本发明涉及生物能源技术领域，更具体的说是涉及一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和mfc产电的方法。
背景技术：
能源短缺和环境污染是我国现今面临的日益严峻的问题，因而能源开发和环境废物治理及过程中能源可再生利用成为了我国现代社会进行可持续发展的一大挑战。科学家们不断寻找新的技术解决方案，其中微生物燃料电池(microbialfuelcell,mfc)就是其中之一用来产生可替代能源和环境废物治理新装置，并且其重要性现今日益显现。
mfc是利用产电微生物作为阳极催化剂将有机物中的化学能转化为电能的装置。微生物产电能力相差很大，产电微生物决定着mfc的功能及应用，希瓦氏菌属是目前发现的广泛用于mfc中产电的微生物之一，其代谢路径和胞外电子传递路径研究的比较明确。
希瓦氏菌的电子传递主要分为两方面，一是det(直接电子转移)调节，即电子通过细胞膜上细胞色素直接传递给电极。在det方面，主要是通过增加生物膜的形成来提高eet(胞外电子转移)效率。如，kaim.thormann等人通过改造mxd基因簇和第二信使c-di-gmp增加了三维生物膜的形成，从而增强mfc效率；除了自然生物膜的形成，xingxie等人用石墨烯-海绵-不锈钢等材质设计了阳极电极，也高效的增加了mfc效率……通过修饰阳极材料增加阳极菌体载量能有效的提高人工生物膜形成，然而这些阳极修饰材料制作时有些繁琐而且耗时。
二是met(间接电子转移)调节，即通过分泌可溶性电子载体flavins(黄素，包括黄素单核苷酸fmn和核黄素rf)传递电子。flavin浓度的高低在希瓦氏菌met传递中起着重要的作用，sharonb.velasquez-orta等人往mfc中添加直接添加微摩尔浓度的fmn和rf，电压和功率明显增加；yunyang等人在希瓦氏菌中导入了枯草芽孢杆菌的flavin合成路径，功率密度也有很大的提高；dimin等人过表达了西瓦菌产flavin的基因簇和外膜细胞色素，也明显增加了mfc效率。但是，这些方法效率仍然不高，而且希瓦氏菌内可利用的启动子比较少，并且没有形成系统化的研究成果。目前希瓦氏菌改造没有大肠杆菌技术那么成熟，很多改造方法还是比较局限，因此研究或发展一些能在希瓦氏菌里有效工作的生物方法或生物组件对希瓦氏菌后续改造和研究非常重要。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组质粒，使其在应用于希瓦氏菌的改造中能够提高其mfc电化学性能；
本发明的另外一个目的在于提供一种转化有上述重组质粒的重组希瓦氏菌，使其具备较高的mfc电化学性能；
本发明的另外一个目的在于提供一种借助所述重组希瓦氏菌的mfc产电方法，使其具备较高的mfc电化学性能。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种重组质粒，在基础载体质粒上连接含有至少一个启动子，以及来源于枯草芽孢杆菌的riba、ribd、ribe、ribh和ribc的五个flavins合成基因组成的基因表达元件；所述五个flavin合成基因均包含rbs基因，优选为rbs1基因(seqidno:1所示)，所述启动子独立选自ptac(seqidno:2所示)和ptet(seqidno:3所示)，riba、ribd、ribe、ribh和ribc的序列依次如seqidno:4-8所示。
本发明从选择适宜希瓦氏菌的启动子，然后与flavins路径连接并嵌入到载体质粒上，使转化了所述重组质粒的希瓦氏产生能够产生更多的flavins，从而提高mfc产电效率。
其中，所述基础质粒载体为pyyd质粒载体，其质粒图谱参见图1，质粒序列如seqidno:9所示。在本发明具体实施方式中，以pyyd质粒为基础载体，所述基因表达元件连接到xbai、spei酶切位点之间。
作为优选，所述基因表达元件中的至少一个启动子与riba、ribd、ribe、ribh和ribc的五个flavins合成基因直接连接。依据生物领域基因表达元件的一般原则，启动子位于各表达基因的5’端，根据启动子的个数，可以将启动子选择性的连接到riba、ribd、ribe、ribh、ribc的5’端，相对于一个启动子，多个启动子更能够保证基因表达元件的顺利表达。在本发明具体实施方式中，本发明提供了如下直接连接形式的基因表达元件：
启动子+riba+ribd+启动子+ribe+ribh+ribc
除上述连接形式之外，本发明还包括根据上述连接形式衍生出的多种表达原件连接形式，如调整启动子个数和/或启动子位置，以及各flavins合成基因的先后顺序等等。
为了促进flavins在希瓦氏体内的进出，更好的传递电子，提高电子传递速率，从而进一步提高mfc效率。本发明在前述方案基础上，所述基因表达元件还包括含有rbs序列的孔蛋白oprf基因，oprf孔蛋白是一个外膜蛋白，过多的表达会对细胞有一定的毒性。rbs是细胞翻译起始的有效控制因子之一，是细菌翻译的限速步骤，rbs影响翻译起始速率可以用热力学原理计算表征，本发明利用此优化rbs基因序列，选rbs2基因与oprf连接，oprf序列如seqidno:10所示，rbs2序列如seqidno:11所示。该基因可插入到任何flavins合成基因前或后，直接连接；例如，所述基因表达元件为启动子+riba+ribd+启动子+ribe+ribh+ribc+oprf顺次连接而成。
与其他常规的flavin基因表达元件相比，本发明所构建的重组质粒中的基因表达元件更适合于希瓦氏菌，并具备较高flavins浓度的有益效果，这为提高mfc产电效率提供了基础。基于此，本发明提供了所述重组质粒在构建重组希瓦氏菌中的应用。
依据应用，本发明还提供了一种重组的希瓦氏菌，其转化有本发明所述重组质粒。在本发明具体实施方式中，所述希瓦氏菌可以是希瓦氏菌mr-1或本发明提供的一种经过诱变获得的希瓦氏菌，其保藏编号为cgmccno.15432。
同时，本发明还根据提供的重组希瓦氏菌，提供了一种mfc产电的方法，包括：
步骤1、活化所述重组的希瓦氏菌；
步骤2、将所述重组的希瓦氏菌倒入阳极液中采用双室mfc产电。
试验证明，利用本发明所述重组的希瓦氏菌进行mfc产电，mfc功率密度可高达1.12w/m2，是目前已有报道中希瓦氏菌单菌改造mfc效果最高的。为了进一步提高mfc产电效率，本发明进一步往mfc中添加了水溶性go(氧化石墨烯)，go被希瓦氏菌还原成rgo(还原石墨烯),并与细菌和flavins自组装形成细菌-flavins-rgo三维自组装生物膜，rgo具有很好的生物兼容性和导电性，并且能够吸附小分子物质。这样形成了三维自组装细菌-flavins-rgo多层生物膜，flavins吸附在rgo上同时增强了π-π相互作用，加强了传递电子的能力。其功率密度可上升到2.63w/m2，是关于希瓦氏菌的mfc中效果最优的。此外，如果本发明双室mfc中的阳极采用体积电极(如碳刷，修饰的海绵，修饰的碳泡沫等等)而不是本发明具体实施例中的二维碳布电极，将会进一步大大增强mfc效率。
在具体的双室mfc产电中，本发明可使用本领域常规的阳极液和阴极液进行产电，在本发明具体实施方式中，可使用如下阳极液和阴极液：
所述阳极液由m9缓冲液、18mm乳酸钠、5％lb、卡那霉素和相应诱导剂(用于诱导启动子表达)组成。
所述阴极液由50mm铁氰化钾、50mm磷酸氢二钾、50mm磷酸二氢钾和余量水组成。
作为优选，所述步骤1为：
将希瓦氏菌在lb培养基(含卡那霉素)里30℃，200rpm，过夜培养；过夜培养液按1:100比例转接入新的lb培养基里30℃，200rpm，培养12小时；
作为优选，所述重组的希瓦氏菌在阳极液中的od600值为0.7。
作为优选，所述双室mfc各参数如下：
阳极碳布电极大小为1cm×1cm，阴极碳布电极大小为2cm×1.5cm，双室之间用分别经过3％过氧化氢、蒸馏水和0.5m硫酸80℃水浴1小时的质子交换膜隔开，mfc放在30℃培养箱中，阴阳两极连接2kω的外电阻，阳极液通氮气除氧。
由以上技术方案可知，本发明选择适宜希瓦氏菌的启动子与flavins路径连接，使希瓦氏产生更多flavins，提高mfc效率，同时结合突变菌株和孔蛋白oprf基因，可进一步促进生物膜形成和促进flavins在希瓦氏体内的进出，提高电子传递速率，更好的传递电子。更进一步，本发明使用了具有生物兼容性的go，能与希瓦氏菌自组装成三维多层生物膜，进一步大大提高了生物膜的厚度和阳极生物载量，操作简便快捷，而且有效的提高了mfc效率。
生物保藏说明
pho，分类命名：shewanellaoneidensis，于2018年3月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.15432。
附图说明
图1所示为pyyd质粒图谱；
图2所示为本发明所述重组质粒(不含oprf基因)构建示意图；图中箭头表示启动子；
图3所示为本发明所述重组质粒(含oprf基因)构建示意图；图中箭头表示启动子，以ptet为例说明，各flavins合成基因带rbs1，oprf带rbs2；
图4所示为不同启动子与gfp连接示意图；
图5所示为不同启动子重组质粒不同诱导剂浓度荧光值柱形图；
图6所示为不同启动子重组质粒最优诱导剂浓度荧光值柱形图；其中，每个质粒的左侧柱形表示control对照组，右侧柱形表示expression试验组；
图7所示为不同启动子的重组质粒构建的重组希瓦氏菌在各自不同浓度诱导剂下的flavins浓度；其中，a、b、c依次表示cb5(pbad启动子)、3c5(ptac启动子)和ct5(ptet启动子)；每组柱形从左至右依次表示为fmn浓度、rf浓度和flavins浓度；
图8所示为不同启动子的重组质粒构建的重组希瓦氏菌在各自最优浓度诱导剂下的flavins浓度对比；其中，每组柱形从左至右依次表示为fmn浓度、rf浓度和flavins浓度；
图9所示为本发明重组希瓦氏菌的mfc电压图；
图10所示为本发明重组希瓦氏菌的循环伏安图(cv,1mv/s)；横坐标是电压，纵坐标为电流密度；
图11所示为本发明重组希瓦氏菌的极化曲线；横坐标为电流密度，纵坐标为电压；
图12所示为本发明重组希瓦氏菌的极化曲线；横坐标是电流密度，纵坐标为功率密度；
图13所示为本发明重组希瓦氏菌+go的电化学表征图；其中，a为循环伏安图(cv,1mv/s)；横坐标是电压，纵坐标为电流密度；b为极化曲线；横坐标为电流密度，纵坐标为电压；c为极化曲线；横坐标是电流密度，纵坐标为功率密度；
图14所示为本发明重组希瓦氏菌+go的mfc电压图；
图15所示为本发明所述重组希瓦氏菌的sem图；其中，a为保藏编号为cgmccno.15432的希瓦氏菌的sem图；b为ct5-31o-cp的sem图，c是ct5-31o-cp和go结合的正面sem图；d为ct5-31o-cp和go结合的侧面sem图；
图16所示为经过本发明所述重组希瓦氏菌mfc发电后的二维碳布阳极光学特征结果；其中，a是拉曼光谱，b是傅里叶红外光谱，c是c1sxps，d是n1sxps；
图17所示为不同rbs连接oprf的重组希瓦氏菌的细胞生长试验；其中，每组柱形从左到右依次表示tet/mr-1、tet-30o/mr-1、tet-31o/mr-1、tet-32o/mr-1、tet-34o/mr-1重组希瓦氏菌；
图18所示为不同rbs连接oprf的重组希瓦氏菌的mfc产电实验；其中，曲线从上至下依次表示tet-31o/mr-1、tet/mr-1、tet-32o/mr-1、tet-30o/mr-1、tet-34o/mr-1重组希瓦氏菌。
具体实施方式
本发明公开了一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和mfc产电的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述质粒、菌株、方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的菌株、方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，所述五个flavins合成基因均包含rbs基因，所述rbs基因可直接与各flavins合成基因5＇端连接形成；含有rbs基因的孔蛋白oprf基因中，rbs基因也可直接与oprf基因5＇端连接形成。
在本发明中，为了检测希瓦氏菌的mfc产电效率，本发明采用循环伏安法(cv)和线性扫描伏安法(lsv)检测，其中循环伏安法(cv)以氯化银为参比电极，用多通道电化学工作站chi1000c扫描，扫速为1mv/s。线性扫描伏安法(lsv)从开路电压扫到-0.3v，扫速为0.1mv/s，仪器为多通道电化学工作站chi1000c。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：本发明所述重组质粒的构建
合成启动子ptac或ptet基因序列，合成并优化flavins基因序列riba、ribd、ribe、ribh、ribc(基因来源于枯草芽孢杆菌中，带rbs1)；
利用pyyd的酶切位点(如ecori、xbai、spei、sdai，本实施例选择xbai、spei两个酶切位点)和生物砖方法分别将ptac或ptet启动子和各flavins合成基因连接到载体pyyd上，获得所述重组质粒(不含oprf基因)，分别命名为3c5(ptac-ribadehc-pyyd)和ct5(ptet-ribadehc-pyyd)，示意图见图2(图中箭头表示启动子)。
合成孔蛋白基因序列oprf(基因来源于绿脓杆菌，带rbs2)，利用pyyd的酶切位点(如ecori、xbai、spei、sdai，本实施例选择xbai、spei两个酶切位点)和生物砖方法分别将ptac或ptet启动子、各flavins合成基因和oprf连接到载体pyyd上，获得所述重组质粒(含oprf基因)，分别命名为ct5-31o-pyyd和3c5-31o-pyyd，示意图见图3(图中箭头表示启动子，以ptet为例说明，各flavins合成基因带rbs1，oprf带rbs2)。
实施例2：不同启动子与希瓦氏菌的适配对比
合成启动子基因序列(pbad、ptac、ptet、lacuv5、t7、parca)，利用生物砖的四个酶切位点(ecori、xbai、spei、sdai)分别将启动子和gfp基因(带rbs1)连接到载体pyyd上，分别得到质粒pbad-gfp-pyyd、ptac-gfp-pyyd、ptet-gfp-pyyd、lacuv5-gfp-pyyd、t7-gfp-pyyd、parca-gfp-pyyd，示意图见图4。
pbad序列如seqidno:12所示，lacuv5序列seqidno:13所示，t7序列seqidno:14所示，parca序列seqidno:13所示。
连接后的各质粒导入大肠杆菌w3064感受态中，然后与野生希瓦氏菌mr-1结合转移，将构建好的质粒转让希瓦氏菌中(转化方法具体可参照yangy,dingy,huy,etal.enhancingbidirectionalelectrontransferofshewanellaoneidensisbyasyntheticflavinpathway[j].acssyntheticbiology,2015,4(7):815-823.)，储存在-80℃中，30℃200rpm过夜摇菌，然后分别转接入不同诱导浓度的诱导剂的卡那霉素lb中，12小时左右测荧光值和od600，不同启动子不同浓度诱导剂荧光值比较如图5所示。根据图5对比各启动子最优诱导剂浓度下的荧光值，结果见图6。
由图6可以看出，看出启动子ptet荧光值最高，启动子ptac和pbad强度相当，常启动子parca最低，说明启动子ptet和ptac更适宜希瓦氏菌，其他常用启动子并不适合希瓦氏菌。
实施例3：本发明所述重组的希瓦氏菌的构建
将实施例1构建的3c5(ptac-ribadehc-pyyd)、ct5(ptet-ribadehc-pyyd)、ct5-31o-pyyd和3c5-31o-pyyd导入w3064感受态中，然后与希瓦氏菌mr-1或保藏编号为cgmccno.15432的希瓦氏菌结合转移，将构建好的质粒转让希瓦氏菌中，获得本发明所述重组的希瓦氏菌。
实施例4：不同重组质粒构建的重组希瓦氏菌产flavins对比
选择ptet、ptac和pbad三种启动子，按照实施例1的方法构建重组质粒(不含oprf基因)，按照图2所示各使用2个启动子。
连接后的质粒导入w3064感受态中，然后与保藏编号为cgmccno.15432的菌株结合转移，将构建好的质粒转让希瓦氏菌中，分别命名为3c5(ptac启动子)、ct5(ptet启动子)和cb5(pbad启动子)，储存在-80℃中，30℃200rpm过夜摇菌，然后分别转接入含对应的诱导剂和卡那霉素抗性的lb中，30℃200rpm12小时后取样，hplc测flavins量，测od600，如图7所示。根据图7，将各菌株在最优诱导剂浓度下的flavins浓度综合比较，结果见图8。
从图8中可以看出ct5产的flavins浓度最高，flavins浓度达39.7μm，是3c5的1.3倍、cb5的3.2倍，可见根据本发明提供的重组质粒构建的重组希瓦氏菌的产flavin能力是最高的，从而能够在mfc发电中提高其效率。
实施例5：本发明重组希瓦氏菌电化学特征分析对比
选择ptet、ptac两种启动子，按照实施例1的方法构建重组质粒(不含oprf基因)，按照图2所示各使用2个启动子。连接后的质粒导入w3064感受态中，然后与保藏编号为cgmccno.15432的菌株结合转移，将构建好的质粒转让希瓦氏菌中，分别命名为3c5-cp(ptac启动子)、ct5-cp(ptet启动子)；
选择ptet启动子，按照实施例1的方法构建重组质粒(含oprf基因)，按照图3所示使用2个启动子。连接后的质粒导入w3064感受态中，然后与保藏编号为cgmccno.15432的菌株结合转移，将构建好的质粒转让希瓦氏菌中，命名为ct5-31o-pyyd。
同时增加希瓦氏菌mr-1(mr-1)和保藏编号为cgmccno.15432的希瓦氏菌(cp)作为对比。
上述各菌在含卡那霉素lb培养基中30℃200rpm过夜摇菌，然后按1:100转接比例转接入含卡那霉素和对应诱导剂的lb中，30℃200rpm，摇12小时左右，测od，计算体积在mfc中加入菌液(od＝0.7)，其电压如图9所示，从图9中可以看出，ct5-31o-cp最优。
生物电化学分析可以进一步研究mfc中胞外电子传递效率。如图10所示，以1mv/s为扫速的循环伏安图(cv)，从图中可以发现在-0.4v左右有明显的flavins的氧化还原峰(vs氯化银电极)，这表明了电子载体flavins调节胞外电子转移是主要的电化学产物。图11和图12是以为扫速为0.1mv/s的线性扫描伏安图(lsv)即极化曲线，从图上可以看出，ct5-31o-cp菌mfc的电化学性能最好，其最大电流密度为2.99a/m2，最大功率密度为1.12w/m2，是目前世界上mfc中改造希瓦氏效果最好的。
实施例6：本发明重组希瓦氏菌+go的电化学特征和光学表征
希瓦氏菌悬浮液(mfc中最终od600＝0.7)和氧化石墨烯溶液(mfc中终浓度为0.2mg/ml)同时加入mfc阳极中，充入氮气，放在磁力搅拌器上，50rpm转动，所有mfc都放在30℃恒温培养箱中。
以实施例5中的ct5-cp为基础,区别在于不含flavins基因序列riba、ribd、ribe、ribh、ribc(本实施例记为ct-cp)和ct5-31o-cp为试验对象。
1、电化学表征
图13中a是以1mv/s为扫速的循环伏安图(cv)，从图中可以看出加入go后，ct-cp+go的det(-0.3v到-0.1vvs氯化银电极)电流密度明显比对照(ct-cp，不含go)高很多，说明加入go后，明显增强了det效率。ct5-31o-cp+go又明显高于ct-cp+go，且在-0.4v有明显的flavins峰，这说明改造后的细菌能更好的在met和det两方面提高eet效率。
图13中b和c是以为扫速为0.1mv/s的线性扫描伏安图(lsv)即极化曲线，从图中可以看出，ct5-31o-cp+go最高的功率密度为2.63w/m2(对照ct-cp功率密度只有0.3w/m2)，表明了本发明希瓦氏菌跟材料结合后，mfc效果获得最佳效果。
图14为本发明重组希瓦氏菌的多周期mfc电压图，从该图中同样可以看出本发明希瓦氏菌跟材料结合后，mfc效果获得最佳效果。
2、光学表征
用扫描电子显微镜(sem)来分析阳极生物膜的形态，从mfc中取出2维阳极碳布，先用2.5％的戊二醛固定液浸泡1小时，然后不同浓度(25％，50％，75％，95％，100％)的乙醇溶液浸泡,真空冷冻干燥，喷金，检测，加速电压3kv。
拉曼光谱，傅里叶红外变换和xps检测用来检测阳极的光学形态表征。
如图15所示，改造后的希瓦氏菌ct5-31o-cp(图15-b)吸附大量的细菌，改造前(图15-a)只能吸附很少，加入go后，形成了更厚更致密的生物膜(图15-c)，图15-d是ct5-31o-cp+go后阳极侧面图，从图中很明显可以看出形成了非常厚的多层生物膜，阳极生物载量比不加go之前明显增加了很多。
拉曼光谱、傅里叶红外变换和xps进一步采用来验证细菌-flavins-rgo杂化生物膜的形成(图16)。图16-a是拉曼光谱，图中可以看出rgo/flavins图谱的d/g升高，表明了go被还原成rgo。图16-b是傅里叶红外变换光谱，还原后的rgo/flavins图谱c＝o和o-h峰明显减少，c-n，-oh和c-o峰出现，跟flavin(包含rf和fmn)图谱相对应，说明go被还原成rgo，且flavins吸附在go上。图16-c是c1sxps图谱，从图中可以明显看出还原后c-o能明显减少。图16-d是n1s的xps图，还原后有明显的n1峰，且flavins也有明显的n峰，进一步证明了flavins吸附在rgo上。
实施例7：连接不同rbs序列的oprf对mfc的影响
针对本领域rbs序列进行优化，获得如下4个序列：
bba_b0030:attaaagaggagaaa；
bba_b0031:tcacacaggaaacc；
bba_b0032:tcacacaggaaag；
bba_b0034:aaagaggagaaa；
1、不同rbs连接oprf的细胞生长试验
将启动子ptet和上述各优化后的rbs序列以及oprf序列直接拼接，然后连接到质粒pyyd，分别获得ptet-30rbs-oprf-pyyd、ptet-31rbs-oprf-pyyd、ptet-32rbs-oprf-pyyd、ptet-34rbs-oprf-pyyd重组质粒，同时以仅含有启动子ptet的pyyd的质粒为对照，命名为ptet-pyyd；
将各质粒转化到希瓦氏菌mr-1中，依次获得。tet/mr-1、tet-30o/mr-1、tet-31o/mr-1、tet-32o/mr-1、tet-34o/mr-1重组希瓦氏菌，然后进行细胞培养试验，结果见图17。由图17可见，只有采用bba_b0031序列的希瓦氏菌生长状态最佳，即本发明中的rbs2序列。
2、不同rbs连接oprf的mfc产电实验
采用1中的tet/mr-1、tet-30o/mr-1、tet-31o/mr-1、tet-32o/mr-1、tet-34o/mr-1重组希瓦氏菌，按照前述mfc双室产电方法进行试验，结果见图18的时间-电压图，可见从mfc电化学性能上也是采用bba_b0031序列的希瓦氏菌生长状态最佳，即本发明中的rbs2序列。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>天津大学
海南大学
<120>一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和mfc产电的方法
<130>mp1727136
<160>15
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>12
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
aaagaggagaaa12
<210>2
<211>1530
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ccgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagaga60
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ctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtgga1440
attgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagccagtccgtttaggtgttttcacga1500
gcacttcaccaacaaggaccatagcatatg1530
<210>3
<211>698
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