导致的对弗兰克菌的生长抑制。弗兰克菌对铜耐受力的原因是铜可与细胞表面和运输蛋白相结合,减轻了铜的危害性。弗兰克菌株还能够抵抗干旱和高盐度,承受相当大范围的盐浓度,能改善修复地力,并提高土壤质量。

故而使用弗兰克菌作为基肥、追肥、叶面施肥,既能固氮配肥,又能改造盐碱、重金属污染和过量化肥使用带来的土壤板结、有机质和有效成分降低、恢复有益微生物菌群,熟化土壤,形成水溶性团粒结构,增加、平衡营养,弗兰克菌是一种难得的潜在生物肥料。

本发明的主要功能:一种速生弗兰克氏菌菌粉的制备方法,其突破了弗兰克菌的“慢生”关,使它的繁殖系数由13小时一代,缩短到30-60分钟一代,得到繁殖速率提高了25倍的速生弗兰克氏菌种,该菌种具有繁殖速度快、抗逆性强,固氮酶活性高等特性,在适合的发酵环境和原料条件下5-7天即可长出菌丝,分化出孢子,接种效果好、生长速度快、易于大规模工业化生产;又通过细胞工程全自动连续发酵方法,在5-7天内即可以获得3-3.5%的速生弗兰克氏菌菌粉,该菌粉作为生物肥料添加剂使用,能固氮配肥,促进植物生长,增肥土壤,杀伤有害菌类,改造退化土壤盐碱土和重金属污染土壤。

综上所述,本领域的普通技术人员阅读本发明文件后,根据本发明的技术方案和技术构思无需创造性脑力劳动而作出其他各种相应的变换方案,均属于本发明所保护的范围。

再多了解一些
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