一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和MFC产电的方法与流程

文档序号:15457461发布日期:2018-09-15 01:30

本发明涉及生物能源技术领域,更具体的说是涉及一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和MFC产电的方法。



背景技术:

能源短缺和环境污染是我国现今面临的日益严峻的问题,因而能源开发和环境废物治理及过程中能源可再生利用成为了我国现代社会进行可持续发展的一大挑战。科学家们不断寻找新的技术解决方案,其中微生物燃料电池(Microbial Fuel Cell,MFC)就是其中之一用来产生可替代能源和环境废物治理新装置,并且其重要性现今日益显现。

MFC是利用产电微生物作为阳极催化剂将有机物中的化学能转化为电能的装置。微生物产电能力相差很大,产电微生物决定着MFC的功能及应用,希瓦氏菌属是目前发现的广泛用于MFC中产电的微生物之一,其代谢路径和胞外电子传递路径研究的比较明确。

希瓦氏菌的电子传递主要分为两方面,一是DET(直接电子转移)调节,即电子通过细胞膜上细胞色素直接传递给电极。在DET方面,主要是通过增加生物膜的形成来提高EET(胞外电子转移)效率。如,Kai M.Thormann等人通过改造mxd基因簇和第二信使c-di-GMP增加了三维生物膜的形成,从而增强MFC效率;除了自然生物膜的形成,Xing Xie等人用石墨烯-海绵-不锈钢等材质设计了阳极电极,也高效的增加了MFC效率……通过修饰阳极材料增加阳极菌体载量能有效的提高人工生物膜形成,然而这些阳极修饰材料制作时有些繁琐而且耗时。

二是MET(间接电子转移)调节,即通过分泌可溶性电子载体flavins(黄素,包括黄素单核苷酸FMN和核黄素RF)传递电子。Flavin浓度的高低在希瓦氏菌MET传递中起着重要的作用,Sharon B.Velasquez-Orta等人往MFC中添加直接添加微摩尔浓度的FMN和RF,电压和功率明显增加;Yun Yang等人在希瓦氏菌中导入了枯草芽孢杆菌的flavin合成路径,功率密度也有很大的提高;Di Min等人过表达了西瓦菌产flavin的基因簇和外膜细胞色素,也明显增加了MFC效率。但是,这些方法效率仍然不高,而且希瓦氏菌内可利用的启动子比较少,并且没有形成系统化的研究成果。目前希瓦氏菌改造没有大肠杆菌技术那么成熟,很多改造方法还是比较局限,因此研究或发展一些能在希瓦氏菌里有效工作的生物方法或生物组件对希瓦氏菌后续改造和研究非常重要。



技术实现要素:

有鉴于此,本发明的目的在于提供一种重组质粒,使其在应用于希瓦氏菌的改造中能够提高其MFC电化学性能;

本发明的另外一个目的在于提供一种转化有上述重组质粒的重组希瓦氏菌,使其具备较高的MFC电化学性能;

本发明的另外一个目的在于提供一种借助所述重组希瓦氏菌的MFC产电方法,使其具备较高的MFC电化学性能。

为实现上述发明目的,本发明提供如下技术方案:

一种重组质粒,在基础载体质粒上连接含有至少一个启动子,以及来源于枯草芽孢杆菌的ribA、ribD、ribE、ribH和ribC的五个flavins合成基因组成的基因表达元件;所述五个flavin合成基因均包含RBS基因,优选为RBS1基因(SEQ ID NO:1所示),所述启动子独立选自Ptac(SEQ ID NO:2所示)和Ptet(SEQ ID NO:3所示),ribA、ribD、ribE、ribH和ribC的序列依次如SEQ ID NO:4-8所示。

本发明从选择适宜希瓦氏菌的启动子,然后与flavins路径连接并嵌入到载体质粒上,使转化了所述重组质粒的希瓦氏产生能够产生更多的flavins,从而提高MFC产电效率。

其中,所述基础质粒载体为PYYD质粒载体,其质粒图谱参见图1,质粒序列如SEQ ID NO:9所示。在本发明具体实施方式中,以PYYD质粒为基础载体,所述基因表达元件连接到XbaI、SpeI酶切位点之间。

作为优选,所述基因表达元件中的至少一个启动子与ribA、ribD、ribE、ribH和ribC的五个flavins合成基因直接连接。依据生物领域基因表达元件的一般原则,启动子位于各表达基因的5’端,根据启动子的个数,可以将启动子选择性的连接到ribA、ribD、ribE、ribH、ribC的5’端,相对于一个启动子,多个启动子更能够保证基因表达元件的顺利表达。在本发明具体实施方式中,本发明提供了如下直接连接形式的基因表达元件:

启动子+ribA+ribD+启动子+ribE+ribH+ribC

除上述连接形式之外,本发明还包括根据上述连接形式衍生出的多种表达原件连接形式,如调整启动子个数和/或启动子位置,以及各flavins合成基因的先后顺序等等。

为了促进flavins在希瓦氏体内的进出,更好的传递电子,提高电子传递速率,从而进一步提高MFC效率。本发明在前述方案基础上,所述基因表达元件还包括含有RBS序列的孔蛋白OprF基因,OprF孔蛋白是一个外膜蛋白,过多的表达会对细胞有一定的毒性。RBS是细胞翻译起始的有效控制因子之一,是细菌翻译的限速步骤,RBS影响翻译起始速率可以用热力学原理计算表征,本发明利用此优化RBS基因序列,选RBS2基因与OprF连接,OprF序列如SEQ ID NO:10所示,RBS2序列如SEQ ID NO:11所示。该基因可插入到任何flavins合成基因前或后,直接连接;例如,所述基因表达元件为启动子+ribA+ribD+启动子+ribE+ribH+ribC+OprF顺次连接而成。

与其他常规的flavin基因表达元件相比,本发明所构建的重组质粒中的基因表达元件更适合于希瓦氏菌,并具备较高flavins浓度的有益效果,这为提高MFC产电效率提供了基础。基于此,本发明提供了所述重组质粒在构建重组希瓦氏菌中的应用。

依据应用,本发明还提供了一种重组的希瓦氏菌,其转化有本发明所述重组质粒。在本发明具体实施方式中,所述希瓦氏菌可以是希瓦氏菌MR-1或本发明提供的一种经过诱变获得的希瓦氏菌,其保藏编号为CGMCC No.15432。

同时,本发明还根据提供的重组希瓦氏菌,提供了一种MFC产电的方法,包括:

步骤1、活化所述重组的希瓦氏菌;

步骤2、将所述重组的希瓦氏菌倒入阳极液中采用双室MFC产电。

试验证明,利用本发明所述重组的希瓦氏菌进行MFC产电,MFC功率密度可高达1.12W/m2,是目前已有报道中希瓦氏菌单菌改造MFC效果最高的。为了进一步提高MFC产电效率,本发明进一步往MFC中添加了水溶性GO(氧化石墨烯),GO被希瓦氏菌还原成rGO(还原石墨烯),并与细菌和flavins自组装形成细菌-flavins-rGO三维自组装生物膜,rGO具有很好的生物兼容性和导电性,并且能够吸附小分子物质。这样形成了三维自组装细菌-flavins-rGO多层生物膜,flavins吸附在rGO上同时增强了π-π相互作用,加强了传递电子的能力。其功率密度可上升到2.63W/m2,是关于希瓦氏菌的MFC中效果最优的。此外,如果本发明双室MFC中的阳极采用体积电极(如碳刷,修饰的海绵,修饰的碳泡沫等等)而不是本发明具体实施例中的二维碳布电极,将会进一步大大增强MFC效率。

在具体的双室MFC产电中,本发明可使用本领域常规的阳极液和阴极液进行产电,在本发明具体实施方式中,可使用如下阳极液和阴极液:

所述阳极液由M9缓冲液、18mM乳酸钠、5%LB、卡那霉素和相应诱导剂(用于诱导启动子表达)组成。

所述阴极液由50mM铁氰化钾、50mM磷酸氢二钾、50mM磷酸二氢钾和余量水组成。

作为优选,所述步骤1为:

将希瓦氏菌在LB培养基(含卡那霉素)里30℃,200rpm,过夜培养;过夜培养液按1:100比例转接入新的LB培养基里30℃,200rpm,培养12小时;

作为优选,所述重组的希瓦氏菌在阳极液中的OD600值为0.7。

作为优选,所述双室MFC各参数如下:

阳极碳布电极大小为1cm×1cm,阴极碳布电极大小为2cm×1.5cm,双室之间用分别经过3%过氧化氢、蒸馏水和0.5M硫酸80℃水浴1小时的质子交换膜隔开,MFC放在30℃培养箱中,阴阳两极连接2KΩ的外电阻,阳极液通氮气除氧。

由以上技术方案可知,本发明选择适宜希瓦氏菌的启动子与flavins路径连接,使希瓦氏产生更多flavins,提高MFC效率,同时结合突变菌株和孔蛋白oprF基因,可进一步促进生物膜形成和促进flavins在希瓦氏体内的进出,提高电子传递速率,更好的传递电子。更进一步,本发明使用了具有生物兼容性的GO,能与希瓦氏菌自组装成三维多层生物膜,进一步大大提高了生物膜的厚度和阳极生物载量,操作简便快捷,而且有效的提高了MFC效率。

生物保藏说明

PHO,分类命名:Shewanella oneidensis,于2018年3月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.15432。

附图说明

图1所示为PYYD质粒图谱;

图2所示为本发明所述重组质粒(不含OprF基因)构建示意图;图中箭头表示启动子;

图3所示为本发明所述重组质粒(含OprF基因)构建示意图;图中箭头表示启动子,以ptet为例说明,各flavins合成基因带RBS1,OprF带RBS2;

图4所示为不同启动子与GFP连接示意图;

图5所示为不同启动子重组质粒不同诱导剂浓度荧光值柱形图;

图6所示为不同启动子重组质粒最优诱导剂浓度荧光值柱形图;其中,每个质粒的左侧柱形表示control对照组,右侧柱形表示expression试验组;

图7所示为不同启动子的重组质粒构建的重组希瓦氏菌在各自不同浓度诱导剂下的flavins浓度;其中,a、b、c依次表示CB5(Pbad启动子)、3C5(Ptac启动子)和CT5(Ptet启动子);每组柱形从左至右依次表示为FMN浓度、RF浓度和flavins浓度;

图8所示为不同启动子的重组质粒构建的重组希瓦氏菌在各自最优浓度诱导剂下的flavins浓度对比;其中,每组柱形从左至右依次表示为FMN浓度、RF浓度和flavins浓度;

图9所示为本发明重组希瓦氏菌的MFC电压图;

图10所示为本发明重组希瓦氏菌的循环伏安图(CV,1mV/s);横坐标是电压,纵坐标为电流密度;

图11所示为本发明重组希瓦氏菌的极化曲线;横坐标为电流密度,纵坐标为电压;

图12所示为本发明重组希瓦氏菌的极化曲线;横坐标是电流密度,纵坐标为功率密度;

图13所示为本发明重组希瓦氏菌+GO的电化学表征图;其中,a为循环伏安图(CV,1mV/s);横坐标是电压,纵坐标为电流密度;b为极化曲线;横坐标为电流密度,纵坐标为电压;c为极化曲线;横坐标是电流密度,纵坐标为功率密度;

图14所示为本发明重组希瓦氏菌+GO的MFC电压图;

图15所示为本发明所述重组希瓦氏菌的SEM图;其中,a为保藏编号为CGMCC No.15432的希瓦氏菌的SEM图;b为CT5-31O-CP的SEM图,c是CT5-31O-CP和GO结合的正面SEM图;d为CT5-31O-CP和GO结合的侧面SEM图;

图16所示为经过本发明所述重组希瓦氏菌MFC发电后的二维碳布阳极光学特征结果;其中,a是拉曼光谱,b是傅里叶红外光谱,c是C1s XPS,d是N1s XPS;

图17所示为不同RBS连接OprF的重组希瓦氏菌的细胞生长试验;其中,每组柱形从左到右依次表示Tet/MR-1、Tet-30O/MR-1、Tet-31O/MR-1、Tet-32O/MR-1、Tet-34O/MR-1重组希瓦氏菌;

图18所示为不同RBS连接OprF的重组希瓦氏菌的MFC产电实验;其中,曲线从上至下依次表示Tet-31O/MR-1、Tet/MR-1、Tet-32O/MR-1、Tet-30O/MR-1、Tet-34O/MR-1重组希瓦氏菌。

具体实施方式

本发明公开了一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和MFC产电的方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明所述质粒、菌株、方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的菌株、方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。

在本发明中,所述五个flavins合成基因均包含RBS基因,所述RBS基因可直接与各flavins合成基因5'端连接形成;含有RBS基因的孔蛋白OprF基因中,RBS基因也可直接与OprF基因5'端连接形成。

在本发明中,为了检测希瓦氏菌的MFC产电效率,本发明采用循环伏安法(CV)和线性扫描伏安法(LSV)检测,其中循环伏安法(CV)以氯化银为参比电极,用多通道电化学工作站CHI1000C扫描,扫速为1mV/s。线性扫描伏安法(LSV)从开路电压扫到-0.3V,扫速为0.1mV/s,仪器为多通道电化学工作站CHI1000C。

下面结合实施例,进一步阐述本发明。

实施例1:本发明所述重组质粒的构建

合成启动子ptac或ptet基因序列,合成并优化flavins基因序列ribA、ribD、ribE、ribH、ribC(基因来源于枯草芽孢杆菌中,带RBS1);

利用PYYD的酶切位点(如EcoRI、XbaI、SpeI、SdaI,本实施例选择XbaI、SpeI两个酶切位点)和生物砖方法分别将ptac或ptet启动子和各flavins合成基因连接到载体PYYD上,获得所述重组质粒(不含OprF基因),分别命名为3C5(Ptac-ribADEHC-PYYD)和CT5(Ptet-ribADEHC-PYYD),示意图见图2(图中箭头表示启动子)。

合成孔蛋白基因序列OprF(基因来源于绿脓杆菌,带RBS2),利用PYYD的酶切位点(如EcoRI、XbaI、SpeI、SdaI,本实施例选择XbaI、SpeI两个酶切位点)和生物砖方法分别将ptac或ptet启动子、各flavins合成基因和OprF连接到载体PYYD上,获得所述重组质粒(含OprF基因),分别命名为CT5-31O-PYYD和3C5-31O-PYYD,示意图见图3(图中箭头表示启动子,以ptet为例说明,各flavins合成基因带RBS1,OprF带RBS2)。

实施例2:不同启动子与希瓦氏菌的适配对比

合成启动子基因序列(pbad、ptac、ptet、LacUV5、T7、parcA),利用生物砖的四个酶切位点(EcoRI、XbaI、SpeI、SdaI)分别将启动子和GFP基因(带RBS1)连接到载体PYYD上,分别得到质粒Pbad-GFP-PYYD、Ptac-GFP-PYYD、Ptet-GFP-PYYD、LacUV5-GFP-PYYD、T7-GFP-PYYD、ParcA-GFP-PYYD,示意图见图4。

Pbad序列如SEQ ID NO:12所示,LacUV5序列SEQ ID NO:13所示,T7序列SEQ ID NO:14所示,parcA序列SEQ ID NO:13所示。

连接后的各质粒导入大肠杆菌W3064感受态中,然后与野生希瓦氏菌MR-1结合转移,将构建好的质粒转让希瓦氏菌中(转化方法具体可参照Yang Y,Ding Y,Hu Y,et al.Enhancing bidirectional electron transfer of Shewanella oneidensis by a synthetic flavin pathway[J].ACS synthetic biology,2015,4(7):815-823.),储存在-80℃中,30℃200rpm过夜摇菌,然后分别转接入不同诱导浓度的诱导剂的卡那霉素LB中,12小时左右测荧光值和OD600,不同启动子不同浓度诱导剂荧光值比较如图5所示。根据图5对比各启动子最优诱导剂浓度下的荧光值,结果见图6。

由图6可以看出,看出启动子Ptet荧光值最高,启动子Ptac和Pbad强度相当,常启动子ParcA最低,说明启动子Ptet和Ptac更适宜希瓦氏菌,其他常用启动子并不适合希瓦氏菌。

实施例3:本发明所述重组的希瓦氏菌的构建

将实施例1构建的3C5(Ptac-ribADEHC-PYYD)、CT5(Ptet-ribADEHC-PYYD)、CT5-31O-PYYD和3C5-31O-PYYD导入W3064感受态中,然后与希瓦氏菌MR-1或保藏编号为CGMCC No.15432的希瓦氏菌结合转移,将构建好的质粒转让希瓦氏菌中,获得本发明所述重组的希瓦氏菌。

实施例4:不同重组质粒构建的重组希瓦氏菌产flavins对比

选择Ptet、Ptac和Pbad三种启动子,按照实施例1的方法构建重组质粒(不含OprF基因),按照图2所示各使用2个启动子。

连接后的质粒导入W3064感受态中,然后与保藏编号为CGMCCNo.15432的菌株结合转移,将构建好的质粒转让希瓦氏菌中,分别命名为3C5(Ptac启动子)、CT5(Ptet启动子)和CB5(Pbad启动子),储存在-80℃中,30℃200rpm过夜摇菌,然后分别转接入含对应的诱导剂和卡那霉素抗性的LB中,30℃200rpm12小时后取样,HPLC测flavins量,测OD600,如图7所示。根据图7,将各菌株在最优诱导剂浓度下的flavins浓度综合比较,结果见图8。

从图8中可以看出CT5产的flavins浓度最高,flavins浓度达39.7μM,是3C5的1.3倍、CB5的3.2倍,可见根据本发明提供的重组质粒构建的重组希瓦氏菌的产flavin能力是最高的,从而能够在MFC发电中提高其效率。

实施例5:本发明重组希瓦氏菌电化学特征分析对比

选择Ptet、Ptac两种启动子,按照实施例1的方法构建重组质粒(不含OprF基因),按照图2所示各使用2个启动子。连接后的质粒导入W3064感受态中,然后与保藏编号为CGMCC No.15432的菌株结合转移,将构建好的质粒转让希瓦氏菌中,分别命名为3C5-CP(Ptac启动子)、CT5-CP(Ptet启动子);

选择Ptet启动子,按照实施例1的方法构建重组质粒(含OprF基因),按照图3所示使用2个启动子。连接后的质粒导入W3064感受态中,然后与保藏编号为CGMCC No.15432的菌株结合转移,将构建好的质粒转让希瓦氏菌中,命名为CT5-31O-PYYD。

同时增加希瓦氏菌MR-1(MR-1)和保藏编号为CGMCC No.15432的希瓦氏菌(CP)作为对比。

上述各菌在含卡那霉素LB培养基中30℃200rpm过夜摇菌,然后按1:100转接比例转接入含卡那霉素和对应诱导剂的LB中,30℃200rpm,摇12小时左右,测OD,计算体积在MFC中加入菌液(OD=0.7),其电压如图9所示,从图9中可以看出,CT5-31O-CP最优。

生物电化学分析可以进一步研究MFC中胞外电子传递效率。如图10所示,以1mV/s为扫速的循环伏安图(CV),从图中可以发现在-0.4V左右有明显的flavins的氧化还原峰(vs氯化银电极),这表明了电子载体flavins调节胞外电子转移是主要的电化学产物。图11和图12是以为扫速为0.1mV/s的线性扫描伏安图(LSV)即极化曲线,从图上可以看出,CT5-31O-CP菌MFC的电化学性能最好,其最大电流密度为2.99A/m2,最大功率密度为1.12W/m2,是目前世界上MFC中改造希瓦氏效果最好的。

实施例6:本发明重组希瓦氏菌+GO的电化学特征和光学表征

希瓦氏菌悬浮液(MFC中最终OD600=0.7)和氧化石墨烯溶液(MFC中终浓度为0.2mg/ml)同时加入MFC阳极中,充入氮气,放在磁力搅拌器上,50rpm转动,所有MFC都放在30℃恒温培养箱中。

以实施例5中的CT5-CP为基础,区别在于不含flavins基因序列ribA、ribD、ribE、ribH、ribC(本实施例记为CT-CP)和CT5-31O-CP为试验对象。

1、电化学表征

图13中a是以1mV/s为扫速的循环伏安图(CV),从图中可以看出加入GO后,CT-CP+GO的DET(-0.3V到-0.1V vs氯化银电极)电流密度明显比对照(CT-CP,不含GO)高很多,说明加入GO后,明显增强了DET效率。CT5-31O-CP+GO又明显高于CT-CP+GO,且在-0.4V有明显的flavins峰,这说明改造后的细菌能更好的在MET和DET两方面提高EET效率。

图13中b和c是以为扫速为0.1mV/s的线性扫描伏安图(LSV)即极化曲线,从图中可以看出,CT5-31O-CP+GO最高的功率密度为2.63W/m2(对照CT-CP功率密度只有0.3W/m2),表明了本发明希瓦氏菌跟材料结合后,MFC效果获得最佳效果。

图14为本发明重组希瓦氏菌的多周期MFC电压图,从该图中同样可以看出本发明希瓦氏菌跟材料结合后,MFC效果获得最佳效果。

2、光学表征

用扫描电子显微镜(SEM)来分析阳极生物膜的形态,从MFC中取出2维阳极碳布,先用2.5%的戊二醛固定液浸泡1小时,然后不同浓度(25%,50%,75%,95%,100%)的乙醇溶液浸泡,真空冷冻干燥,喷金,检测,加速电压3kV。

拉曼光谱,傅里叶红外变换和XPS检测用来检测阳极的光学形态表征。

如图15所示,改造后的希瓦氏菌CT5-31O-CP(图15-b)吸附大量的细菌,改造前(图15-a)只能吸附很少,加入GO后,形成了更厚更致密的生物膜(图15-c),图15-d是CT5-31O-CP+GO后阳极侧面图,从图中很明显可以看出形成了非常厚的多层生物膜,阳极生物载量比不加GO之前明显增加了很多。

拉曼光谱、傅里叶红外变换和XPS进一步采用来验证细菌-flavins-rGO杂化生物膜的形成(图16)。图16-a是拉曼光谱,图中可以看出rGO/flavins图谱的D/G升高,表明了GO被还原成rGO。图16-b是傅里叶红外变换光谱,还原后的rGO/flavins图谱C=O和O-H峰明显减少,C-N,-OH和C-O峰出现,跟flavin(包含RF和FMN)图谱相对应,说明GO被还原成rGO,且flavins吸附在GO上。图16-c是C1s XPS图谱,从图中可以明显看出还原后C-O能明显减少。图16-d是N1s的XPS图,还原后有明显的N1峰,且flavins也有明显的N峰,进一步证明了flavins吸附在rGO上。

实施例7:连接不同RBS序列的OprF对MFC的影响

针对本领域RBS序列进行优化,获得如下4个序列:

BBa_B0030:ATTAAAGAGGAGAAA;

BBa_B0031:TCACACAGGAAACC;

BBa_B0032:TCACACAGGAAAG;

BBa_B0034:AAAGAGGAGAAA;

1、不同RBS连接OprF的细胞生长试验

将启动子Ptet和上述各优化后的RBS序列以及OprF序列直接拼接,然后连接到质粒PYYD,分别获得Ptet-30RBS-OprF-PYYD、Ptet-31RBS-OprF-PYYD、Ptet-32RBS-OprF-PYYD、Ptet-34RBS-OprF-PYYD重组质粒,同时以仅含有启动子Ptet的PYYD的质粒为对照,命名为Ptet-PYYD;

将各质粒转化到希瓦氏菌MR-1中,依次获得。Tet/MR-1、Tet-30O/MR-1、Tet-31O/MR-1、Tet-32O/MR-1、Tet-34O/MR-1重组希瓦氏菌,然后进行细胞培养试验,结果见图17。由图17可见,只有采用BBa_B0031序列的希瓦氏菌生长状态最佳,即本发明中的RBS2序列。

2、不同RBS连接OprF的MFC产电实验

采用1中的Tet/MR-1、Tet-30O/MR-1、Tet-31O/MR-1、Tet-32O/MR-1、Tet-34O/MR-1重组希瓦氏菌,按照前述MFC双室产电方法进行试验,结果见图18的时间-电压图,可见从MFC电化学性能上也是采用BBa_B0031序列的希瓦氏菌生长状态最佳,即本发明中的RBS2序列。

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

海南大学

<120> 一种重组质粒以及重组希瓦氏菌和MFC产电的方法

<130> MP1727136

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaagaggaga aa 12

<210> 2

<211> 1530

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgacaccat cgaatggtgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga 60

gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg 120

gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa 180

cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac 240

aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc 300

acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg 360

tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc 420

ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca 480

ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga 540

cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc 600

tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg 660

cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag 720

cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga 780

atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa 840

tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg 900

acgataccga agacagctca tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc 960

gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga 1020

agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata 1080

cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 1140

cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagct cactcattag 1200

gcacaattct catgtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg 1260

tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg 1320

tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt 1380

ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga 1440

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagccagt ccgtttaggt gttttcacga 1500

gcacttcacc aacaaggacc atagcatatg 1530

<210> 3

<211> 698

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaagaccca ctttcacatt taagttgttt ttctaatccg caaatgatca attcaaggcc 60

gaataagaag gctggctctg caccttggtg atcaaataat tcgatagctt gtcgtaataa 120

tggcggcata ctatcagtag taggtgtttc cctttcttct ttagcgactt gatgctcttg 180

atcttccaat acgcaaccta aagtaaaatg ccccacagcg ctgagtgcat ataatgcatt 240

ctctagtgaa aaaccttgtt ggcataaaaa ggctaattga ttttcgagag tttcatactg 300

tttttctgta ggccgtgtac ctaaatgtac ttttgctcca tcgcgatgac ttagtaaagc 360

acatctaaaa cttttagcgt tattacgtaa aaaatcttgc cagctttccc cttctaaagg 420

gcaaaagtga gtatggtgcc tatctaacat ctcaatggct aaggcgtcga gcaaagcccg 480

cttatttttt acatgccaat acaatgtagg ctgctctaca cctagcttct gggcgagttt 540

acgggttgtt aaaccttcga ttccgacctc attaagcagc tctaatgcgc tgttaatcac 600

tttactttta tctaatctgc tcatcattaa ttcctaattt ttgttgacac tctatcgttg 660

atagagttat tttaccactc cctatcagtg atagagaa 698

<210> 4

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgttccacc caatcgaaga agctttagat gctttaaaaa aaggtgaagt tatcatcgtt 60

gttgatgatg aagatcgtga aaacgaaggt gatttcgttg ctttagctga acacgctact 120

ccagaagtta tcaacttcat ggctactcac ggtcgtggtt taatctgtac tccattatct 180

gaagaaatcg ctgatcgttt agatttacac ccaatggttg aacacaacac tgattctcac 240

cacactgctt tcactgtttc tatcgatcac cgtgaaacta aaactggtat ctctgctcaa 300

gaacgttctt tcactgttca agctttatta gattctaaat ctgttccatc tgatttccaa 360

cgtccaggtc acatcttccc attaatcgct aaaaaaggtg gtgttttaaa acgtgctggt 420

cacactgaag ctgctgttga tttagctgaa gcttgtggtt ctccaggtgc tggtgttatc 480

tgtgaaatca tgaacgaaga tggtactatg gctcgtgttc cagaattaat cgaaatcgct 540

aaaaaacacc aattaaaaat gatcactatc aaagatttaa tccaataccg ttacaactta 600

actactttag ttgaacgtga agttgatatc actttaccaa ctgatttcgg tactttcaaa 660

gtttacggtt acactaacga agttgatggt aaagaacacg ttgctttcgt tatgggtgat 720

gttccattcg gtgaagaacc agttttagtt cgtgttcact ctgaatgttt aactggtgat 780

gttttcggtt ctcaccgttg tgattgtggt ccacaattac acgctgcttt aaaccaaatc 840

gctgctgaag gtcgtggtgt tttattatac ttacgtcaag aaggtcgtgg tatcggttta 900

atcaacaaat taaaagctta caaattacaa gaacaaggtt acgatactgt tgaagctaac 960

gaagctttag gtttcttacc agatttacgt aactacggta tcggtgctca aatcttacgt 1020

gatttaggtg ttcgtaacat gaaattatta actaacaacc cacgtaaaat cgctggttta 1080

gaaggttacg gtttatctat ctctgaacgt gttccattac aaatggaagc taaagaacac 1140

aacaaaaaat acttacaaac taaaatgaac aaattaggtc acttattaca cttctaa 1197

<210> 5

<211> 1086

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggaagaat actacatgaa attagcttta gatttagcta aacaaggtga aggtcaaact 60

gaatctaacc cattagttgg tgctgttgtt gttaaagatg gtcaaatcgt tggtatgggt 120

gctcacttaa aatacggtga agctcacgct gaagttcacg ctatccacat ggctggtgct 180

cacgctgaag gtgctgatat ctacgttact ttagaaccat gttctcacta cggtaaaact 240

ccaccatgtg ctgaattaat catcaactct ggtatcaaac gtgttttcgt tgctatgcgt 300

gatccaaacc cattagttgc tggtcgtggt atctctatga tgaaagaagc tggtatcgaa 360

gttcgtgaag gtatcttagc tgatcaagct gaacgtttaa acgaaaaatt cttacacttc 420

atgcgtactg gtttaccata cgttacttta aaagctgctg cttctttaga tggtaaaatc 480

gctacttcta ctggtgattc taaatggatc acttctgaag ctgctcgtca agatgctcaa 540

caataccgta aaactcacca atctatctta gttggtgttg gtactgttaa agctgataac 600

ccatctttaa cttgtcgttt accaaacgtt actaaacaac cagttcgtgt tatcttagat 660

actgttttat ctatcccaga agatgctaaa gttatctgtg atcaaatcgc tccaacttgg 720

atcttcacta ctgctcgtgc tgatgaagaa aaaaaaaaac gtttatctgc tttcggtgtt 780

aacatcttca ctttagaaac tgaacgtatc caaatcccag atgttttaaa aatcttagct 840

gaagaaggta tcatgtctgt ttacgttgaa ggtggttctg ctgttcacgg ttctttcgtt 900

aaagaaggtt gtttccaaga aatcatcttc tacttcgctc caaaattaat cggtggtact 960

cacgctccat ctttaatctc tggtgaaggt ttccaatcta tgaaagatgt tccattatta 1020

caattcactg atatcactca aatcggtcgt gatatcaaat taactgctaa accaactaaa 1080

gaataa 1086

<210> 6

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgttcactg gtatcatcga agaaactggt actatcgaat ctatgaaaaa agctggtcac 60

gctatggctt taactatcaa atgttctaaa atcttagaag atgttcactt aggtgattct 120

atcgctgtta acggtatctg tttaactgtt actgatttca ctaaaaacca attcactgtt 180

gatgttatgc cagaaactgt taaagctact tctttaaacg atttaactaa aggttctaaa 240

gttaacttag aacgtgctat ggctgctaac ggtcgtttcg gtggtcactt cgtttctggt 300

cacgttgatg gtactgctga aatcactcgt atcgaagaaa aatctaacgc tgtttactac 360

gatttaaaaa tggatccatc tttaactaaa actttagttt taaaaggttc tatcactgtt 420

gatggtgttt ctttaactat cttcggttta actgaagata ctgttactat ctctttaatc 480

ccacacacta tctctgaaac tatcttctct gaaaaaacta tcggttctaa agttaacatc 540

gaatgtgata tgatcggtaa atacatgtac cgtttcttac acaaagctaa cgaaaacaaa 600

actcaacaaa ctatcactaa agctttctta tctgaaaacg gtttctaa 648

<210> 7

<211> 465

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaacatca tccaaggtaa cttagttggt actggtttaa aaatcggtat cgttgttggt 60

cgtttcaacg atttcatcac ttctaaatta ttatctggtg ctgaagatgc tttattacgt 120

cacggtgttg atactaacga tatcgatgtt gcttgggttc caggtgcttt cgaaatccca 180

ttcgctgcta aaaaaatggc tgaaactaaa aaatacgatg ctatcatcac tttaggtact 240

gttatccgtg gtgctactac tcactacgat tacgtttgta acgaagctgc taaaggtatc 300

gctcaagctg ctaacactac tggtgttcca gttatcttcg gtatcgttac tactgaaaac 360

atcgaacaag ctatcgaacg tgctggtact aaagctggta acaaaggtgt tgattgtgct 420

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<210> 8

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgaaaacta tccacatcac tcacccacac cacttaatca aagaagaaca agctaaatct 60

gttatggctt taggttactt cgatggtgtt cacttaggtc accaaaaagt tatcggtact 120

gctaaacaaa tcgctgaaga aaaaggttta actttagctg ttatgacttt ccacccacac 180

ccatctcacg ttttaggtcg tgataaagaa ccaaaagatt taatcactcc attagaagat 240

aaaatcaacc aaatcgaaca attaggtact gaagttttat acgttgttaa attcaacgaa 300

gttttcgctt ctttatctcc aaaacaattc atcgatcaat acatcatcgg tttaaacgtt 360

caacacgctg ttgctggttt cgatttcact tacggtaaat acggtaaagg tactatgaaa 420

actatgccag atgatttaga tggtaaagct ggttgtacta tggttgaaaa attaactgaa 480

caagataaaa aaatctcttc ttcttacatc cgtactgctt tacaaaacgg tgatgttgaa 540

ttagctaacg ttttattagg tcaaccatac ttcatcaaag gtatcgttat ccacggtgat 600

aaacgtggtc gtactatcgg tttcccaact gctaacgttg gtttaaacaa ctcttacatc 660

gttccaccaa ctggtgttta cgctgttaaa gctgaagtta acggtgaagt ttacaacggt 720

gtttgtaaca tcggttacaa accaactttc tacgaaaaac gtccagaaca accatctatc 780

gaagttaact tattcgattt caaccaagaa gtttacggtg ctgctatcaa aatcgaatgg 840

tacaaacgta tccgttctga acgtaaattc aacggtatca aagaattaac tgaacaaatc 900

gaaaaagata aacaagaagc tatccgttac ttctctaact tacgtaaata a 951

<210> 9

<211> 4374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacctcgcta acggattcac cgtttttatc aggctctggg aggcagaata aatgatcata 60

tcgtcaatta ttacctccac ggggagagcc tgagcaaact ggcctcaggc atttgagaag 120

cacacggtca cactgcttcc ggtagtcaat aaaccggtca gaatttcaga taaaaaaaat 180

ccttagcttt cgctaaggat gatttctgtg gtacctcgga tcccggggag ctagcacgaa 240

ttcgcggccg cttctagacc actagtagcg gccgcctgca ggtggtcgac cactcgaggc 300

caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 360

tttgtcggtg aacgctctct actagagtca cactggctca ccttcgggtg ggcctttctg 420

cgtttataac cggtaaacca gcaatagaca taagcggcta tttaacgacc ctgccctgaa 480

ccgacgaccg ggtcgaattt gctttcgaac cccagagtcc cgctcagaag aactcgtcaa 540

gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga 600

agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt 660

cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat 720

tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt 780

cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt 840

cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc 900

gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca 960

ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag gtgagatgac aggagatcct 1020

gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca 1080

cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca 1140

gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg 1200

acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga 1260

atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc 1320

gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag atcttgatcc cctgcgccat cagatccttg 1380

gcggcaagaa agccatccag tttactttgc agggcttccc aaccttacca gagggcgccc 1440

cagctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc ataaaaccgc ccagtctagc tatcgccatg 1500

taagcccact gcaagctacc tgctttctct ttgcgcttgc gttttccctt gtccagatag 1560

cccagtagct gacattcatc ccaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc gcccgcgttc 1620

ctgctggcgc tgggcctgtt tctggcgctg gacttcccgc tgttccgtca gcagcttttc 1680

gcccacggcc ttgatgatcg cggcggcctt ggcctgcata tcccgattca acggccccag 1740

ggcgtccaga acgggcttca ggcgctcccg aaggtctcgg gccgtctctt gggcttgatc 1800

ggccttcttg cgcatctcac gcgctcctgc ggcggcctgt agggcaggct catacccctg 1860

ccgaaccgct tttgtcagcc ggtcggccac ggcttccggc gtctcaacgc gctttgagat 1920

tcccagcttt tcggccaatc cctgcggtgc ataggcgcgt ggctcgaccg cttgcgggct 1980

gatggtgacg tggcccactg gtggccgctc cagggcctcg tagaacgcct gaatgcgcgt 2040

gtgacgtgcc ttgctgccct cgatgccccg ttgcagccct agatcggcca cagcggccgc 2100

aaacgtggtc tggtcgcggg tcatctgcgc tttgttgccg atgaactcct tggccgacag 2160

cctgccgtcc tgcgtcagcg gcaccacgaa cgcggtcatg tgcgggctgg tttcgtcacg 2220

gtggatgctg gccgtcacga tgcgatccgc cccgtacttg tccgccagcc acttgtgcgc 2280

cttctcgaag aacgccgcct gctgttcttg gctggccgac ttccaccatt ccgggctggc 2340

cgtcatgacg tactcgaccg ccaacacagc gtccttgcgc cgcttctctg gcagcaactc 2400

gcgcagtcgg cccatcgctt catcggtgct gctggccgcc cagtgctcgt tctctggcgt 2460

cctgctggcg tcagcgttgg gcgtctcgcg ctcgcggtag gcgtgcttga gactggccgc 2520

cacgttgccc attttcgcca gcttcttgca tcgcatgatc gcgtatgccg ccatgcctgc 2580

ccctcccttt tggtgtccaa ccggctcgac gggggcagcg caaggcggtg cctccggcgg 2640

gccactcaat gcttgagtat actcactaga ctttgcttcg caaagtcgtg accgcctacg 2700

gcggctgcgg cgccctacgg gcttgctctc cgggcttcgc cctgcgcggt cgctgcgctc 2760

ccttgccagc ccgtggatat gtggacgatg gccgcgagcg gccaccggct ggctcgcttc 2820

gctcggcccg tggacaaccc tgctggacaa gctgatggac aggctgcgcc tgcccacgag 2880

cttgaccaca gggattgccc accggctacc cagccttcga ccacataccc accggctcca 2940

actgcgcggc ctgcggcctt gccccatcaa tttttttaat tttctctggg gaaaagcctc 3000

cggcctgcgg cctgcgcgct tcgcttgccg gttggacacc aagtggaagg cgggtcaagg 3060

ctcgcgcagc gaccgcgcag cggcttggcc ttgacgcgcc tggaacgacc caagcctatg 3120

cgagtggggg cagtcgaagg cgaagcccgc ccgcctgccc cccgagcctc acggcggcga 3180

gtgcgggggt tccaaggggg cagcgccacc ttgggcaagg ccgaaggccg cgcagtcgat 3240

caacaagccc cggaggggcc actttttgcc ggagggggag ccgcgccgaa ggcgtggggg 3300

aaccccgcag gggtgccctt ctttgggcac caaagaacta gatatagggc gaaatgcgaa 3360

agacttaaaa atcaacaact taaaaaaggg gggtacgcaa cagctcattg cggcaccccc 3420

cgcaatagct cattgcgtag gttaaagaaa atctgtaatt gactgccact tttacgcaac 3480

gcataattgt tgtcgcgctg ccgaaaagtt gcagctgatt gcgcatggtg ccgcaaccgt 3540

gcggcaccct accgcatgga gataagcatg gccacgcagt ccagagaaat cggcattcaa 3600

gccaagaaca agcccggtca ctgggtgcaa acggaacgca aagcgcatga ggcgtgggcc 3660

gggcttattg cgaggaaacc cacggcggca atgctgctgc atcacctcgt ggcgcagatg 3720

ggccaccaga acgccgtggt ggtcagccag aagacacttt ccaagctcat cggacgttct 3780

ttgcggacgg tccaatacgc agtcaaggac ttggtggccg agcgctggat ctccgtcgtg 3840

aagctcaacg gccccggcac cgtgtcggcc tacgtggtca atgaccgcgt ggcgtggggc 3900

cagccccgcg accagttgcg cctgtcggtg ttcagtgccg ccgtggtggt tgatcacgac 3960

gaccaggacg aatcgctgtt ggggcatggc gacctgcgcc gcatcccgac cctgtatccg 4020

ggcgagcagc aactaccgac cggccccggc gaggagccgc ccagccagcc cggcattccg 4080

ggcatggaac cagacctgcc agccttgacc gaaacggagg aatgggaacg gcgcgggcag 4140

cagcgcctgc cgatgcccga tgagccgtgt tttctggacg atggcgagcc gttggagccg 4200

ccgacacggg tcacgctgcc gcgccggtag cacttgggtt gcgcagcaac ccgtaagtgc 4260

gctgttccag actatcggct gtagccgcct cgccgcccta taccttgtct gcctccccgc 4320

gttgcgtcgc ggtgcatgga gccgggccac ctcgacctga atggaagccg gcgg 4374

<210> 10

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgaaattaa aaaacacttt aggtgttgtt atcggttctt tagttgctgc ttctgctatg 60

aacgctttcg ctcaaggtca aaactctgtt gaaatcgaag ctttcggtaa acgttacttc 120

actgattctg ttcgtaacat gaaaaacgct gatttatacg gtggttctat cggttacttc 180

ttaactgatg atgttgaatt agctttatct tacggtgaat accacgatgt tcgtggtact 240

tacgaaactg gtaacaaaaa agttcacggt aacttaactt ctttagatgc tatctaccac 300

ttcggtactc caggtgttgg tttacgtcca tacgtttctg ctggtttagc tcaccaaaac 360

atcactaaca tcaactctga ttctcaaggt cgtcaacaaa tgactatggc taacatcggt 420

gctggtttaa aatactactt cactgaaaac ttcttcgcta aagcttcttt agatggtcaa 480

tacggtttag aaaaacgtga taacggtcac caaggtgaat ggatggctgg tttaggtgtt 540

ggtttcaact tcggtggttc taaagctgct ccagctccag aaccagttgc tgatgtttgt 600

tctgattctg ataacgatgg tgtttgtgat aacgttgata aatgtccaga tactccagct 660

aacgttactg ttgatgctaa cggttgtcca gctgttgctg aagttgttcg tgttcaatta 720

gatgttaaat tcgatttcga taaatctaaa gttaaagaaa actcttacgc tgatatcaaa 780

aacttagctg atttcatgaa acaataccca tctacttcta ctactgttga aggtcacact 840

gattctgttg gtactgatgc ttacaaccaa aaattatctg aacgtcgtgc taacgctgtt 900

cgtgatgttt tagttaacga atacggtgtt gaaggtggtc gtgttaacgc tgttggttac 960

ggtgaatctc gtccagttgc tgataacgct actgctgaag gtcgtgctat caaccgtcgt 1020

gttgaagctg aagttgaagc tgaagctaaa taa 1053

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcacacagga aacc 14

<210> 12

<211> 1190

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac ggaactcgct 60

cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat cgtcaaaacc 120

aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca gcttcgcctg 180

gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct ggcggaaaag 240

atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga tatcaaaatt 300

gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat tatccatcgg 360

tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct caagcagatt 420

tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga tttgcccaaa 480

caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg tattggcaaa 540

tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt aaacccactg 600

gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc ctggcgggaa 660

cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca ccaccccctg 720

accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt cgataaaaaa 780

atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg cattaaacga 840

gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac tcccgccatt 900

cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg tcttttactg 960

gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt aacaaagcgg 1020

gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca gaaaagtcca 1080

cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat ccataagatt 1140

agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat 1190

<210> 13

<211> 1284

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 60

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga 120

gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc 180

cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata 240

acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag 300

cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat 360

cgcagtggga acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc 420

actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg 480

ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat 540

ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga 600

gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt 660

agtgcaggca gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag 720

cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct 780

tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc 840

cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa 900

cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat 960

cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg 1020

ggaaacggtc tgataagaga caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt 1080

cacattcacc accctgaatt gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt 1140

tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatcta tttcagataa aaaaaatcct tagctttcgc 1200

taaggatgat ttctggaatt cgccgctcct aggccgatgg cgcgccgaga ggctttacac 1260

tttatgcttc cggctcgtat aatg 1284

<210> 14

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 60

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga 120

gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc 180

cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata 240

acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag 300

cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat 360

cgcagtggga acgatgccct cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc 420

actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg 480

ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat 540

ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga 600

gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt 660

agtgcaggca gcttccacag caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag 720

cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct 780

tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc 840

cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa 900

cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat 960

cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg 1020

ggaaacggtc tgataagaga caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt 1080

cacattcacc accctgaatt gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt 1140

tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatcta tttcagataa aaaaaatcct tagctttcgc 1200

taaggatgat ttctggaatt cgccgctcct aggcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 1260

tatagg 1266

<210> 15

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acgcctaatc cagaaatttg ttaacatttc atttgttaac aaatgcctaa aacgagtaca 60

atgtcgtcat tggccagtta agcagataac attaagtttg cttaatcttg acaagggttt 120

gttagattcc tctgcgaaat caccttatgc tggccggaca tcttttaaaa tgtgttctac 180

atttgattta tcatttaaac attttaaaaa aaacaatagt taaggaacta ttcttaacta 240

ttgcttatcg aagttgatac tggttacgtt ttatcgtatt acactttaaa cgttcactta 300

tatacatcct gacgtgtagc cgtaaagatc ttccctttga agcacagagc agtgagtgga 360

agtatcaaca atttatgaat ataagaatcc gatgtaagtg attcttatgg ttagaatatt 420

ggttaaaatt taggtactta atatgca 447

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