一种S-诱抗素的制备方法与流程

文档序号:15457480发布日期:2018-09-15 01:31

技术领域

本发明涉及一种S-诱抗素的制备方法。



背景技术:

S-诱抗素(天然脱落酸),与生长素、乙烯、赤霉素、细胞分裂素并列为植物五大类天然生长调节剂,是植物体的“抗逆诱导因子”,能够启动植物的抗逆基因,诱导激活植物体内的抗逆免疫系统,提高植物自身对寒冷、干旱、病虫害、盐碱的抗性,通过施用S-诱抗素,可减少化学农药的使用量,在提高农产品品质等许多方面有着重要的生理活性作用和应用价值。

目前,S-诱抗素的制备方法主要有直接提取法、化学合成法、生物发酵法三种。直接提取法是指从植物中直接提取,但由于其植物体中含量较低,该生产方法产量较低,规模较小;化学合成法制备S-诱抗素,其合成的纯度较低,因为化学合成的方式得到的产物是非天然脱落酸和天然脱落酸(S-诱抗素),只有天然脱落酸(S-诱抗素)具有以上的生理活性,化学合成法生产成本极高,所以目前只有日本、美国等发达国家应用于大规模农业生产;生物发酵法制备的S-诱抗素产量高,不会有非天然脱落酸产生,是目前综合较好的S-诱抗素制备方法,然而该方法仍存在一些技术上的问题,例如,现有的发酵过程周期较长,产出的S-诱抗素含量还有待提高,发酵产生的副产物较多,对提取造成了一定的困难,且提取的过程参数不易控制造成大量S-诱抗素的浪费,另外也因为工艺的缺陷和过程参数的控制不易造成最终的S-诱抗素产品纯度不高,只有不到95%,产品质量无法得到提升。



技术实现要素:

有鉴于此,本申请提供一种S-诱抗素的制备方法,能够缩短发酵周期,提高发酵产生S-诱抗素的含量,通过提取精制处理,避免S-诱抗素的浪费,同时提高S-诱抗素的纯度,使最终产品中S-诱抗素的纯度达到95%以上,提升了产品质量。此外,制备工艺条件温和,制备过程环保,有利于S-诱抗素的产业化生产。

为解决以上技术问题,本发明提供的技术方案是一种S-诱抗素的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:

(1)采用能够发酵产生S-诱抗素的菌种经过种子培养、发酵培养得到含有S-诱抗素的发酵液;

(2)将步骤(1)所述含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液;

(3)将步骤(2)所述萃取液经过浓缩结晶、重结晶、干燥得到纯度为95%以上的S-诱抗素成品。

优选的,步骤(1)所述能够发酵产生S-诱抗素的菌种包括灰葡萄孢霉菌。

优选的,步骤(1)中所述发酵培养具体为:维持发酵培养基的pH值在4-7,进行发酵培养。

优选的,步骤(1)所述发酵培养的培养基组分包括大豆蛋白、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、饴糖、蔗糖、麦芽糊精、淀粉、玉米蛋白、棉籽饼粉、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、一水硫酸锰、七水硫酸亚铁、七水硫酸锌、硫酸铵、色拉油中的至少一种。

其中,所述发酵培养的温度为20-35℃,发酵培养的时间为12-25d。

更为优选的,所述维持发酵培养基的pH值在4-7具体为:发酵培养基的pH值低于4时连续补充液态碱;pH值高于7时连续补充发酵培养基料液。

优选的,步骤(2)所述板框过滤前,向所述含有S-诱抗素的发酵液中加入固体NaOH调节pH值至4-7,所述板框过滤中,控制压力0.05-0.5MPa。

优选的,步骤(2)所述膜过滤包括微滤、超滤和纳滤工序。

更为优选的,步骤(2)所述微滤工序具体为:在压力为0.05-0.6MPa,过滤温度不大于60℃的条件下进行微滤。

更为优选的,步骤(2)所述超滤工序具体为:在压力为0.05-1.0MPa,过滤温度不大于60℃的条件下进行超滤。

更为优选的,步骤(2)所述纳滤工序包括一级纳滤和二级纳滤,所述一级纳滤具体为:在压力为0.1-2.0MPa,过滤温度不大于60℃的条件下进行一级纳滤;所述二级纳滤具体为:在压力为0.5-10.0MPa,过滤温度不大于60℃的条件下进行二级纳滤。

优选的,步骤(2)所述萃取中,采用的萃取剂为至少一种选自石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正戊醇、乙醇、丙酮、甲醇,萃取体系的pH值为1-4。

优选的,步骤(3)所述浓缩结晶、重结晶、干燥的温度为40-80℃。

所述S-诱抗素的纯度为以质量百分数计的纯度。

本申请技术方案提供了一种S-诱抗素的制备方法,具体是一种发酵法生产重量百分数为95%以上的S-诱抗素的制备方法,采用发酵法生产S-诱抗素,其产量较高,通过从发酵液中提取精制,得到的S-诱抗素产品具有95%以上的纯度。

在上述的本申请技术方案中,步骤(1)中,采用能够发酵产生S-诱抗素的菌种经过种子培养、发酵培养得到含有S-诱抗素的发酵液,其中能够发酵产生S-诱抗素的菌种选自,发酵培养基中,以葡萄糖、乳糖、麦芽糖、饴糖、蔗糖、麦芽糊精、淀粉、大豆蛋白、玉米蛋白、棉籽饼粉中的至少一种作为碳源和氮源,以硫酸铵作为氮源,提高了有益元素的比例,促进菌种发酵,促进S-诱抗素的快速生成;含有的天然油脂色拉油作为碳源,同时使培养基料液黏稠,具有消泡作用,且防止发酵培养过程中受到污染;添加了促进菌种快速繁殖的微量元素锰,以一水硫酸锰的形式进行添加;还添加了七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、七水硫酸锌,增加发酵培养中促进菌种发酵过程的镁元素、铁元素、锌元素,促进S-诱抗素的生成。此外,在发酵培养基中pH值低于4时连续补充补充液态碱;pH值高于7时连续补充发酵培养基料液,使所述发酵培养基的pH值维持在4-7。通过流加液态碱和发酵培养基料液的方式,对发酵培养基的pH值进行微调,既不会改变发酵培养基的成分,也不会对菌种的发酵造成干扰。通过适宜产S-诱抗素菌种的培养基设置,以及培养条件的结合,能够明显缩短发酵周期(从29天缩短至18天),同时提高发酵液中S-诱抗素的含量(从3000ppm提高到8000ppm)。

步骤(2)中,将含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液。其中在板框过滤之前,先加入固体NaOH调节pH值至4-7,起到助滤作用;此外,通过膜过滤对板框过滤后的滤液进一步过滤,该膜过滤包括有依次设置的微滤、超滤和纳滤,在微滤过程中,板框过滤后的滤液中的悬浮颗粒、菌种以及其他大颗粒杂质被滤除;在超滤过程中,微滤后的滤液中的大分子蛋白质、葡萄糖等被滤除;在纳滤过程中,对超滤后的滤液进一步过滤,滤除部分小分子,得到较为纯净的S-诱抗素溶液。控制微滤、超滤以及纳滤过程中的压力,可以提高过滤的效率,同时避免滤液的浪费。经过膜过滤后的溶液通过萃取进行进一步分离,采用石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正戊醇、乙醇、丙酮、甲醇中的至少一种作为萃取剂,控制萃取的体系为pH值为1-4的酸性环境,实现S-诱抗素与油类、酯类物质的分离。通过以上的过滤和萃取工序,提高溶液中S-诱抗素的含量。

步骤(3)中,萃取液经过浓缩结晶、重结晶、干燥可以得到重量百分比为95%以上的S-诱抗素成品。在浓缩结晶、重结晶过程中,得到S-诱抗素结晶体,使其与萃取液中的可溶无机盐类分离,提高了其纯度,控制浓缩结晶、重结晶、干燥的温度在40-80℃之间,可以加快浓缩结晶、重结晶、干燥的速度,同时避免对S-诱抗素的结构造成破坏,影响其生理活性。

与现有技术相比,本申请技术方案所述的一种S-诱抗素的制备方法,能够缩短发酵周期,提高发酵产生S-诱抗素的含量,通过提取精制处理,能够进一步提高S-诱抗素的纯度,使最终产品中S-诱抗素的纯度达到95%以上。此外,制备工艺条件温和,制备过程环保,有利于S-诱抗素的产业化生产。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

本申请所述的一种S-诱抗素的制备方法,具体是采用发酵法生产纯度为95%以上的制备方法,包括有以下步骤:

(1)采用能够发酵产生S-诱抗素的菌种经过种子培养、发酵培养得到含有S-诱抗素的发酵液;其中,能够发酵产生S-诱抗素的菌种包括有灰葡萄孢霉菌,发酵培养的培养基组分包括:大豆蛋白、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、饴糖、蔗糖、麦芽糊精、淀粉、玉米蛋白、棉籽饼粉、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、一水硫酸锰、七水硫酸亚铁、七水硫酸锌、硫酸铵、色拉油;所述发酵培养的温度为20-35℃,发酵培养的时间为12-25d。在发酵培养时,发酵培养基中pH值低于4时连续补充液态碱;pH值高于7时连续补充发酵培养基料液,使所述发酵培养基的pH值维持在4-7,其中液态氮源可以为氨水。

(2)将步骤(1)所述含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液,其中,板框过滤前,向所述含有S-诱抗素的发酵液中加入固体NaOH调节pH值至4-7,所述板框过滤中,控制压力0.05-0.5MPa;膜过滤包括有依次设置的微滤、超滤和纳滤工序,在微滤工序中,压力为0.05-0.6MPa,过滤温度不大于60℃;在超滤工序中,压力为0.05-1.0MPa,过滤温度不大于60℃;纳滤工序包括一级纳滤和二级纳滤,所述一级纳滤中,压力为0.1-2.0MPa,过滤温度不大于60℃;所述二级纳滤中,压力为0.5-10.0MPa,过滤温度不大于60℃。在萃取过程中,萃取剂为至少一种选自石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、正戊醇、乙醇、丙酮、甲醇,萃取体系的pH值为1-4。

(3)将步骤(2)所述萃取液经过40-80℃温度下的浓缩结晶、重结晶、干燥得到所述S-诱抗素成品。

为了验证本申请技术方案的技术效果,在上述具体实施方式要求的基础上,采用具体参数进行试验验证,得到以下具体实施例。

实施例1

发酵培养基对发酵周期及S-诱抗素产量的影响

制备方法为:

(1)将灰葡萄孢霉菌(Botrytis Cinerea-Cercospoxa Rosicola FD338,简称B.C.FD338)经过种子培养、发酵培养得到含有S-诱抗素的发酵液。

其中,发酵培养的培养基组成以及发酵周期如表1所示。发酵温度为20~35℃。

在发酵培养基中pH值低于4时连续补充补充氨水;pH值高于7时连续补充发酵培养基料液,使所述发酵培养基的pH值维持在4.5。

(2)将步骤(1)得到的含有S-诱抗素的发酵液经板框过滤、膜过滤、酸析、萃取得到萃取液。

其中在板框过滤之前,先在含有S-诱抗素的发酵液中加入固体NaOH调节pH值至5.5后进行过滤。

然后上述调节了pH值的发酵液经过板框过滤,控制过滤压力为0.5MPa,过滤效率为5L/min,得到滤液。

将上述滤液进行膜过滤,其中,膜过滤包括有依次设置的微滤、超滤和纳滤;

在微滤过程中,板框过滤后的滤液中的悬浮颗粒、菌种以及其他大颗粒杂质被滤除;微滤的压力为0.6MPa,过滤效率为4L/min,微滤膜的孔径为50nm;

在超滤过程中,微滤后的滤液中的大分子蛋白质、葡萄糖等被滤除;超滤的压力为0.7MPa,过滤效率为3L/min,超滤膜的孔径为20000D;

在纳滤过程中,对超滤后的滤液进一步过滤,滤除部分小分子,得到较为纯净的S-诱抗素溶液;其中,纳滤分为两级,分别为一级纳滤和二级纳滤;一级纳滤的压力为2MPa,过滤效率为3.2L/min,一级纳滤和二级纳滤的孔径为100D;

经过膜过滤后的滤液通过萃取进行进一步分离,萃取剂选用乙酸乙酯,并控制萃取体系的pH值为3.0,实现S-诱抗素与油类、酯类物质的分离,得到含有S-诱抗素的萃取液。

(3)将上述得到的含有S-诱抗素的萃取液经过浓缩结晶、重结晶、干燥可以得到重量百分比为95%以上的S-诱抗素成品。

其中,浓缩结晶的温度为40℃,浓缩结晶的时间为45min;

重结晶的温度为40℃,浓缩结晶的时间为50min;

干燥的温度为40℃,干燥的时间为4.5小时。

采用单因素实验方法,在其他条件均一致的情况下,采用不同组分发酵培养基,采用上述制备方法进行S-诱抗素的制备,结果见表1。

表1发酵培养基对发酵周期及S-诱抗素产量的影响结果

实施例2

发酵培养基pH值调节方式对发酵周期及S-诱抗素产量的影响

采用单因素实验方法,按照实施例1提供的制备方法进行S-诱抗素的制备,发酵培养基选用实施例1的表1中试验C的培养基,在其他条件均一致的情况下,仅改变pH调节方式(对应表2中的试验2~试验4),采用不同发酵培养基pH值调节方式,结果见表2。

表2发酵培养基pH值调节方式对发酵周期及S-诱抗素产量的影响

实施例3

发酵培养基pH值对发酵周期及S-诱抗素产量的影响

采用单因素实验方法,按照实施例1提供的制备方法进行S-诱抗素的制备,发酵培养基选用实施例1的表1中试验C的培养基,在其他条件均一致的情况下,仅改变发酵培养基的pH值,采用不同发酵培养基pH值,结果见表3。

表3发酵培养基pH值对发酵周期及S-诱抗素产量的影响

实施例4

发酵液pH值对板框过滤效果的影响

采用单因素实验方法,按照实施例1提供的制备方法进行S-诱抗素的制备,发酵培养基选用实施例1的表1中试验C的培养基,在其他条件均一致的情况下,在板框过滤前,改变发酵液pH值,采用不同的发酵液pH值,结果见表4。

表4发酵液pH值对板框过滤效果的影响

备注:本次实验发酵液重量为50L,含量为8000ppm。

实施例5

板框过滤参数对板框过滤效果的影响

采用单因素实验方法,按照实施例1提供的制备方法进行S-诱抗素的制备,发酵培养基选用实施例1的表1中试验C的培养基,在其他条件均一致的情况下,改变板框过滤参数,采用不同的板框过滤参数进行过滤,结果见表5。

表5板框过滤参数对板框过滤效果的影响

备注:本次实验发酵液重量为50L,含量为8000ppm。

实施例6

膜过滤参数对膜过滤效果的影响

采用单因素实验方法,按照实施例1提供的制备方法进行S-诱抗素的制备,发酵培养基选用实施例1的表1中试验C的培养基,在其他条件均一致的情况下,改变膜过滤参数,采用不同的膜过滤参数进行过滤,结果见表6。

表6膜过滤参数对膜过滤效果的影响

备注:本次实验所用板框滤液、微滤清液、超滤清液、一级纳滤残液重量分别为100L、90L、80L、70L。

实施例7

萃取剂组分对萃取效果的影响

采用单因素实验方法,按照实施例1提供的制备方法进行S-诱抗素的制备,发酵培养基选用实施例1的表1中试验C的培养基,在其他条件均一致的情况下,改变萃取剂种类,采用不同的萃取剂对滤液进行萃取,结果见表7。

表7萃取剂组分对萃取效果的影响

备注:本实验所用浓缩液含量为20000ppm。

实施例8

萃取体系pH值对萃取效果的影响

采用单因素实验方法,按照实施例1提供的制备方法进行S-诱抗素的制备,发酵培养基选用实施例1的表1中试验C的培养基,在其他条件均一致的情况下,改变萃取体系pH值,采用不同的萃取体系pH值对滤液进行萃取,结果见表8。

表8萃取体系pH值对萃取效果的影响

备注:本实验所用浓缩液含量为20000ppm。

实施例9

浓缩结晶、重结晶、干燥温度对S-诱抗素纯度的影响

采用单因素实验方法,按照实施例1提供的制备方法进行S-诱抗素的制备,发酵培养基选用实施例1的表1中试验C的培养基,在其他条件均一致的情况下,采用不同的浓缩结晶、重结晶、干燥温度,结果见表9。

表9浓缩结晶、重结晶、干燥温度对S-诱抗素纯度的影响结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1