本发明涉及海洋生物酶解技术领域，特别涉及小分子鱼皮多肽的制备方法。
背景技术：
我国地大物博，水域辽阔，水产资源十分丰富，近几年来，随着生活水平的提高，人们对水产资源需求的多样性及实用性逐渐提高，从而促进我国水产加工业的飞速发展。但是，在水产加工业高速发展的同时会产生大量的鱼下脚料，例如鱼皮、鱼鳞、内脏、鱼头等，这些下脚料约占原料鱼的40-50%，除了少量用来生产鱼粉和鱼饲料，大部分都被丢弃，不仅造成了资源极大的浪费，而且还会造成环境污染。因此，如何能够高效利用鱼下脚料中的营养活性物质已经引起国内外科研工作者的高度重视，其中主要的废弃物鱼皮中的胶原含量相当丰富，胶原蛋白可以占到蛋白质总含量的60-80%，而占鱼皮湿重的18%，将其作为新型的胶原蛋白资源，具有很高的开发和利用价值。
胶原多肽是指以胶原组织为原料，通过深度水解获得的具有特殊功能的低分子量的生物活性肽，胶原多肽分子量小，与胶原蛋白相比，胶原多肽更易被人体吸收，吸收率约95%以上，而胶原蛋白的吸收率只有25%。胶原蛋白多肽的亲水基团较多，因此水溶性更好，利用降解手段切断胶原蛋白的肽键，使功能性的片断显露出来，使得胶原多肽具有一定的生物活性，因此可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域中。
现有技术如授权公告号为cn103805665b的中国发明专利，公开了一种深海鱼皮胶原多肽的制备方法，该制备方法将胶原蛋白液粗品在温度55℃下加入复合蛋白酶进行酶解，酶解过程中多次用超滤膜过滤，然后将酶解液用复合活性炭采用分次吸附法脱色去腥后，纳滤，干燥，得粉末状胶原多肽，该制备方法采用酶解和超滤分离联用工艺，做到真正的人为控制反应，使产品的分子量可控、分子量分布合理，从而产品的各种理化性质更好。但是，该制备方法的不足之处是所制备的鱼皮多肽纯度较差，且脱色去腥过程中蛋白损失率较高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种工艺简单，酶解效率高，反应周期短，便于工业化的小分子鱼皮多肽的制备方法，所得小分子鱼皮多肽得率和纯度高，感官品质良好，呈乳白色粉末状固体，无色无味无杂。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
小分子鱼皮多肽的制备方法，包括鱼皮预处理、酶水解、水解液脱色脱腥、鱼皮多肽水解液纯化，具体制备步骤如下：
鱼皮预处理：将鱼皮置于冰水中清洗、剪碎，然后将其置于含有脱脂剂的溶液中，在转速为180-200rpm下连续搅拌，控制料液比为1:20-25，脱脂时间36-40h，脱脂温度8-12℃，之后将脱脂后的鱼皮用0.05-0.1mol/l的naoh溶液浸泡30-50min，除去杂质以及一些非胶原蛋白，最后用水将浸泡过的鱼皮反复清洗至中性，沥干水分待用，对鱼皮进行预处理可以将包裹在胶原蛋白纤维周围的脂肪以及诸如球蛋白、角蛋白等非胶原性蛋白质去除，便于后续的提取分离工作，有利于提高鱼皮多肽的纯度和色泽；
酶水解：将经过预处理的鱼皮与浸泡剂按照重量配比为1:4-6溶胀30-50min，用水反复清洗鱼皮至中性，沥干水分后，用组织捣碎机将溶胀好的鱼皮匀浆破碎，使用鱼皮匀浆重量8-10倍的蒸馏水混合均匀，然后添加80-100g/l复合酶进行酶解，连续搅拌酶解液4-6h，控制酶解温度50-65℃，调节ph为7.5-10，酶解结束后，沸水浴灭酶活5-10min，冷却至室温后在3500-4000rpm条件下离心10-15min，所得上清液即为鱼皮多肽水解液，使用复合酶对鱼皮的胶原蛋白进行酶解，可将胶原蛋白三螺旋结构完全打开，使肽链变成分子质量在几千道尔顿的短肽链，在胶原蛋白降解成胶原多肽的过程中，内部疏水基团的暴露和可电离基团数目的增多，使得胶原多肽的亲水性和静电荷数量增加，再加上多肽链的减少和分子质量的降低，使得胶原多肽具有高溶解、低渗透压、稳定性好、乳化性强等优异的理化特性；
水解液脱色脱腥：将小分子鱼皮多肽水解液稀释10-15倍，加入脱色脱腥助剂，调节ph为4.0-5.0，在35-40℃下处理40-50min，结束后用双层滤纸过滤，得到脱色脱腥后的鱼皮多肽水解液，使用脱色脱腥助剂通过物理吸附和生化作用将鱼皮多肽水解液中的有色、带腥味的物质去除，大大提高了鱼皮多肽水解液的色泽和口感；
鱼皮多肽水解液纯化：先将脱色脱腥后的鱼皮多肽水解液在50-60℃条件旋转蒸发浓缩，抽滤过0.22μm微孔滤膜除去杂质，然后在电泵作用下过2000da超滤膜进行脱盐处理，旋转蒸发浓缩，最后低温冷冻，真空干燥得到小分子鱼皮多肽成品，所制备的小分子鱼皮多肽成品感官品质良好，呈乳白色粉末状固体，无色无味无杂，分子量小，理化性质稳定，可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域中。
作为优选，鱼皮预处理过程中脱脂剂为体积比为1:1-3的异丙醇和乙醚的混合液，异丙醇和乙醚配合使用，可有效将将包裹在胶原蛋白纤维周围的脂肪去除，便于后续的提取分离工作，同时也可提高胶原多肽水解液的色泽、透明度亲水性能。
作为优选，鱼皮预处理过程中naoh溶液的浓度为0.05-0.1mol/l，naoh可将鱼皮中的球蛋白、角蛋白等杂蛋白质去除，有利于提高鱼皮多肽的纯度。
作为优选，酶水解过程中使用的浸泡剂为重量配比为1:0.3-0.6的0.5-0.8mol/l冰乙酸溶液和2-琉基腺苷的混合物，2-琉基腺苷在冰乙酸的配合下，可快速向鱼皮胶原蛋白中渗透，通过影响羟脯氨酸上的活性基团使胶原蛋白三螺旋空间结构发生解旋，分子结构变得松散，酶结合位点增多，有利于之后酶解过程中酶与底物的结合，可有效提高酶解率，得到多肽含量高的水解液，且多肽的分子量较小，理化性质优异。
作为优选，酶水解过程中复合酶为重量配比为1:0.6-0.9木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的水解能力强，但是酶切位点少，切下的肽段大小不均一，导致酶解液经离心后大部分大的肽段被沉淀下来，导致可溶性多肽含量低，而木瓜蛋白酶的作用位点多，能够将胶原蛋白酶解成比较均匀的中等分子肽段，可溶性多肽含量较多，因此将碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶搭配使用，所得到的鱼皮多肽水解液中多肽分子量低，同时含量较高。
作为优选，水解液脱色脱腥过程中脱色脱腥助剂的原料成分及其重量份为：粉状活性炭3-5份、酵母6-10份、β-d-酚酞葡萄糖苷酸1-2份，β-d-酚酞葡萄糖苷酸的添加一方面可影响酵母的生长和代谢，激发代谢生成酶的活性，加强对鱼皮多肽水解液中以羰基化合物和醇类物质为主的腥味物质的转化利用，达到水解液脱腥的目的，另一方面β-d-酚酞葡萄糖苷酸可作用于胶原蛋白三螺旋肽链解旋时所暴露出的有色、带苦味的疏水氨基酸，通过范德华力和疏水作用力与这些氨基酸的活性基团包合，以去除水解液的腥苦味，因此，在活性炭和酵母的基础上添加β-d-酚酞葡萄糖苷酸，可有效对鱼皮多肽水解液进行脱色脱腥处理，且蛋白损失率较低，可制备出无色无味，感官品质良好的鱼皮多肽，进一步提高其商业应用价值。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明小分子鱼皮多肽的制备方法工艺简单，酶解效率高，反应周期短，便于工业化；2）本发明小分子鱼皮多肽得率和纯度高，具有高溶解、低渗透压、稳定性好、乳化性强等优异的理化特性；3）本发明小分子鱼皮多肽感官品质良好，呈乳白色粉末状固体，无色无味无杂，可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域中。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
小分子鱼皮多肽的制备方法，包括鱼皮预处理、酶水解、水解液脱色脱腥、鱼皮多肽水解液纯化，具体制备步骤如下：
1）鱼皮预处理：将鱼皮置于冰水中清洗、剪碎，然后将其置于含有脱脂剂的溶液中，在转速为180rpm下连续搅拌，控制料液比为1:20，脱脂时间40h，脱脂温度8℃，之后将脱脂后的鱼皮用naoh溶液浸泡30min，除去杂质以及一些非胶原蛋白，最后用水将浸泡过的鱼皮反复清洗至中性，沥干水分待用，对鱼皮进行预处理可以将包裹在胶原蛋白纤维周围的脂肪以及诸如球蛋白、角蛋白等非胶原性蛋白质去除，便于后续的提取分离工作，有利于提高鱼皮多肽的纯度和色泽；
2）酶水解：将经过预处理的鱼皮与浸泡剂按照重量配比为1:4溶胀30min，用水反复清洗鱼皮至中性，沥干水分后，用组织捣碎机将溶胀好的鱼皮匀浆破碎，使用鱼皮匀浆重量8倍的蒸馏水混合均匀，然后添加80g/l复合酶进行酶解，连续搅拌酶解液4h，控制酶解温度60℃，调节ph为7.5，酶解结束后，沸水浴灭酶活5min，冷却至室温后在4000rpm条件下离心10min，所得上清液即为鱼皮多肽水解液，使用复合酶对鱼皮的胶原蛋白进行酶解，可将胶原蛋白三螺旋结构完全打开，使肽链变成分子质量在几千道尔顿的短肽链，在胶原蛋白降解成胶原多肽的过程中，内部疏水基团的暴露和可电离基团数目的增多，使得胶原多肽的亲水性和静电荷数量增加，再加上多肽链的减少和分子质量的降低，使得胶原多肽具有高溶解、低渗透压、稳定性好、乳化性强等优异的理化特性；
3）水解液脱色脱腥：将小分子鱼皮多肽水解液稀释10倍，加入脱色脱腥助剂，调节ph为4.0，在40℃下处理50min，结束后用双层滤纸过滤，得到脱色脱腥后的鱼皮多肽水解液，使用脱色脱腥助剂通过物理吸附和生化作用将鱼皮多肽水解液中的有色、带腥味的物质去除，大大提高了鱼皮多肽水解液的色泽和口感；
4）鱼皮多肽水解液纯化：先将脱色脱腥后的鱼皮多肽水解液在50℃条件旋转蒸发浓缩，抽滤过0.22μm微孔滤膜除去杂质，然后在电泵作用下过2000da超滤膜进行脱盐处理，旋转蒸发浓缩，最后低温冷冻，真空干燥得到小分子鱼皮多肽成品，所制备的小分子鱼皮多肽感官品质良好，呈乳白色粉末状固体，无色无味无杂，分子量小，理化性质稳定，可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品中等领域中。
上述鱼皮预处理过程中脱脂剂为体积比为1:1的异丙醇和乙醚的混合溶液，异丙醇和乙醚配合使用，可有效将将包裹在胶原蛋白纤维周围的脂肪去除，便于后续的提取分离工作，同时也可提高胶原多肽水解液的色泽、透明度亲水性能。
上述鱼皮预处理过程中naoh溶液的浓度为0.05mol/l，naoh可将鱼皮中的球蛋白、角蛋白等杂蛋白质去除，有利于提高鱼皮多肽的纯度。
上述酶水解过程中使用的浸泡剂为重量配比为1:0.4的0.5mol/l冰乙酸溶液和2-琉基腺苷的混合物，2-琉基腺苷在冰乙酸的配合下，可快速向鱼皮胶原蛋白中渗透，通过影响羟脯氨酸上的活性基团使胶原蛋白三螺旋空间结构发生解旋，分子结构变得松散，酶结合位点增多，有利于之后酶解过程中酶与底物的结合，可有效提高酶解度，得到多肽含量高的水解液，且多肽的分子量较小，理化性质优异。
上述酶水解过程中复合酶为重量配比为1:0.6木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的水解能力强，但是酶切位点少，切下的肽段大小不均一，导致酶解液经离心后大部分大的肽段被沉淀下来，导致可溶性多肽含量低，而木瓜蛋白酶的作用位点多，能够将胶原蛋白酶解成比较均匀的中等分子肽段，可溶性多肽含量较多，因此将碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶搭配使用，所得到的鱼皮多肽水解液中多肽分子量低，同时含量较高。
上述水解液脱色脱腥过程中脱色脱腥助剂的原料成分及其重量份为：粉状活性炭3份、酵母8份、β-d-酚酞葡萄糖苷酸1份，β-d-酚酞葡萄糖苷酸的添加一方面可影响酵母的生长和代谢，激发代谢生成酶的活性，加强对鱼皮多肽水解液以羰基化合物和醇类物质为主的腥味物质的转化利用，达到水解液脱腥的目的，另一方面β-d-酚酞葡萄糖苷酸可作用于胶原蛋白三螺旋空间打开所暴露出的有色、带苦味的疏水氨基酸，通过范德华力和疏水作用力与这些氨基酸的活性基团包合，以去除水解液的腥苦味，因此，在活性炭和酵母的基础上添加β-d-酚酞葡萄糖苷酸，可有效对除鱼皮多肽水解液进行脱色脱腥处理，且蛋白损失率较低，可制备无色无味，感官品质良好的鱼皮多肽，提高其商业应用价值。
实施例2：
小分子鱼皮多肽的制备方法，包括鱼皮预处理、酶水解、水解液脱色脱腥、鱼皮多肽水解液纯化，具体制备步骤如下：
1）鱼皮预处理：将鱼皮置于冰水中清洗、剪碎，然后将其置于体积比为1:2的异丙醇和乙醚的混合溶液中，在转速为200rpm下连续搅拌，控制料液比为1:20，脱脂时间36h，脱脂温度10℃，之后将脱脂后的鱼皮用浓度0.08mol/l为naoh溶液浸泡30min；
2）酶水解：将经过预处理的鱼皮与浸泡剂按照重量配比为1:5溶胀40min，用水反复清洗鱼皮至中性，沥干水分后，用组织捣碎机将溶胀好的鱼皮匀浆破碎，使用鱼皮匀浆重量10倍的蒸馏水混合均匀，然后添加100g/l复合酶进行酶解，连续搅拌酶解液6h，控制酶解温度65℃，调节ph为8.5，酶解结束后，沸水浴灭酶活8min，冷却至室温后在4000rpm条件下离心15min，所得上清液即为鱼皮多肽水解液；
3）水解液脱色脱腥：将小分子鱼皮多肽水解液稀释10倍，加入脱色脱腥助剂，调节ph为4.5，在40℃下处理50min，结束后用双层滤纸过滤，得到脱色脱腥后的鱼皮多肽水解液；
4）鱼皮多肽水解液纯化：先将脱色脱腥后的鱼皮多肽水解液在60℃条件旋转蒸发浓缩，抽滤过0.22μm微孔滤膜除去杂质，然后在电泵作用下过2000da超滤膜进行脱盐处理，旋转蒸发浓缩，最后低温冷冻，真空干燥得到小分子鱼皮多肽成品。
上述酶水解过程中使用的浸泡剂为重量配比为1:0.6的0.8mol/l冰乙酸溶液和2-琉基腺苷的混合物。
上述酶水解过程中复合酶为重量配比为1:0.7的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。
上述水解液脱色脱腥过程中脱色脱腥助剂的原料成分及其重量份为：粉状活性炭5份、酵母6份、β-d-酚酞葡萄糖苷酸2份。
实施例3：
小分子鱼皮多肽的制备方法，包括鱼皮预处理、酶水解、水解液脱色脱腥、鱼皮多肽水解液纯化，具体制备步骤如下：
1）鱼皮预处理：将鱼皮置于冰水中清洗、剪碎，然后将其置于含有脱脂剂的溶液中，在转速为200rpm下连续搅拌，控制料液比为1:20，脱脂时间40h，脱脂温度12℃，之后将脱脂后的鱼皮用0.1mol/l的naoh溶液浸泡40min；
2）酶水解：将经过预处理的鱼皮与浸泡剂按照重量配比为1:6溶胀30min，用水反复清洗鱼皮至中性，沥干水分后，用组织捣碎机将溶胀好的鱼皮匀浆破碎，加入鱼皮匀浆重量10倍的蒸馏水混合均匀，然后加入100g/l复合酶进行酶解，连续搅拌酶解液5h，控制酶解温度60℃，调节ph为7.0，酶解结束后，沸水浴灭酶活5min，冷却至室温后在3500rpm条件下离心10min，所得上清液即为鱼皮多肽水解液；
3）水解液脱色脱腥：将小分子鱼皮多肽水解液稀释10倍，加入脱色脱腥助剂，调节ph为4.0，在40℃下处理40min，结束后用双层滤纸过滤，得到脱色脱腥后的鱼皮多肽水解液；
4）鱼皮多肽水解液纯化：先将脱色脱腥后的鱼皮多肽水解液在60℃条件旋转蒸发浓缩，抽滤过0.22μm微孔滤膜除去杂质，然后在电泵作用下过2000da超滤膜进行脱盐处理，旋转蒸发浓缩，最后低温冷冻，真空干燥得到小分子鱼皮多肽成品。
上述鱼皮预处理过程中脱脂剂为体积比为1:3的异丙醇和乙醚的混合溶液。
上述酶水解过程中使用的浸泡剂为0.6mol/l冰乙酸溶液和2-琉基腺苷的混合物，其重量配比为1:0.6。
上述酶水解过程中复合酶为重量配比为1:0.9的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶。
上述水解液脱色脱腥过程中脱色脱腥助剂的原料及其重量份为粉状活性炭5份、酵母9份、β-d-酚酞葡萄糖苷酸2份。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。