本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种利用小泛素相关修饰物sumo体外表达绵羊β-防御素的方法及绵羊β-防御素。
背景技术：
：近几年来细菌的耐药性问题已日趋严重,使得对抗生素的要求也越来越高,然而抗生素的研究却无法赶上细菌耐药性的发展速度｡因此需要我们另辟蹊径｡在动植物机体内有一类庞大的内源性抗微生物多肽,简称抗菌肽｡抗菌肽是构成先天性免疫的重要组成物质,它有广谱高效杀菌(包括真菌)活性:对g-､g+､霉菌､厌氧菌､螺旋体､分支杆菌等均有较强的杀伤作用,同时对病毒,寄生虫,肿瘤等有明显的作用,特别是对癌细胞的抑杀作用｡对癌细胞和癌实体瘤有攻击作用而不破坏正常细胞｡同时有的抗菌肽还有促进伤口愈合,促生长,调节免疫,提高抗体效价｡动物防御素是动物体内一种以含有β-折叠和6个半胱氨酸形成的3对二硫键框架的抗菌肽｡依其3对二硫键形成的方式的不同,防御素可分为,α-防御素､β-防御素和θ-防御素｡而β-防御素就是其中的一种｡β-防御素是一种含有6个半胱氨酸残基,前原肽由64个氨基酸构成的一种阳离子多肽｡主要存在于动物的上皮组织中｡防御素的成熟肽形式其分子量为3.5~6kda，富含精氨酸和阳离子｡它可以对革兰氏阳性菌､革兰氏阴性菌和病毒等产生抑制作用｡动物β-防御素是带正电荷的,具有两性的(亲水性和疏水性）结构。此结构使得动物β-防御素与生物膜相互作用的方式为，阳离子域接近生物膜的带负电的磷脂凸起，而与此同时动物β-防御素的疏水部分被隐藏于由疏水链脂肪酸组成的膜的内部,从而使细胞膜表面形成孔洞，细菌内外离子浓度相同，导致细菌死亡。小泛素相关修饰物sumo（mallubiquitin-relatedmodifier，sumo）是由约100个氨基酸组成的保守多肽家族，为融合标签和分子伴侣可提高重组蛋白的可溶性和稳定性，利于重组蛋白的正确折叠。sumo是一种与泛素化修饰类似的蛋白质翻译后的修饰方式，在调控蛋白质结构和功能方面发挥重要作用，蛋白质纯化奠定了良好的基础。因此，利用sumo融合技术构建表达载体pet-22b-sumo-绵羊β-防御素sbd-1，以及在大肠杆菌中的表达条件，并将其进行优化得到具有生物活性的绵羊β-防御素sbd-1,为下一步代替抗生素提供理论基础,以及对大量生产β-防御素sbd-1提供方法依据。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种利用小泛素相关修饰物sumo体外表达绵羊β-防御素的方法，它利用sumo融合技术构建表达载体pet-22b-sumo-绵羊β-防御素sbd-1,以及在大肠杆菌中的表达条件，并将其进行优化得到具有生物活性的绵羊β-防御素sbd-1,为下一步代替抗生素提供理论基础,以及对大量生产β-防御素sbd-1提供方法依据｡本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用小泛素相关修饰物sumo构建活性绵羊β-防御素sbd-1体外表达的方法，其特征在于：它包括以下步骤：1）、以rt-pcr的方法获得克隆了sbd-1的成熟肽全基因序列；2）、克隆入原核表达载体pet-22b中，构建表达载体pet-22b-sumo-sbd-1；3）、转化dh5α感受态细胞，提出sumo-sbd-1蛋白；4）、转化到bl21(de3)感受态细胞构建表达菌株；5）、再通过诱导表达、超声破碎、蛋白纯化、浓缩、抑菌实验，得到绵羊β-防御素sbd-1目的蛋白。所述sumo-sbd-1成熟肽基因，其核苷酸序列为seqidno.10所示的氨基酸序列。编码绵羊β-防御素sbd-1的基因。含有绵羊β-防御素sbd-1基因的重组质粒。含有绵羊β-防御素sbd-1基因的重组质粒，其为pet-22b-sumo-sbd-1。含有绵羊β-防御素sbd-1基因的重组质粒转化的宿主细胞。含有绵羊β-防御素sbd-1基因的重组载体转化的宿主细胞为大肠杆菌dh5α。含有绵羊β-防御素sbd-1基因的重组载体转化的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。一种利用权利要求1所述类弹性蛋白sumo构建活性绵羊β-防御素sbd-1体外表达的方法获得的绵羊β-防御素sbd-1在抗生素中的应用。本发明的有益效果是：1、抗菌肽是构成先天性免疫的重要组成物质，利于sumo融合技术成功构建原核表达载体pet-22b-sumo-sbd-1，sumo的优点是由100左右个氨基酸构成的保守多肽家族，实际大小仅为11.5kda，作为标签来促进目的蛋白正确折叠，可以有效的提高蛋白产量，可以更好的纯化得到蛋白，sumo作为标签，它近似于包括了融合标全部的优点，并且它可以与ulp蛋白酶高效且特异性结合，容易去除，更加有利于重组蛋白的纯化。2、蛋白水解作用对维持胞内稳态有重要意义，它会将目的蛋白移位到细胞核附近，避免目的蛋白的降解，提高重组蛋白表达量，促进蛋白折叠，便于重组蛋白纯化和检测。3、利于sumo融合技术成功构建原核表达载体pet-22b-sumo-sbd-1后，为成功体外表达绵羊β-防御素提供了方向。附图说明图1是本发明的流程图。图2是制备得到的绵羊β-防御素sbd-1。图3是提取绵羊十二指肠组织的总rna，经琼脂糖凝胶电泳检查结果图，结果为清晰的、无拖尾的两条带。图4是rtpcr扩增sbd-1，产物凝胶电泳检测结果图，为约112bp的单一条带。图5是双酶切鉴定结果图；图6是经测序重组sumo-sbd-1基因的编码序列。图7是冻干后蛋白纯化结果图。图8是融合蛋白进行westernblot鉴定结果图。图9是大肠杆菌抑菌试验结果图。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，采购明细如下，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。健康蒙古绵羊，经过动物宰杀后，取十二指肠组织备用。名称公司反转录酶rtase、extaqdna聚合酶上海联硕生物科技有限公司t4dna连接酶大连宝生物（takara）工程有限公司限制性内切酶sali,noti美国neb公司琼脂糖凝胶dna回收试剂盒大连宝生物（takara）工程有限公司质粒提取试剂盒axygen公司dnamarker天根公司pmd19-tsimple载体大连宝生物公司琼脂糖凝胶dna回收试剂盒购自天根公司t4dna连接酶、琼脂糖、总rna提取试剂盒购自promega公司溴化乙锭（eb）、溴酚蓝购自sigma公司tris碱，大肠杆菌dh5α本实验室保存胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒购自axygen公司（1）、ste溶液的组成为：nac，l0.1mol/l；tris•cl，10mmol/l；edta，1mmol/l，ph8.0（2）、溶液ⅰ的组成为：葡萄糖，50mmol/l；tris•cl，25mmol/l，ph8.0；edta，10mmol/l，ph8.0；（3）、溶液ⅱ：naoh，0.2mol/l；sds，1%；（4）、溶液ⅲ：5mol/l乙酸钾60ml；冰乙酸11.5ml；三蒸h2o28.5ml下述实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。实施例1：构建重组表达载体pet-22b-sumo-sbd-11、蒙古绵羊十二指肠组织总rna的提取（1）、将采集的蒙古绵羊十二指肠组织放入含有液氮的研钵进行研磨，直至成为粉末，期间不断补充液氮，防止液氮挥发，组织rna降解；（2）、取30-50mg组织粉末至1.5ml无酶ep管中，加入1ml预冷trizol的溶液，迅速振荡混匀，静置5min，以分离核酸蛋白复合物；（3）、将冰浴的与trizol反应的组织混合物于提前预冷的离心机中，4℃条件下12000rpm高速离心10min，用新的1.5ml无酶ep收取上清；（4）、将匀浆溶液加入0.2ml（1/5体积）提前冰浴的氯仿溶液，用震荡器剧烈震荡15s，混匀在冰上放置10min；（5）、将步骤（4）溶液在4℃条件下12000rpm高速离心分离10min后，轻柔小心地吸取上层无色水相约0.5ml移至新的1.5ml无酶管中，同时再加入与无色水相体积比为1:1的异丙醇，速颠倒混匀后，置冰浴10min；（6）、将步骤（5）混合液于4℃、12000rpm高速离心10min，弃上清，加入预冷后75%乙醇（rnase-freeddh2o或1‰depc水配制）1ml洗涤沉淀，每使用1mltrizol至少使用1ml75%乙醇对沉淀进行洗涤；（7）、将步骤（6）混合液4℃、12000rpm离心10min，弃上清，使用10μl无酶枪头吸取多余液体，将沉淀静置，短暂干燥约2-3min；（8）、吸一定量的rnase-freeddh2o或1‰depc水，溶解离心管底部的rna沉淀；（9）、取约0.5μl步骤（8）提取的十二指肠组织总rna进行0.8%琼脂糖电泳（u=100v，=15min），检查结果为清晰的、无拖尾的两条带，如图3，电泳结果初步评判总rna的完整性；与此同时用核酸蛋白测定仪来测定总rna的浓度、纯度，经测定符合试验要求的总rna，保存于-80℃备用；2、rt-pcr反应（1）、cdna合成使用无酶枪头及无酶离心管，按照如下步骤配制反应原料：1）首先加入1μl反应浓度为50μm的oligo(dt)20，1μl反应浓度为10mm的dntp混合物，然后加入质量为1ng～5μg十二指肠组织总rna，最后加入rnase-freeddh2o或1‰depc水补齐总反应体积至12μl，混匀后瞬时离心，65℃加热5min；2）立即将上述反应的混合液体放置到冰上将其冷却2～5min后，顺时离心，约10s后，添入4μl的5×primescriptbuffer，在添加2μlrnaseinhibitor（40u/μl），用移液器慢慢充分混匀，瞬时离心，37℃下孵育2min；3）再将上述的混合物用瞬时离心机瞬时离心，添加1μl试剂盒内的primescriptrtase（for2step）逆转录酶，随后将用移液器慢慢反复吹打充分混匀，封置于恒温水浴锅中37℃孵育50min；4）将步骤（3）中的反转录反应完成后混合物密封放置在70℃恒温条件下水浴15min，使反转录终止，反转录酶失活，反转得到的cdna储存于-20℃；（2）、pcr方法扩增sbd-1基因1）、pcr引物的设计根据genbank数据库中sbd-1的全长cdna序列（u75250）设计sbd-1成熟肽引物，下游引物含酶切位点noti如表1:表上游引物5′-tcgtctaagctgccatagg-3′下游引物3′-tttatagcggccgc(noti)cttctttctgcagcatttta-5′2）、按表2体系扩增sbd-1基因表2反应成份体积10×extaqbuffer（mg2+plus）5μldntpmixture（各2.5mm）2μlcdna2μlsbd-u0.5μlsbd-d0.5μl灭菌蒸馏水upto25μlpcr反应条件为：94℃预变性5min，然后在94℃变性60s，60℃复性45s，72℃延伸45s的条件下，循环30次，最后在72℃延伸10min；3、rt-pcr产物回收在紫外灯下从琼脂糖凝胶中切下单一条带的目的dna，置于离心管并称重，使用1%的凝胶，向胶块中加入3倍体积的溶胶液，50℃水浴放置10min；将上一步所得溶液加入一个吸附柱ca1，11000r/min离心30s，弃掉液体，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700ml漂洗液11000r/min离心30s,弃掉液体，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入500ml漂洗液11000r/min离心30s,弃掉液体，将吸附柱重新放入收集管中，11000r/min离心2min，尽量去除漂洗液，将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量无酶水，室温放置2min，11000r/min离心1min收集dna溶液；4、连接反应按表3进行pmd19-tsimple载体和胶回收产物连接，反应条件为：6℃反应3h；表3cdna的连接反应体系反应成份体积sbd-1基因片段4μlpmd19-tsimple1μlligationmix5μl总体积10μl5、连接产物转化dh5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出dh5α感受态细胞，冰上解冻后，加10μl的连接产物，在冰上冰浴30min，42℃热激90s，孵育3min，加入250μl的lb培养基，于37℃，180r·min-1摇床中培养45min-1h，将培养基分别涂布2个lb琼脂平板，预先涂布50μlx-gal和10μl的iptg且含amp，用途布棒涂布均匀，然后将培养基倒置37℃恒温培养箱中，培养12-14h；6、重组质粒的筛选观察菌落生长情况，蓝白斑生长良好后，将平板置于4℃冰箱中放置30min以后，进行挑菌；准备8个10ml离心管，各加入7mllb(己加amp)液体培养基，用20μl抢头挑取单个8个白色菌落分别置于8个离心管中，于37℃180r·min-1摇床中震摇培养12h；7、菌液pcr取培养后的菌液2μl作为pcr反应模板，按表4菌液pcr反应体系进行扩增；表4菌液pcr反应体系反应成份体积10×extaqbuffer（mg2+plus）5μldntpmixture（各2.5mm）2μl菌液2μlsbd-u0.5μlsbd-d0.5μl灭菌蒸馏水upto25μl8、质粒dna的小量制备采用碱裂解法小量制备质粒dna：从提取板上挑选10个单菌落分别接种10管10ml含氨苄青霉素（20mg/ml）的lb培养基中，37℃180r·min-1摇床培养过夜（12h）；取1.5ml培养物加入eppendorf管，4℃11000r/min离心1min；吸取培养液，干燥细菌沉淀；向沉淀中加入0.5mlste溶液，充分洗涤，11000r/min离心1min；弃掉上清液，加入预冷的溶液ⅰ200μl，剧烈震荡使菌体悬浮，室温放置10min；加现配的溶液ⅱ400ml使菌体裂解，冰浴10min；加入预冷的溶液ⅲ300ml，混合后冰浴5min，4℃11000r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇25：24：1混合10min，4℃11000r/min离心10min；弃掉上清液，加2倍体积的无水乙醇，室温混合5min，4℃11000r/min离心10min；弃掉上清液，用70%乙醇洗涤，4℃11000r/min离心10min；弃掉上清液，室温干燥沉淀，加50mlte缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用；9、质粒dna的酶切鉴定用限制性内切酶noti酶切鉴定阳性质粒，如图4所示，pcr产物标准dl1000，用noti酶切，其消化液组成为（表5）：表5sali＋noti酶切消化体系（20ml）成分加样体积,mlhbuffer2bas2质粒dna8noti1dh2o7终体积total2010、rt-pcr产物cdna的序列测定将酶切鉴定正确的阳性克隆质粒进行序列测定；11、sumo的rt-pcr反应（1）、根据genbank数据库中dl174520.1设计sumo引物，sumo的上游引物含酶切位点sali，表6引物序列上游引物5′-acgcgtcgac（sali）atgtcggactcagaagtcaat-3′下游引物3′-acagattggtggtgctacgtatcctatgg-5′（2）、sumo与上游酶切位点的连接按表7，pet3c-sumo通过pcr获得sumo编码片段，使得sumo含酶切位点sali；pcr反应条件为：94℃预变性5min，然后在94℃变性60s，60℃复性45s，72℃延伸45s的条件下，循环30次，最后在72℃延伸10min，用试剂盒回收pcr产物的片段；表7反应成份体积10×extaqbuffer（mg2+plus）5μldntpmixture（各2.5mm）2μlpet3c-sumo（质粒）2μlsumo-u0.5μlsumo-d0.5μl灭菌蒸馏水upto25μl（3）、sumo的rt-pcr产物回收在紫外灯下从琼脂糖凝胶中切下单一条带的目的dna，置于离心管并称重，使用1%的凝胶，向胶块中加入3倍体积的溶胶液，50℃水浴放置10min；将上一步所得溶液加入一个吸附柱ca1，11000r/min离心30s，弃掉液体，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700l漂洗液11000r/min离心30s,弃掉液体，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入500l漂洗液11000r/min离心30s,弃掉液体，将吸附柱重新放入收集管中，11000r/min离心2min，尽量去除漂洗液；将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量无酶水，室温放置2min；11000r/min离心1min收集dna溶液；12、连接反应按表8进行pmd19-tsimple载体和胶回收产物连接，反应条件为：6℃反应3h；表8cdna的连接反应体系反应成份体积sumo基因片段4μlpmd19-tsimple1μlligationmix5μl总体积10μl13、连接产物转化dh5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出dh5α感受态细胞，冰上解冻后，加10μl的连接产物，在冰上冰浴30min，42℃热激90s，孵育3min，加入250μl的lb培养基，于37℃，180r·min-1摇床中培养45min-1h，将培养基分别涂布2个lb琼脂平板，预先涂布50μlx-gal和10μl的iptg且含amp，用途布棒涂布均匀，然后将培养基倒置37℃恒温培养箱中，培养12-14h；14、重组质粒的筛选观察菌落生长情况，蓝白斑生长良好后，将平板置于4℃冰箱中放置30min以后，进行挑菌；准备8个10ml离心管，各加入7mllb(己加amp)液体培养基，用20μl抢头挑取单个8个白色菌落分别置于8个离心管中，于37℃180r·min-1摇床中震摇培养12h；8、菌液pcr取培养后的菌液2μl作为pcr反应模板，按表4菌液pcr反应体系进行扩增；表4菌液pcr反应体系反应成份体积10×extaqbuffer（mg2+plus）5μldntpmixture（各2.5mm）2μl菌液2μlsbd-u0.5μlsbd-d0.5μl灭菌蒸馏水upto25μl16、质粒dna的小量制备采用碱裂解法小量制备质粒dna：从提取板上挑选10个单菌落分别接种10管10ml含氨苄青霉素（20mg/ml）的lb培养基中，37℃180r·min-1摇床培养过夜（12h）；取1.5ml培养物加入eppendorf管，4℃11000r/min离心1min；吸取培养液，干燥细菌沉淀；向沉淀中加入0.5mlste溶液，充分洗涤，11000r/min离心1min；弃掉上清液，加入预冷的溶液ⅰ200μl，剧烈震荡使菌体悬浮，室温放置10min；加现配的溶液ⅱ400ml使菌体裂解，冰浴10min；加入预冷的溶液ⅲ300ml，混合后冰浴5min，4℃11000r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇25：24：1混合10min，4℃11000r/min离心10min；弃掉上清液，加2倍体积的无水乙醇，室温混合5min，4℃11000r/min离心10min；弃掉上清液，用70%乙醇洗涤，4℃11000r/min离心10min；弃掉上清液，室温干燥沉淀，加50mlte缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用；17、目的片段的纯化sumo的pcr产物通过1.0%琼脂糖胶电泳，切胶回收。实施例2：重组质粒pet-22b-sumo-sbd-1的构建1、sumo-sbd-1的连接(overlappcr)（1）、引物设计以pmd19-t-sumo和pmd19-t-sbd-1为模板，设计sumo-sbd-1融合基因上游引物、linker和下游引物(表9)；表9引物序列上游引物5′-tttatagcggccgc（sali）cttctttctgcagcatttta-3′下游引物5′-acgcgtcgac(noti)atgtcggactcagaagtcaat-3′linker5′-acagattggtggtgctacgtatcctatggcagcttagacga-3′（2）、sumo-sbd-1的连接按照表9的引物，将sumo与sbd-1按照如下反应条件连接；pcr反应条件为：94℃预变性5min，然后在94℃变性60s，3℃60s，2℃60s循环25次，最后在72℃延伸10min，用试剂盒回收pcr产物的片段。（3）、利用overlap-pcr扩增sumo-sbd-1片段；（4）、取扩增产物，1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，将产物按pcr产物回收试剂盒进行回收，-80℃保存；（5）、用t4dna连接酶连接到pmd19-t载体上，（6）、转化到dh5α感受态细胞，（7）、经过重组质粒的筛选，（8）、质粒dna的小量制备，（9）、质粒dna的酶切鉴定用限制性内切酶sali＋noti双酶切鉴定阳性质粒，其消化液组成为（表10）：表10sali＋noti酶切消化体系（20ml）成分加样体积,mlhbuffer2bas2质粒dna8sali1noti1dh2o6终体积total20鉴定结果如图5所示，1是成功构建pet-22b-sumo-sbd-1；2是双酶切sali＋noti双酶切；m是kbladder；（10）、dna测序，测序结果如图6；（11）、序列鉴定正确后，将它接种于2瓶含氨苄青霉素（终浓度50µg/ml）500mllb液体培养基中，大量制备含有pmd19-t-sumo-sbd-1片段的质粒；2、目的片段与表达载体的双酶切将sumo-sbd-1的纯化产物用sali+noti双酶切，同时将表达载体pet-22b用sali+noti按表11酶切体系进行酶切，在37℃下酶4h，而后将酶产物通过1.0%琼脂糖胶电泳，切胶回收；表11sali+noti酶切体系成分加样体积,mlsumo-sbd-1/pet-22b10sali2noti2bufferh2bsa2去离子水2总体积total203、酶切后的目的片段与酶切后的表达载体的连接将回收的目的基因片段sumo-sbd-1和pet-22b质粒载体线性大片段按表12连接反应体系进行连接，反应液混匀，16℃过夜12h连接；表连接反应体系成分加样体积μlpet-22b1.010×t4ligasebuffer1.0t4dnaligase(3u/μl)1.0sumo-sbd-16.0灭菌蒸馏水1.0总体积total104、连接产物转化感受态细胞dh5α取新制备100ul感受态细胞dh5α和10ul连接产物pet-22b-sumo-sbd-1混匀，冰浴30min，42℃水浴中热击90s，立刻置于冰上3min，加入lmllb液体培养基混匀，转至37℃摇床180rpm,lh，取50ul转化液涂布在lb(含amp)固体培养基上，自然干燥5-10min，37℃倒置过夜12h培养；5、阳性转化子的鉴定(l)转化菌落的pcr鉴定:从含有氨苄青霉素的lb平板上挑取菌落形态圆正的，划小区域过夜培养，然后做菌落pcr扩增鉴定，取10ulpcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测；(2)序列测写与序列分析:对菌落pcr鉴定为阳性的菌落在10ml的培养基中培养12h-14h，提取质粒，并对pet-22b-sumo-sbd-1质粒经南京金斯瑞序列测定，测序结果显示，重组sumo-sbd-1基因的编码序列为426bp，测序结果如图4，与genbank数据库已发表sumo（dl174520.1sbd-1）、sbd-1序列(u75250)比较,无碱基的差异，同源性为100%；6、抽取阳性表达质粒，转化到bl21(de3)感受态细胞构建表达菌株取新制备100ulbl21(de3)感受态细胞和10ul连接产物pet-22b-sumo-sbd-1混匀，冰浴30min，42℃水浴中热击90s，立刻置于冰上3min，加入lmllb液体培养基混匀，转至37℃摇床180rpm，lh，取50ul转化液涂布在lb(含amp)固体培养基上，自然干燥5-10min，37℃倒置过夜12h培养；再将它接种于2瓶含氨苄青霉素（终浓度50µg/ml）500mllb液体培养基中，37℃180r·min-1振荡培养2h到2.5h，a(600)达0.6-0.8时添加，添加入终浓度0.5.mmol/liptg诱导，放在18℃培养15h后，将培养基11000r/min离心15min,取菌体沉淀；称重菌体沉淀并加入lysisbuffen(菌体1g:lysisbuffen10ml)重悬，加入终浓度为200ug/ml溶菌酶，20-30min后，加入pmsf至终浓度为100μg/ml混均，冰上完成超声破碎（条件220v，4sbursting，4scooling，100个循环，30min)；7、sbd-1蛋白的纯化(1)脱盐以20mm的tris缓冲液，ph=6.8，用sephadexg10脱盐，流速:1ml/min；（2）表达蛋白的纯化(亲和层析)平衡液:50mmna3po4(ph6.8),300mnacl,10mmimidazole;洗脱液:30mmna3po4(ph6.8),300mnacl，500mmlmidazole，流速:lml/min；收集50ul纯化后的样品；（3）浓缩:经验证后将其余样品放入超滤离心管15ml2000r/min离心30min，分别收集上下液；（4）sumo酶切sumo蛋白酶,保存缓冲液:50mmtris-hcl,150mmnacl,1mmedta,1mmdtt,ph7.4,酶切缓冲液50mmtris-hclph8.0150mm150mmnacl,0.1edta,1mmdtt;收集浓缩后的液体50ul，加入sumo蛋白酶2ml,保存液缓冲液5ml和50ul的酶切缓冲液，4℃过夜12h；8、冷冻干燥将sumo酶切后的蛋白溶液先在-80℃冰箱中预冻过夜，而后在冻干机中过夜冷冻干燥；9、进行凝胶电脉；如图7分离胶浓度为15%,浓缩胶浓度为5%,电泳条件浓缩胶80v,分离胶120v｡10、融合蛋白进行蛋白质印迹法鉴定，鉴定结果如图8所示；一抗为兔抗anti-6xhisrabbitpolyclonalantibody,以1;1000稀释；具体步骤如下:（1）、转膜1）pvdf膜的处理及凝胶的平衡：将一张与凝胶相同大小的膜首先放入甲醇中浸泡10s-20s，再放入dh2o中浸泡10min，然后置于转膜缓冲液中平衡10min；2)转膜：在湿转膜槽从白面到黑面依次叠加海绵、己平衡的滤纸、膜、凝胶、己平衡的滤纸、海绵，每叠加一层，均用干净的玻璃棒小心排除夹层之间的气泡，接通电源，恒压80v，45min条件下转膜，转膜完毕后，膜置于丽春红中染色，后用漂洗脱色，观察膜上有无蛋白带，以确定目的蛋白的转膜效果，然后将膜放在一张滤纸上，室温干燥后4℃保存；（2）、免疫印记:将已转印的pvdf膜切割成条状,放入干净反应槽的封闭液中(0.3%tween-20，pbs，ph7.2)，常温封闭1h，于摇床上轻轻摇动，pbs洗涤2遍，每次10min，于摇床上轻轻摇动，用稀释液(0.3%tween-20，pbs，ph7.2)将一抗兔抗anti-6hisrabbitpolyclonalantibody，1：1000稀释，4℃过夜(12h)后,洗膜3次，每次10min，于摇床上轻轻摇动，irdye680ltgoatanti-mouse(odyssey,926-68020,1:10000)和irdye800ltgoatanti-rabbit(odyssey,926-3211,1:10000)室温孵育1h，tbst清洗3×10min，于li-corodysseyclx进行扫描，鉴定结果如图8；11、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌试验将100mlpbs加到冷冻干燥后的蛋白样品0.05g中，用牛津杯法将以重组防御素作用于大肠杆菌，并以100ml的pbs作为对照，过液培养，sbd-1对大肠杆菌bl21能形成抑菌环，如图9所示｡诱导目的蛋白大量表达,得到的目的蛋白不可溶，而后将表达产物分别通过超声破碎、脱盐、亲和层析、浓缩、sumo酶切、冷冻干燥后，将其分别作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，通过抑菌实验证明：sbd-1对大肠杆菌bl21能形成抑菌环，并且抑菌作用与浓度相关，最终得到了绵羊β-防御素-1(sbd-1)。序列表<110>内蒙古农业大学<120>利用小泛素相关修饰物sumo体外表达绵羊β-防御素的方法<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>ovisaries<400>1tcgtctaagctgccatagg19<210>2<211>34<212>dna<213>ovisaries<400>2tttatagcggccgccttctttctgcagcatttta34<210>3<211>112<212>dna<213>ovisaries<400>3tcgtctaagctgccataggaataaaggcgtctgtgtgccgagcaggtgccctagacacat60gagacagattggcacctgtcgcgggcccccagtaaaatgctgcagaaagaag112<210>11<211>31<212>dna<213>ovisaries<400>11acgcgtcgacatgtcggactcagaagtcaat31<210>5<211>29<212>dna<213>ovisaries<400>5acagattggtggtgctacgtatcctatgg29<210>8<211>306<212>dna<213>ovisaries<400>8atgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtcaagcct60gagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaagatcaaa120aagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaaggaaatg180gactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccctgaagat240ttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggtgctacg300tattag306<210>10<211>36<212>dna<213>ovisaries<400>10tttatagcggccgcsacttctttctgcagcatttta36<210>8<211>33<212>dna<213>ovisaries<400>8acgcgtcgacntatgtcggactcagaagtcaat33<210>9<211>41<212>dna<213>ovisaries<400>9acagattggtggtgctacgtatcctatggcagcttagacga41<210>10<211>428<212>dna<213>ovisaries<400>10gtcgacatgtcggactcagaagtcaatcaagaagctaagccagaggtcaagccagaagtc60aagcctgagactcacatcaatttaaaggtgtccgatggatcttcagagatcttcttcaag120atcaaaaagaccactcctttaagaaggctgatggaagcgttcgctaaaagacagggtaag180gaaatggactccttaagattcttgtacgacggtattagaattcaagctgatcagacccct240gaagatttggacatggaggataacgatattattgaggctcacagagaacagattggtggt300gctacgtatcgtctaagctgccataggaataaaggcgtctgtgtgccgagcaggtgccct360agacacatgagacagattggcacctgtcgcgggcccccagtaaaatgctgcagaaagaag420gcggccgc428当前第1页12