本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于悬浮微珠阵列系统检测虫媒介病毒的探针、引物、检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
：：虫媒介病毒是指一类以吸血昆虫为媒介，在脊椎动物和人、畜间传播多种严重疾病的病毒。近几年在世界热带丛林地区，和我国南方流行的登革热病毒、寨卡病毒感染，都属于虫媒介传播的病毒。感染了虫媒介病毒的患者在临床症状上有相同之处，包括发热、肌肉关节疼痛、皮疹、淋巴肿大，等等。目前临床上主要是通过酶联免疫法或者荧光定量pcr方法，单种病毒进行诊断，因此存在漏诊的风险。有一些报道已经就虫媒介病毒的高通量诊断上做了一些尝试，这些技术多没有包括最新发生的寨卡病毒，并且在实际应用上只是用实验室感染了病毒的细胞株和少数的临床样本做了测试，不能真实反应其技术的可用性。悬浮微珠阵列技术是属于生物芯片技术的一种，它是以一种可以在液体中悬浮流动的微珠为介质来固定支持探针，探针就能随着微珠的流动方式和样本进行杂交；而固定在玻璃平面或者尼龙膜平面上的探针则是不能流动的，这样悬浮微珠阵列技术中核酸分子的杂交动力学就会优于固态表面的杂交，并且由于微珠可以通过外表面包裹磁性材料而使得悬浮微珠阵列技术容易实现自动化操作。悬浮微珠阵列技术的技术核心是微珠的编码和解码。固体平面上的探针是通过有序的行与列的位置关系来实现探针的寻址的；而微珠悬浮阵列技术中，微珠是流动的，自然就无法通过位置来寻址了，因此只能通过对微珠本身进行编码。目前国际上有两种微珠编码技术，一种是美国的luminex公司的基于红外材料的荧光编码技术，就是把两种红外材料按照不同的配比混合，使之发出不同波段的荧光，达到编码微珠的目的，称为荧光编码，例如99％的a材料+1％的b材料混合后，编码1号微珠；98％的a材料+2％的b材料混合后，编码2号微珠，诸如类推，这样至少可以编码100种微珠。另外一种悬浮微珠技术是美国appliedbiocode公司，以及台湾plexbio公司的二维编码技术，是通过电脑微加工技术，分别在长方体和圆柱体的硅质颗粒上蚀刻出不同方向的痕迹，产生横向和纵向的二维编码，可编码4000-16000种微珠。这两种悬浮微珠阵列技术尽管各自的编码技术不同，但对于临床应用来说，都可以满足一次试验检测指标多、容易自动化操作、单位时间检测样本量多的需求。技术实现要素：：本发明的首要目的在于克服现有的从核酸水平检测虫媒介病毒方法的不足，提供一种基于悬浮微珠阵列系统检测虫媒介病毒的探针、引物、检测试剂盒及检测方法。本发明的第一个目的是提供一种基于悬浮微珠阵列系统检测虫媒介病毒的探针，所述的探针序列如下所示：gapdh-p：5’-tggggagtccctgccacac-3’(如seqidno.1所示)；denv1-p：5’-tcagtrtggaatagggttt-3’(如seqidno.2所示)；denv2-p：5’-tcaacatagaagcagaacc-3’(如seqidno.3所示)；denv3-p：5’-tatggctgaaactccgag-3’(如seqidno.4所示)；denv4-p：5’-tcaatatgctgaaacgc-3’(如seqidno.5所示)；wnv-p：5’-agccaagatcagcatgccagc-3’(如seqidno.6所示)；jev-p：5’-tgacnattcctgcggttttgggg-3’(如seqidno.7所示)；tbe-p：5’-cccatyacyccwgtgtcac-3’(如seqidno.8所示)；yfv-p1：5’-ctggatgatcaaggaaacagcytgcctc-3’(如seqidno.9所示)；yfv-p2：5’-ctggatgatcaaagaaacggcytgcctc-3’(如seqidno.10所示)；chikv-p：5’-ctgcaacgtcacacagatgaggga-3’(如seqidno.11所示)；zika-p：5’-tgctggtgtatgggcacarcac-3’(如seqidno.12所示)；所述的探针的5’端带有连接臂。连接臂上的-nh2可以和微珠上的-cooh发生化学缩合反应，使得探针连接到微珠上。所述的连接臂优选为烷基胺连接臂。所述的烷基胺连接臂优选为c18-nh2连接臂。本发明的第二个目的是提供一种基于悬浮微珠阵列系统检测虫媒介病毒的引物，所述的引物序列如下所示：gapdh-f：5’-caagctcatttcctggtatgaca-3’(如seqidno.13所示)，gapdh-r：5’-gggagattcagtgtggtggg-3’(如seqidno.14所示)；denv1-f：5’-caatggatgacaacagaagayatg-3’(如seqidno.15所示)，denv1-r：5’-tccatccatgggttttcctctat-3’(如seqidno.16所示)；denv2-f：5’-gcagaracacaacatggaacratagt-3’(如seqidno.17所示)，denv2-r：5’-tgatgtarctgtcyccraatgg-3’(如seqidno.18所示)；denv3-f：5’-atggaatgtgtgggaggtgg-3’(如seqidno.19所示)，denv3-r：5’-ggctttctatccartagcccatg-3’(如seqidno.20所示)；denv4-f：5’-gcagatctctggaaaaatgaacca-3’(如seqidno.21所示)，denv4-r：5’-gagaatctcttcaccaacccytg-3’(如seqidno.22所示)；ns2a-f：5’-ccttttcagytgggccttctg-3’(如seqidno.23所示)，ns2a-r：5’-cagtgtavgtvatrcccccaa-3’(如seqidno.24所示)；tbe-f：5’-tggayttyagacaggaancracaca-3’(如seqidno.25所示)，tbe-r：5’-tccagagrctytgrtcdgtgtgga-3’(如seqidno.26所示)；yfv-f：5’-gaggaagggtgtctccaggaa-3’(如seqidno.27所示)，yfv-r：5’-acatgttggcataggcyttgct-3’(如seqidno.28所示)；chikv-f：5’-tgtactggcagcagccacg-3’(如seqidno.29所示)，chikv-r：5’-atagggctggcagcaaattc-3’(如seqidno.30所示)；zika-f：5’-acgctcagagtcctytccatg-3’(如seqidno.31所示)，zika-r：5’-gtcgctccakggtytccatc-3’(如seqidno.32所示)；所述的引物gapdh-r、denv1-r、denv2-r、denv3-r、denv4-r、ns2a-r、tbe-r、yfv-r、chikv-r和zika-r的5’端标记有生物素。本发明的第三个目的是提供一种基于悬浮微珠阵列系统检测虫媒介病毒的检测试剂盒，包括所述的基于悬浮微珠阵列系统检测虫媒介病毒的探针和引物。所述的检测试剂盒还包括2×onesteprt-pcrbuffer、onesteprt-pcrenzymemix和微珠。所述的微珠优选为荧光编码微球或者二维编码微球。所述的荧光编码微珠优选为美国luminex公司的表面羧基修饰的微珠。本发明的第四个目的是提供一种基于悬浮微珠阵列系统检测虫媒介病毒的检测方法，包括以下步骤：1)悬浮微珠阵列的制备：将所述的探针分别与不同的编码微球进行偶联，然后将偶联好探针的编码微球等量混合，得到悬浮微珠阵列；2)样本pcr扩增：提取待测样本的总rna，利用所述的引物对待测样本的总rna进行多重rt-pcr扩增，得到pcr产物；3)将pcr产物与悬浮微珠阵列进行杂交，得到杂交产物，再用链霉亲和素r-藻红蛋白对杂交产物进行显色，通过悬浮微珠阵列读取仪读取检测结果，判断待测样本中是否含有所检测的虫媒介病毒。所述的多重rt-pcr扩增，其反应体系优选为25μl：包括1×onesteprt-pcrbuffer、所述的引物gapdh-f、gapdh-r、denv1-f、denv1-r、denv2-f、denv2-r、denv3-f、denv3-r、denv4-f、denv4-r、ns2a-f、ns2a-r、tbe-f、tbe-r、yfv-f、yfv-r、chikv-f、chikv-r、zika-f和zika-r各0.4μm、onesteprt-pcrenzymemix0.5μl，待测样本的总rna2μl，其余为rnase-freewater；反应条件为：45℃30min；95℃2min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，40次循环；72℃5min。本发明最关键的构思在于：本发明通过设计虫媒介传播常见病毒的多重pcr扩增引物和探针，可以兼容两种悬浮微珠阵列系统来检测多种虫媒介病毒，在一次实验中可实现对7种虫媒介病毒：登革热病毒(1-4型)、日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒、基孔雅肯热病毒、塞卡病毒进行检测。一方面简化了检测虫媒介病毒的流程，另一方面也可以降低临床的检测费用。本发明所描述的悬浮微珠阵列系统检测虫媒介病毒较目前同样在核酸水平检测登革热等病毒的荧光定量等检测方法的优点包括：①在一次实验中就可以完成7种虫媒介病毒的检测，可以最大程度的防止漏检，有利于临床进行针对性的治疗；②摊分到单个指标的检测上，试剂耗材的成本费用大幅度降低，因此可以降低医疗成本；③检测耗时短，操作步骤简单，整个检测流程约8个小时；④专一性强，尤其是能检出不同血清型的登革热病毒。附图说明：图1是本发明的基于悬浮微珠阵列系统检出样本中的登革热病毒2型。图2是本发明的基于悬浮微珠阵列系统检出样本中的寨卡病毒。具体实施方式：下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明通过设计虫媒介传播常见病毒的多重pcr扩增引物和探针，可以兼容两种悬浮微珠阵列系统来检测多种虫媒介病毒，在一次实验中可实现对登革热病毒(1-4型)、日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒、基孔雅肯热病毒、塞卡病毒进行检测。实施例1：1、多重pcr引物设计：以上7种病毒都是rna病毒，因此这7种rna病毒的多重反转录pcr设计在一管中反应，这7种病毒，以及用于内参的人的gapdh基因对应的pcr引物序列见表1。所有的反向引物(即引物gapdh-r、denv1-r、denv2-r、denv3-r、denv4-r、ns2a-r、tbe-r、yfv-r、chikv-r和zika-r)的5’端标记有生物素。部分引物序列中含有简并碱基，其中y代表碱基c或t，r代表碱基a或g、v代表碱基g或a或c，n代表碱基a或t或g或c，d代表碱基g或a或t，k代表碱基g或t。表1.检测rna病毒的多重pcr引物序列注：f表示正向引物；r表示反向引物2、探针设计：本发明针对7种虫媒介病毒和1个人的内参基因一共设计了12条探针，其中黄热病病毒设计了2条探针。探针序列如表2。表2.探针序列探针名称探针序列(5’-3’)所检测的病原体gapdh-ptggggagtccctgccacac人的内参基因denv1-ptcagtrtggaatagggttt登革热病毒1型denv2-ptcaacatagaagcagaacc登革热病毒2型denv3-ptatggctgaaactccgag登革热病毒3型denv4-ptcaatatgctgaaacgc登革热病毒4型wnv-pagccaagatcagcatgccagc西尼罗病毒jev-ptgacnattcctgcggttttgggg日本乙型脑炎病毒tbe-pcccatyacyccwgtgtcac森林脑炎病毒yfv-p1ctggatgatcaaggaaacagcytgcctc黄热病病毒(探针1)yfv-p2ctggatgatcaaagaaacggcytgcctc黄热病病毒(探针2)chikv-pctgcaacgtcacacagatgaggga基孔肯雅热病毒zika-ptgctggtgtatgggcacarcac寨卡病毒注：所有的探针的5’端带c18-nh2修饰3、悬浮微珠阵列的制备：将荧光编码微球(或者二维编码微球)与表2的探针分别偶联，然后将偶联好探针的编码微球等量混合(可根据检测目的将偶联好探针的编码微球混合)，得到悬浮微珠阵列。按照一万人份理论量计算，一种探针与一个编码的磁珠进行偶联，具体实验步骤为：a、从-20℃取出密封干燥保存的二氯乙烷(edc)粉末，使其恢复至室温。b、融化已配置好的100μm的探针溶液，涡旋5s混匀并3000rpm离心30s。c、轻柔涡旋悬浮原料检验合格的磁珠(2-8℃储存)，超声处理30-60s。d、取1.5ml低吸附离心管编好号(磁珠编号+探针号)固定于磁力架上，将磁珠轻柔颠倒5-10次，避免剧烈震荡，移液器反复吹吸3次后吸取12.5×106个(1ml)磁珠靠磁力架内壁加至对应离心管中，吸附1min。e、小心移去上清(左手往磁力架方向压住管身，右手缓慢吸净上清，枪头始终应尽量靠远离磁力架方向，若有磁珠跟进枪头，则需重新吹打均匀，待其重新吸附后再次尝试)；加入60μl0.1m，ph＝4.5的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)溶液，超声处理30-60s，涡旋5s混匀。f、加入15μl100μm探针。g、称量10mg的edc粉末至于1.5ml离心管管中，加入1ml纯水，终浓度10mg/ml，涡旋5s混匀，立即取10μl加入到偶联管中，涡旋5s混匀。h、偶联管室温避光孵育30min，期间每隔10min涡旋5s混匀。i、重复步骤g和h两次。j、加入1ml0.02％tween-20，涡旋5s混匀，3000rpm离心1min，上磁力架1min。k、轻轻开盖并小心移除上清，加入1ml0.1％sds，涡旋5秒重悬，3000rpm离心1min，上磁力架1min。l、轻轻开盖并小心移除上清，加入500μl1×te(ph8.0，包括10mmtris-hcl和1mmedta)超声处理30-60s后涡旋5秒重悬。m、取1μl稀释100倍用细胞计数板在显微镜下进行计数(有自动计数仪亦可)，计算回收率计算微珠总数。n、luminex公司的微珠按照每人份每种微珠2000颗进行混合(appliedbiocode公司的微珠按照每人份每种微珠50颗进行混合)，得到悬浮微珠阵列；o、2-8℃避光保存，有效期14个月。4、标本检测：本发明所检测的样本为血浆(也可以为血清、唾液等)，可采用不同公司的商业化试剂盒-病毒基因组dna/rna提取试剂盒来提取样本的总rna。rna病毒的检测需要做反转录pcr反应，反转录pcr反应体系如表3，反应条件如表4。表3.多重rt-pcr扩增rna病毒的反应体系表4.多重rt-pcr反应条件取步骤3所配制的悬浮微珠阵列，分装至96孔板中，每孔45μl(包括12种分别偶联表2中的12种探针的编码微珠，每种微珠各2000个)，然后加入pcr产物5μl。在95℃热变性5min，60℃杂交15min，得到杂交产物，每孔加入25μl1×tmac杂交液稀释的链霉亲和素r-藻红蛋白0.04μg(可以先用1×tmac杂交液将链霉亲和素r-藻红蛋白配制成50×的显色母液，1×tmac杂交液包括3mtmac、质量体积比0.1％的十二烷基肌氨酸钠、ph8.050mmtris-hcl和ph8.04mmedta)，吸打10-20下以充分混匀，60℃显色7min。用luminex公司的悬浮微珠阵列读取仪对微珠进行解码(若使用的是appliedbiocode公司的微珠则用appliedbiocode公司的悬浮微珠阵列读取仪对微珠进行解码)，以及微珠上杂交信号的读取。通过仪器软件检测探针的荧光强度分析临床样本中是否含有所检测的虫媒介病毒。判读的标准为：人的内参基因gapdh探针的信号值＞1000，说明实验成功。在此前提下，虫媒介病毒探针＜600时，虫媒介病毒为阴性；600≤虫媒介病毒探针信号≤1000时，需要重复测试或者用qpcr方法进行验证；虫媒介病毒探针＞1000时，虫媒介病毒为阳性。5、灵敏度检测：取分别克隆有以上11种病毒亚型的靶基因片段的质粒，经过核酸定量后，进行系列稀释，然后用本实施例的方法进行检测，发现本发明所检测的11种病毒亚型的检测灵敏度为2×103-1×104copies/ml，与常规单种病毒检测的反转录pcr方法灵敏度相当。6、特异性检测对于本发明所检测的11种病毒亚型，能收集到临床标本的用临床标本；不能收集到临床标本的，通过细胞培养病毒后掺入到血浆中，分别按步骤4的方法提取总rna并进行多重rt-pcr扩增后与悬浮微珠阵列进行杂交，发现只有对应病毒亚型的探针信号显示为阳性；同时也用临床上收集的感染了其他rna病毒的临床样本，包括呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、肠病毒、轮状病毒、诺如病毒、鼻病毒、副流感病毒，用本发明的方法进行检测，悬浮阵列上的探针结果都是阴性，说明本发明检测的特异性高。实施例2：按照实施例1的方法对10个用抗原法和pcr方法确认是登革热病毒1型感染的阳性临床样本进行检测，检测阳性检出率结果如表5所示。表5.优化后的引物对登革热病毒1型的阳性检出率从表5可见经过对引物的简并碱基设计后，阳性检出率显著提高，能最大程度地检出阳性样本。实施例3：一名有发热、肌肉酸痛症状的孕妇，用登革热抗原方法查血检出是登革热病毒阳性，但不知为那种分型的登革热病毒，按照实施例1的方法确定为登革热2型病毒(见图1)，结果与抗原法和pcr方法相同。实施例4：一名临床症状为寨卡病毒感染，并且经过pcr方法检出是寨卡病毒感染的患者，其血浆用本发明的方法同样检出为寨卡病毒感染(见图2)。应用本发明的方法和试剂盒对257例临床上怀疑感染了虫媒介病毒的样本进行了检测，与抗原法和pcr方法比较准确率达100％。可见，本发明能在一次实验中检出7种(11个亚型)虫媒介病毒，包括登革热病毒(1-4型)、日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒、基孔雅肯热病毒、塞卡病毒进行检测。使用本发明所述的方法和试剂盒，约8小时能得出结果。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12