本发明涉及一种干细胞的培养方法，特别涉及利用自体骨髓及相关细胞因子构建cd90+cd105+细胞扩增的优势环境，获得具高纯度、高效治疗溃疡性结肠炎能力的细胞亚群(cd90+cd105+)的培养方法。
背景技术：
骨髓的间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，在特定的条件下，能诱导分化形成多种非造血组织细胞(如成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等)。骨髓间充质干细胞能够随血液循环到达肠道，并定植于肠组织中，对受损的肠组织起到修复作用。
技术实现要素：
针对上述现有技术，为了弥补溃疡性结肠炎细胞治疗中干细胞含量低的不足，本发明利用自体骨髓及相关因子构建(cd90+cd105+)细胞扩增的优势环境，提供了一种步骤简单、操作稳定的体外扩增培养干细胞、获得具有高效治疗溃疡性结肠炎能力的细胞亚群(cd90+cd105+)的培养方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种获得具有溃疡性结肠炎治疗作用的细胞亚群(cd90+cd105+)的培养方法，以自体骨髓为处理对象，包括以下步骤：
(1)从成人骨髓中分离出单个核细胞，进行培养、扩增；
(2)将培养的单个核细胞进行细胞因子活化刺激；
(3)根据细胞生长情况，进行扩增传代操作，20天后进行流式检测细胞表型。
优选的，所述步骤(1)的主要操作为：
①将采血袋或采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，抽取血袋或采血管中的骨髓分装到50ml离心管中，每管骨髓30ml，经800g下离心10min；
②离心后，将上层清液置于一支新的50ml离心管中。吸至距分界面0.5cm处为止，若剩余骨髓细胞多于15ml，则取上层15ml骨髓细胞置于新的离心管中，弃去底部剩余细胞；
③用生理盐水按照1∶1的比例稀释细胞，取装有15mlficoll的离心管并倾斜，缓慢的将混匀的骨髓细胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，样本与ficoll的比例不超过2∶1，于常温低升降速，500g下离心20min；
④离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，500g下离心10min；
⑤离心后弃上清，细胞沉淀先用10ml生理盐水重悬，再加生理盐水至40ml，混匀，取样用于细胞数量检测、细胞亚群含量检测，500g下离心10min；
⑥离心后弃上清，用淋巴细胞无血清培养基将细胞密度调整为1-2×106/ml。
优选的，所述步骤(2)的主要操作为：
①用淋巴细胞无血清培养基将细胞密度调整为1-2×106/ml，加入到培养瓶中，37℃、5.0％co2浓度培养箱中培养；
②将步骤(1)收集的标本置于56℃，30min后，放入-20℃，10min，最终3000rpm，10min收集血清，制取获得血清添加物；
③加入表皮生长因子，终浓度为1000iu/ml，添加自体血清添加物浓度为5％，放入37℃，5.0％co2培养箱培养；
④24h后，更换培养基。
优选的，所述步骤(3)的主要操作为：
①根据细胞的生长情况，进行补液操作，使细胞生长密度保持在1-2×107/ml；
②20天后，细胞数量检测、细胞亚群含量检测。
本发明在现有细胞治疗细胞培养模式的基础上，发明了一种体外扩增培养单个核细胞，获得具有高效治疗溃疡性结肠炎能力的细胞亚群(cd90+cd105+)的培养方法。
本发明取30-60ml骨髓进行单个核细胞分离，采用独特的无血清培养基、自体血清添加物和细胞因子组合下进行干细胞的培养，记录干细胞的增殖能力、检测细胞的亚群含量。本发明能够解决未经培养的干细胞中msc比例低、增殖能力低的限制、扩增受限等问题，获得具有高比例高效治疗溃疡性结肠炎能力的细胞亚群(cd90+cd105+)。
本发明中一些常用的术语说明如下：
msc：间充质干细胞。
mnc：单个核细胞。
附图说明
图1：培养三天的干细胞(100×)示意图。
图2：传代后的干细胞(100×)示意图。
图3：培养20天后干细胞(100×)示意图。
图4：培养20天后流式结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1：从骨髓中获取单个核细胞，并进行细胞亚群含量检测
①将采血袋或采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，抽取血袋或采血管中的骨髓分装到50ml离心管中，每管骨髓30ml，经800g下离心10min；
②离心后，将上层血浆置于一支新的50ml离心管中。吸至距分界面0.5cm处为止，若剩余血细胞多于15ml，则取上层15ml血细胞置于新的离心管中，弃去底部剩余红细胞；
③用生理盐水按照1∶1的比例稀释白细胞，取装有15mlficoll的离心管并倾斜，缓慢的将混匀的血细胞加到ficoll液面上，使其呈清晰的界面，血样与ficoll的比例不超过2∶1，于常温低升降速，500g下离心20min；
④离心后液面将分为4层，从底部分别为红细胞、ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀，500g下离心10min；
⑤离心后弃上清，细胞沉淀先用10ml生理盐水重悬，再加生理盐水至40ml，混匀，取样用于细胞数量检测、细胞亚群含量检测，500g下离心10min；
⑥离心后弃上清，用淋巴细胞无血清培养基将细胞密度调整为1-2×106/ml。
实施例2：将培养的单个核细胞进行细胞因子活化刺激
①用淋巴细胞无血清培养基将细胞密度调整为1-2×106/ml，加入到培养瓶中，37℃、5.0％co2浓度培养箱中培养；
②将步骤(1)收集的血浆置于56℃，30min后，放入-20℃，10min，最终3000rpm，10min收集血清；
③加入表皮生长因子，终浓度为1000iu/ml，添加自体血清添加物浓度为5％，放入37℃，5.0％co2培养箱培养。
实施例3：根据细胞生长情况，进行传代操作
培养第4天，添加50ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物。
培养第5天，添加100ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物。
培养第6天，添加200ml扩增用培养基，并按照所添加培养基体积5％的剂量添加自体血清添加物。
培养第8天，添加400ml扩增用培养基，不再添加血清添加物。
培养第10天，添加800ml扩增用培养基。
培养第12天，添加400ml扩增用培养基。
培养第14天，收获细胞，进行细胞数量检测、细胞亚群含量检测。
培养三天的干细胞示意图如图1所示。传代后的干细胞示意图如图2所示。培养20天后干细胞示意图如图3所示。培养20天后流式结果示意图如图4所示。
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给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。