本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻粒黑粉病菌effector基因smut_2965及其应用。
背景技术：
水稻稻粒黑粉病是由tilletiahorrida引起的一种土传性真菌病害，在亚洲、美洲和非洲的许多稻区均有分布。黑粉病菌寄主范围较广，包括水稻、玉米、甘蔗、高粱、大麦等多种作物。黑粉病菌能够侵染多种作物与其分泌的effector分子有关，这种分子可以调节宿主的先天免疫并增强自身侵染。现在已普遍认为这些effector分子是增强寄生感染的关键致病因素。
稻粒黑粉病菌通过分泌effector分子，紧密的与其宿主结合并操控宿主细胞，改变宿主植株进程。在植物病原菌互作过程中，effector分子是主要的致病性因素。目前，植物病原菌互作中，effector已成为研究的热点。atr1(310个氨基酸序列)和atr13(150个氨基酸序列)是拟南芥病原hyaloperonosporaarabidopsidis具有无毒基因活性的两个effector，分别诱发rpp1-nd/wsb和rpp13-nd介导的抗性。atr13具有信号肽和rxlr基序特征，此外，还包含一个保守的亮氨酸/异亮氨酸重复序列，这个重复序列是被rpp13识别所必须的，事实上重复序列的变异并不意味着它是发挥毒性所必须的。值得注意的是在rpp13家族中至少有一个识别atr13的等位基因，但具体机理扔不清楚，说明无毒基因和抗性基因具有相互识别的复杂网络。atr1和atr13在h.arabidopsidis中的高度可变性及它们在拟南芥中的同源基因的多样性意味着这些effector可能极其有助于病原菌的适应性。atr1和atr13在抑制基础的抗性通路中的作用已经通过在细菌植物病原菌pseudomonassyringaedc3000中进行异源表达并运输到宿主细胞中建立起来。当被p.syringaedc3000运输到拟南芥中时，atr1和atr13都增加了毒性，并且减少了拟南芥中胼胝质的积累。
avr3a是phytophthorainfestans的细胞质rxlreffector蛋白。avr3a在致病机制中具有双重活性，其在表达r3a基因的植物中诱发过敏反应(hr)，但是在缺少r3a基因的植株中，avr3a抑制p.infestansinf1蛋白诱导的细胞死亡，这些不同的活性可以在结构水平上分离。在c-端氨基酸残基酪氨酸147处发生了删除或突变的avr3a保留了r3a介导的过敏反应，但是不能抑制inf1诱导的细胞死亡。另外，avr3a的两个主要的等位基因编码的蛋白质在effector结构域处只有两个氨基酸的差别，但是却有着很明显的活性差别。是avr3ak80/i103而不是avr3ae80/m103活化了r3a并且是inf1诱导的细胞死亡的比较强的抑制子。
除了rxlreffector外，对p.infestans分泌蛋白的研究又确认了另一个细胞质effector家族，即crinkler。crinkler是卵菌的另外一个大的、多样化的effector家族。高通量的功能筛选揭示了两个细胞死亡诱导蛋白crn1和crn2，当它们在植株中系统性的表达时会引起叶片的皱缩表型。随着p.infestans基因组序列的可利用性，对基因稀有区域的研究揭示了除了rxlreffector基因外，crn基因家族共定位于重复富集区域，并且跟其它的phytophthora基因家族相比，在p.infestans中crn基因家族已经戏剧性的扩张(193个预测的基因)。这个基因家族的扩充已经通过多基因复制和基因内部重组事件发生，这一事件最终导致了一个大的、多样化的嵌合effector系统。crneffector是以一个预测的n-端分泌信号肽为特征的模块化的蛋白质，后面是一个被保守的但并不是不变的lxlflak基序(crn蛋白的主要的定义特征)定义的结构域。大多数crn在lxlflak结构域后携带一个以hvlvxxp基序结尾的dwl结构域。haasetal.提出crn之间的重组，尤其是hvlvxxp基序后的重组，产生了极其多样化的c-端结构域(在p.infestans中是由36个相异的氨基酸决定的)。类似于好几个rxlr蛋白，一些crnc-端(因此缺少预测的n-端转移结构域)的在植物细胞内的表达诱导了细胞死亡。然而，在病害中crn诱导的细胞死亡的相关性仍然是不清楚的。
yoshidaetal.发现了从稻瘟病菌lna168特有序列中挖掘到的三个候选effector基因pex22、pex31和pex33，分别与三个无毒表型avr-pia、avr-pik/km/kp和avr-pii有着完美的联系。随后的遗传转化实验证实了是effectorpex22、pex31和pex33赋予了分别表达piapik/km/kp和pii抗性基因的水稻培养系的无毒性。通过定位克隆得知被鉴定为是avr-pia的pex22是独立的。pex22、pex31和pex33都很小，在长度上分别为85，70和113个氨基酸，包含分泌信号，并且在水稻细胞中的细胞质中被识别，这意味着在感染的过程中它们被运输到植物细胞中。有趣的是pex22形成一个包含四个同源物的小家族，这个小家族以两个序列基序的出现为特点：基序1是[li]xar[se][dse]，类似于avr-piz-t的lxar基序，能够抑制bax介导的细胞死亡；基序2是[rk]cxxcx12h，表现出与蛋白质-蛋白质相互作用有关的c2h2锌指基序的相似性。
来自亚麻锈病菌melampsoralini的转移effectoravrl567家族是通过与亚麻的抗性蛋白l5、l6和l7直接的相互作用被认识到的。这个系统是特别的，因为avrl567-a和avrl567-d的晶体结构已经得到阐明。这就允许在蛋白质结构背景下，在基因对基因基础上跟分子识别事件有关的多态性残基的作用进行检测。两种蛋白都没有接近已知的结构同源物。四个重要的高度多态性残基在avrl567的50、56、90和96位置处，它们对于激活r蛋白是关键的，并定位在这些effector蛋白的表面。有趣的是avrl567的四个残基的分布横跨整个蛋白质表面，表明avrl567和r蛋白的富亮氨酸重复结构域之间的相互作用，要求对于整体相互作用有累积效应的多重连接点。这在协同进化中保持或发展毒性功能(对于病原体来说是有利的)但同时规避宿主的检测可能是重要的。蛋白的结构也揭示了结合dna的两个正电荷表面点，随后的体外实验表明这些蛋白结合到核酸上。这表明当从最初序列中几乎不能得到有用线索时，结构生物学是怎样促进effector的功能研究的。
使用图位克隆策略克隆从leptosphaeriamaculans中得到了avrlm1、avrlm6和avrlm4-7三个无毒基因，它们编码预测的小的从122到205个氨基酸的分泌蛋白，与公共数据库中的任何蛋白都没有相似性。avrlm6和avrlm4-7分别包含6个和8个半胱氨酸残基，这些半胱氨酸可能在质体外能稳定avrlm6和avrlm4-7蛋白。然而，avrlm1只有一个半胱氨酸残基，考虑到目前为止所有被描述的质体外effector都是富半胱氨酸蛋白，所以avrlm1很可能转运到宿主细胞内。尽管我们很清楚它们有无毒性的活性，但是avrlm识别的机制，相应的rlm抗性基因和它们的作用位点仍然是不清楚的。跟目前克隆到的大多数其它真菌的effector真菌相比，这三个l.maculans基因有着较低的gc含量。它们都是单拷贝基因，位于富at和富转座子的60kb(avrlm4-7)，133kb(avrlm6)，269kb(avrlm1)的类异染色质区域。这些effector定位在独特的基因组环境中，是真菌有条件的独立于染色体，plasmodium的亚端粒区域，或者在p.infestans中基因稀有区域的遗迹，这被认为能够加快基因进化并加速病原体对宿主的适应性。
丝状植物病原菌已经进化出了具有抑制蛋白酶活性以保护几种宿主水解酶活性的effector蛋白。寄主专化性毒素(hst)是具有化学多样性的effector分子，它是由植物致病真菌产生的作为毒性因子发挥功能。这些致病性决定因子只有在对产生这种毒素的病原菌敏感的宿主植物中才有活性。有趣的是，好几种蛋白质hst，比如腐质营养真菌物种pyrenophoratritici-repentis和stagonosporanodorum的ptrtoxa，sntox1，sntox2和sntox4都表现出光依赖模式的坏死诱导并促进了毒素敏感性的宿主小麦植株的感病性。这些effector发挥功能所必须的，相应的显性的宿主基因tsn1，snn1，snn2，snn4被绘制在毒素敏感宿主的染色体图谱上，并且这些基因的产物被认为是跟hst直接或间接相互作用的受体。值得注意的是，在hst中表现出与基因对基因不同的相互作用，在hst中受体分子是必须的而不是在经典的无毒-抗性基因相互作用中的抗性。ptrtoxa是在p.triticirepentis和s.nodorum的hst中研究的最透彻的，它有一个含n-端分泌信号的模块结构，分泌信号被切除以形成成熟蛋白，分泌信号后是宿主转运所必须的rgd结构域和一个c-端effector结构域。据报道ptrtoxa定位在叶绿体并且跟叶绿体蛋白toxabp1相互作用，一旦它转运到叶绿体中，ptrtoxa就以光依赖的方式，通过干扰光系统ⅰ和光系统ⅱ促进毒力并最终诱导活性氧物质积累。
类nep1蛋白(nlp)是诱导双子叶植物坏死的细菌、真菌和卵菌毒素。尽管它们在不同的分类群中的分布多种多样，nlp具有一个共同的折叠特征，即，有一个七肽(ghrhdwe)基序和两个保守的半胱氨酸，表现出与海洋生物产生的海葵溶细胞素和溶细胞毒素的结构相似性。在半活体营养的卵菌病原体p.sojae和p.infestans中nlp基因(npp1和pinpp1.1)的表达在宿主感染的后期腐质营养阶段是上调的。这些nlp在它们的溶细胞活性作用下可能有助于宿主组织的死亡，并因此在腐质营养病原体生长过程中促进其侵入。尽管现在已经清楚一些nlp作为毒素促进毒力，并不见得这一家族的所有成员在它们的宿主中都有溶细胞毒素的活性。
目前我们仍然不清楚很多effector的生物化学活性以及它们是如何增强病原体的成功生殖的。我们也几乎不知道丝状病原体effector的靶标，特别是转移到宿主细胞内部的effector。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种水稻稻粒黑粉病菌effector基因smut_2965及其应用，本发明从稻粒黑粉病菌中分离克隆出effector基因，并对该基因的功能进行分析，有助于揭示稻粒黑粉病菌小种与水稻品种间特异性互作及其进化的分子机理，进而有效控制稻粒黑粉病的发生。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种水稻稻粒黑粉病菌effector基因smut_2965，其核苷酸序列如seqidno：1所示。
上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno：2所示。
此处应当理解为，在不影响蛋白活性的前提下，本领域技术人员对seqidno：2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。
此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修饰，因此，本发明还包括对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸序列。
本发明还提供一种含有上述基因的载体、含有该载体的宿主细胞。
上述基因的用途为：(1)根据该基因的结构及其功能来设计农药分子靶点；(2)在提高水稻抗病育种中的应用，如将该基因序列连接到任何一种含有荧光蛋白基因的转化载体上，用任何一种转化方法将该effector基因和荧光蛋白基因共价导入水稻或其它植物细胞，利用荧光共聚焦透射电镜可以观察到在水稻或其它植物细胞中与荧光蛋白融合表达的effector蛋白在植物细胞中的迁移及定位，利用此effector为诱饵蛋白钓出水稻或其它植株中与该effector蛋白结合的受体蛋白，利用基因工程方法敲除水稻或其它植物细胞中该受体基因或删除、添加、突变该受体基因的一个或多个碱基以缺失或改变受体基因的功能，得到抗某一effector的抗性植株；(3)根据该基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于snp(单核苷酸多态性)、ssr(简单序列重复多态性)、rflp(限制性内切酶长度多态性)、cap(切割扩增片段多肽)，用这些标记可检测田间稻粒黑粉病群体的生理小种及其遗传结构的动态变化，以及该effector基因在田间自然群体中的分布情况，有助于水稻品种的抗病性鉴定和稻粒黑粉病菌小种的鉴定，也有助于抗病品种的合理布局和轮换，以便有效地控制黑粉病的发生。
本发明提供的水稻稻粒黑粉病菌effector基因smut_2965及其应用，具有以下有益效果：
本发明通过对水稻稻粒黑粉病菌effector基因的克隆及其功能分析，有助于揭示稻粒黑粉病菌小种与水稻品种间特异性互作及其进化的分子机理。在实践上可以根据该基因的结构及其功能设计新型农药的分子靶点；可以将水稻等宿主细胞中该effector蛋白的受体蛋白基因敲除或突变，以得到持久抗病品种；有助于建立稻粒黑粉病菌自然群体致病性变异的分子检测体系，研究稻粒黑粉病菌effector基因在田间自然群体中的分布情况，揭示稻粒黑粉病菌群体中小种的组成和变异特点；也有助于水稻品种的抗病性鉴定及其合理布局和轮换，以便有效地控制稻粒黑粉病菌的发生。
附图说明
图1为稻粒黑粉病菌effector基因smut_2965的pcr扩增检测结果；其中，m为分子量标记，依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1和2分别为smut_2965和smut_5844的pcr产物；泳道3为阴性对照(ddh2o)。
图2为effector基因smut_2965在烟草叶片中瞬时表达，引起过敏性坏死反应结果；其中，左图为smut_2965和阴性对照(空载)注射4天的图片，右图为阳性对照(小鼠凋亡蛋白)和阴性对照(空载)注射4天的图片。
图3为稻粒黑粉病菌effector基因smut_2965表达蛋白的sds-page检测结果图；其中，泳道marker为分子量标记，依次为250kd、150kd、100kd、75kd、50kd、37kd、25kd、15kd；泳道2965-sp为信号肽条带，2965-dmdc为诱导后的蛋白条带，在14kd处出现目的带；泳道bax-dmdc为阳性对照小鼠凋亡蛋白表达条带。
具体实施方式
实施例1
1、effector基因的分离和克隆
将从水稻稻粒黑粉病样本上分离得到的稻粒黑粉病菌菌株接种到psa固体培养基中活化，5天后挑取单菌落于50mlpsa液体培养基中，在28℃，200r/min条件下培养5天，然后用四层纱布过滤收集菌丝，用液氮研磨提取总rna，用oligodt做引物，反转录得到cdna。
根据预测的序列设计引物，引物序列如下：
正向引物：
5′-gacctcgactctagaggatccatgaagtttgccaccctcgc-3′(seqidno：3)；
反向引物：
5′-gtccttgtagtcagaaggcctgtaagagcacttaaggaagctgctg-3′(seqidno：4)。
以cdna为模板进行pcr扩增，pcr反应体系(50μl)：cdna模板2μl，正反引物各2μl，fastpfuflybuffer10μl，2.5mmdntps5μl，fastpfufly高保真酶1μl，ddh2o28μl；pcr扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃后延伸10min。对pcr扩增产物进行电泳检测，如图1所示，所得目的基因的电泳检测没有杂带。
2、effector基因原核表达载体的构建和转化
用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(omega,usa)回收pcr扩增的目的基因片段，根据peasy-blunte1kit说明，把目的基因连接到表达载体peasy-e1上，取2μl的连接产物与50μldh5α感受态细胞(cw0808s,cwbio,北京)混合转化，涂布在含卡那霉素(50mg/l)和利福平(50mg/l)的yep固体培养基中上进行选择性筛选，得到重组质粒，经过测序，基因smut_2965与预测序列完全相同，其基因序列如seqidno：1所示。电转化gv3101感受态细胞，利福平和卡那霉素抗性筛选后，获得携带瞬时表达载体的农杆菌菌株。
3、在本氏烟叶片中瞬时表达
将携带目的基因的农杆菌划线分离单克隆，挑取单克隆置于含有利福平(50mg/l)和卡那霉素(50mg/l)的yep培养液中，于28℃培养16h，离心，收集菌体，mes重悬液[10mmmes(ph5.6),10mmmgcl2和150μm乙酰丁香酮]重悬菌体，将od600调至0.5。然后于室温，黑暗中培养3h，用注射器注射烟草叶片，并观察烟草叶片情况，结果见图2。
由图2可知，阴性对照(不携带任何表达载体的农杆菌菌液)注射后不引起本氏烟叶片的细胞坏死反应，阳性对照(携带小鼠凋亡蛋白bax的农杆菌菌液)和携带目的基因smut_2965的农杆菌菌液注射本氏烟叶片4d后出现明显的细胞坏死反应，说明smut_2965基因能产生致病性反应。
4、在本氏烟叶片中瞬时表达验证
取注射72-96h后的本氏烟叶片200g，用液氮研磨至粉状，加入无菌2mlep管中，加入500ul蛋白提取buffer，涡旋60s，冰欲30min。14000r/min，4℃离心10min，取上清，加入loadingbuffer，100℃水浴5-10min，12000r/min离心1min，取10ul进行sds-page电泳分析。结果见图3，泳道2965-dmdc为效应因子smut_2965表达蛋白条带，泳道bax-dmdc为阳性对照小鼠凋亡蛋白表达条带。
5、effector基因smut_2965的应用
利用本发明提供的smut_2965基因的序列信息，根据该基因的结构及功能设计新型农药的分子靶点；将该基因蛋白产物在水稻中的受体蛋白基因或信号通路中的机遇沉默或敲除掉，以培育抗病品种；根据该基因序列产生的分子标记在田间稻粒黑粉病群体监测中的应用；以及根据监测的结果指导抗病品种合理布局中的应用。
序列表
<110>四川农业大学
<120>一种水稻稻粒黑粉病菌effector基因smut_2965及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>339
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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gtcgagtactctgactacggctacgctccccacctaccctcaccagtacaacctactgct180
ccgacaccaagttctacgagtacccctgaccagcaacggctacactggcggctctcccgg240
ccccgaccgtgtcattactggccaatcttctggcgcattctgcggtgccatcactcacac300
tggagccagcggcaacaactttgtccgatgcaagtacta339
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<212>prt
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gtccttgtagtcagaaggcctgtaagagcacttaaggaagctgctg46