三阴性人乳腺癌细胞株L533的制作方法

文档序号:15457417发布日期:2018-09-15 01:29阅读:452来源:国知局
本发明涉及生物
技术领域
,尤其涉及一种三阴性人乳腺癌细胞株l533。
背景技术
:乳腺癌占女性恶性肿瘤的第一位,其发病率逐年上升,并呈年轻化趋势。除手术切除外,乳腺癌的治疗包括化学疗法、放射疗法、针对er、pr阳性的内分泌治疗以及针对her2(humanepidermalgrowthfactor2)过度表达的生物治疗。尽管生物技术的发展以及治疗手段的提高,仍有近三分之一的早期乳腺癌患者陆续出现肿瘤转移,5年生存率仅为23%,其中三阴性乳腺癌(er、pr及her2均为阴性)患者常常短期出现远处转移且无理想的治疗方案。曲妥珠单抗(商品名:赫赛汀)是目前治疗her2过度表达的转移性乳腺癌的重要药物,该药选择性地作用于her2的细胞外部位,阻断her2信号以抑制her2阳性肿瘤细胞的增殖。然而,越来越多接受曲妥珠单抗治疗的患者逐渐出现耐药,her2的表达也出现变化。深入研究三阴性乳腺癌的生物学行为对提高乳腺癌患者生存率、改善预后具有重要的生物学意义。而目前该疾病缺乏广泛的研究对象,极大了影响了其研究进程。技术实现要素:为解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种三阴性人乳腺癌细胞株l533。本发明提供的乳腺癌细胞株可以为三阴性乳腺癌的生物学行为及治疗提供研究对象。本发明提供了一种三阴性人乳腺癌细胞株l533,其保藏编号为cctccno:c2016184。进一步地,三阴性人乳腺癌细胞株l533为er(-)、pr(-)、her2(-)三阴性人乳腺癌细胞株。进一步地,三阴性人乳腺癌细胞株l533的制备方法包括以下步骤:选取乳腺癌组织细胞进行80代以上传代培养。进一步地,传代培养初期采用半换液培养,待细胞稳定后,用反复贴壁法和dk-sfm培养基+10%fbs培养;之后经反复冻存,以稳定传代80代以上。反复贴壁法和dk-sfm培养基+10%fbs培养可促进上皮细胞生长,抑制其中纤维细胞生长。本发明的三阴性人乳腺癌细胞株l533于2016年11月9日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉市武汉大学,保藏编号为cctccno:c2016184。借由上述方案,本发明至少具有以下优点:本发明的乳腺癌细胞株er、pr及her2均为阴性,通过str鉴定其与目前所有的乳腺癌细胞均不同;er、pr及her2均为阴性的三阴性乳腺癌的生物学行为以及治疗方案是乳腺癌临床治疗的难点和热点。本发明提供的乳腺癌细胞株可以为三阴性乳腺癌的生物学行为及治疗的选择提供新的研究对象,也为更全面了解三阴性乳腺癌提供物质基础。上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本发明l533细胞株的流式细胞学检测结果;图2是本发明l533细胞株的染色体检测结果;图3是本发明l533细胞株的str检测结果;图4是本发明的电镜检测结果;图5反映了本发明细胞株在克隆实验中,不同培养天数的细胞生产情况;图6为本发明细胞株在克隆实验培养20天后染色后情况;图7是本发明l533细胞株培养6天的生长曲线;图8是本发明l533细胞株的免疫组化实验结果;图9是本发明l533细胞株的fish检测结果;图10反映了本发明l533细胞株的致瘤能力;图11反映了本发明l533细胞株皮下接种裸鼠后所成的肿瘤。具体实施方式下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。实施例1原代组织的制备与检测术中取患者肿瘤组织,取材严格保证无菌。将组织块放置于10ml玻璃培养皿中,用pbs液漂洗,去除多余血液及周边结缔组织,用眼科剪将组织块剪切成小块(每块约lmm3大小)。用lml含10%胎牛血rpmi.1640双抗培养液均匀润湿无菌培养瓶瓶底,将剪碎的组块转移处理后的组织块至培养瓶内,调整位置,使其均匀分布于瓶底。将培养瓶瓶底朝上放置在37℃,5.0%co2温箱内约30min,使组织块充分贴壁。然后将培养瓶缓慢翻转平放,加入培养液之后放置在37℃,5.0%co2温箱内静置培养。待细胞从组织中爬出,贴壁生长,密切观察细胞生长状况,换液,传代。实施例2乳腺癌细胞株的建立(1)传代对实施例1中的细胞进行传代培养,初期换液采取半换液,待细胞稳定后(20代之后),采取全换液。传代条件如下:用0.25%胰酶消化细胞,待细胞变圆终止消化,1000rpm离心5min后,用新鲜的含10%胎牛血rpmi1640双抗培养液重悬后放入培养瓶中,放置在37℃,5.0%co2温箱内培养,密切观察细胞生长状况。(2)筛选待步骤(1)中的细胞生长稳定后,采用反复贴壁法并使用含10%fbs的dk-sfm双抗培养液进行培养,其目的是为了促进上皮细胞生长,抑制其中纤维细胞生长。之后经反复冻存,以稳定传代80代以上。稳定后用新鲜的含10%胎牛血rpmi1640双抗培养液培养。得到乳腺癌细胞株l533。实施例3细胞株的鉴定对实施例2得到的细胞株进行鉴定,具体包括以下几种方法:(1)表面分子检测:检测t细胞谱系抗原cd3,cd4,cd8;nk细胞谱系标志cd16,cd56;b细胞标志cd19,cd20,cd22;单核细胞标志cd14,cd33;内皮细胞标志cd34;hla-dr抗原;肿瘤干细胞标志cd24,cd44和细胞因子il-4,il-6,il-10,il-17,tnf-α,ifn-γ的表达。具体步骤如下:利用流式细胞术及相应的单克隆抗体鉴定l533表面抗原的表达以明确该细胞株的来源。取生长状态良好细胞,0.25%em消化,1200rpm离心5min,弃上清。pbs洗涤,1200rpm离心5min,弃上清。pbs重悬,调整细胞浓度1×106/ml。取50μl细胞悬液,加入流式管中,分别加入相应待测抗体,震荡,同时设立阴性对照。4℃避光孵育30min。pbs洗涤2次,用350μlpbs重悬,流式细胞仪检测l533表面核型。图1为l533细胞株的流式细胞学检测结果,结果表明其t细胞谱系抗原cd3、cd4、cd8均为阴性;nk细胞谱系标志cd16、cd56均为阴性;b细胞标志cd19、cd20、cd22均为阴性;单核细胞标志cd13、cd14、cd33均为阴性;内皮细胞标志cd34为阴性;细胞因子的分泌情况为il-17、tnf-α、ifn-γ均为阴性;il-4、il-10的分泌水平很低分别为2.63%,2.83%;l533可以分泌高水平的il-6(70.9%)。肿瘤干细胞标志结果显示:cd44+cd24-/low乳腺癌肿瘤干细胞比率为63.0%。(2)染色体的鉴定:通过g显带染色体核型分析,明确肿瘤细胞多倍体核型。具体步骤如下:细胞准备:取生长状态良好的细胞,加入秋水仙素,至终浓度为0.05ug/ml。37℃下培养1h,1000rpm离心10min,弃上清。低渗:逐滴加入0.5ml37℃下预温的0.75mol/l的kcl溶液,补充至10ml,用吸管轻轻吹打混匀,37℃下孵育30min。预固定:在管中加入1ml新鲜配置的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1),1000rpm离心10min,弃上清。第二次固定:再次加入10ml固定液,固定20min,1000rpm离心10min,弃上清。第三次固定,同上。悬液配备:1000rpm离心10min,弃上清,加适量固定液配成细胞悬液,-4℃保存备用。giemsa染液染色15分钟,流水冲洗晾干。显带制片:取细胞悬液,滴片,r显带制片。镜检:在显微镜下选择染色体分散良好、不重叠、无失散的视野,在油镜下观察记录并进行显微摄影。图2是本发明l533细胞株的染色体检测结果,从图中可看出,染色体具有复杂异常核型,仅有少数染色体r显带基本正常,尚可辨认,其余失去了正常染色体形态,因此可排除其为正常乳腺细胞和其他细胞的可能。通过染色体核型分析,明确肿瘤细胞多倍体核型(见图2中加方框的图),l533细胞具有典型的肿瘤核型。(3)str鉴定:通过str位点检测,对原代细胞及传代细胞株进行乳腺癌细胞基因组学鉴定。具体方法如下:将19个str基因座和1个性基因座用ex20试剂盒放大。细胞系样品用abi3500基因分析仪分析。数据用id-xv1.2进行分析,每个样品都有阳性对照和阴性对照进行对比分析。图3为l533细胞株的str检测结果,从图中可看出,该细胞经过检索,没有和任何现有的细胞株比中,检测结果支持了这株细胞为原代建系的细胞。(4)电镜观察:通过透射电镜,观察细胞株内超微结构。具体方法如下:取生长状态良好的细胞,em消化后10%fbs的1640培养基终止,1000rpm离心10min,弃上清。pbs重悬细胞,2000rpm离心15min,使细胞成团。小心吸去上清,加入2.5%戊二醛固定,2小时。脱水后固定于树脂中,1%锇酸4℃固定60min。用超微切片机做成超薄切片,飞利浦cm120电子显微镜下60千伏下观察,以已知乳腺癌细胞株mcf-7为对照。结果见图4,电镜下mcf-7可见核异形,核明显不规则,核内常染色体为主,核仁明显;胞浆内粗面内质网、核糖体、高尔基体增多,分泌功能旺盛。胞内有自噬泡;细胞表面微绒毛较多;高尔基体基质颜色较深。而本发明的l533细胞株也可见核异形,核较不规则,核内常染色体为主(有些有深染的染色体),核仁明显,有些细胞核呈圆形;胞浆内粗面内质网、核糖体、高尔基体增多,分泌功能旺盛。胞内有自噬泡,自噬泡较多;细胞表面微绒毛较多;高尔基体基质颜色不深。电镜下检测结果显示l533符合肿瘤细胞生物学特性。(5)克隆实验:通过细胞平板克隆试验,检测细胞株克隆能力。具体方法如下:取指数生长期、状态良好细胞,用胰酶消化,制成细胞悬液。然后反复吹打细胞悬液,使细胞充分分散,单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数,并用培养基调节细胞浓度,待用。根据细胞增殖能力,将细胞悬液倍比稀释。每皿按200个细胞的浓度接种细胞悬液到培养皿(直径60mm)中,以十字方向轻轻晃动培养皿,使细胞分散均匀。将培养皿置于37℃、5%co2中培养2~3周,中间根据培养液ph变化适时更换新鲜培养液。当培养皿中出现肉眼可见克隆时,终止培养,弃去培养液,pbs液小心浸洗2次,空气干燥。用甲醇固定15分钟,弃甲醇后空气干燥。用giemsa染液染色10分钟,流水缓慢洗去染液,空气干燥。结果见图5-6,图5a、b、c分别为培养9天、16天和20天的细胞生长情况,a、b图放大100倍,c图放大4倍,giemsa染液染色结果显示培养皿中可见肿瘤克隆形成,共计得66个克隆。根据公式:克隆形成率=克隆数/接种培养细胞总数×100%,l533克隆形成率=66/200×100%=33%。由此可见,l533具有克隆生长的特性。(6)生长曲线:通过细胞生长曲线和倍增时间观察细胞株生长特性。收集生长状态良好的细胞,胰酶消化后计数板计数。将细胞浓度调整为2×104/ml,加入24孔板(1ml/孔,即2×104/孔),同时设立3个平行组,采用10%fbs的1640培养基,放入37℃下,5%co2培养箱中培养。分别于24小时、48小时、72小时、96小时,取3个孔进行计数并绘制生长曲线。倍增时间计算(doubletime,dt)=t×lg2/(lgnt-lgn0),其中,n0为初次计数的细胞数;nt为t小时计数的细胞数;t为每2次细胞计数的间隔时间,即24小时。生长曲线如图7所示,细胞生长曲线呈s形,细胞1-3天为潜伏适应期,细胞增殖速度较慢。第4-5天细胞进入对数生长期,细胞增殖明显加速。然后进入平台期,由于细胞密度增加,出现接触抑制,细胞增殖速度略有下降。根据生长曲线,细胞进入对数生长期后,倍增时间约为30小时。表1为3组细胞的平均生长情况,由此可见,l533具有很强增殖能力。表13组细胞的平均生长情况培养天数0123456平均数1.903.235.146.8017.3323.0027.00sd0.150.500.440.201.912.703.91(7)细胞免疫组织化学检测:通过细胞免疫组化技术检测细胞株的er、pr、her-2蛋白的表达情况。将无菌的盖玻片放入6孔板中,将l533细胞种植于6孔板中,该6孔板预先贴附处理后的盖玻。待细胞长满后,显微镜下观察细胞状态和贴壁情况。4℃预冷丙酮,将贴有细胞的盖玻片取出,浸入丙酮中固定10min,晾干;pbs中洗涤残留丙酮;加入内源性过氧化物酶拮抗剂阻断10min,pbs洗涤3次;滴加非免疫性血清,反应10min,pbs洗涤3次;分别加入er、pr、her2、ki67等一抗,4℃反应过夜,pbs洗涤3次;加二抗,37℃反应20min,pbs洗涤3次;dab染色,pbs洗涤3次;苏木素复染,酒精脱水,树胶封片,显微镜下观察。结果见图8,免疫组化的实验结果显示:l533乳腺癌细胞er、pr均为阴性,ki67为强阳性,her2为20%细胞呈弱阳性。(8)fish检测:通过fish检测细胞株中her-2基因的拷贝情况。将无菌的盖玻片放入6孔板中,将l533细胞种植于6孔板中,该6孔板预先贴附处理后的盖玻。待细胞长满后,显微镜下观察细胞状态和贴壁情况。用pbs洗涤标本3次,每次各1min;然后用冰丙酮固定15min,空气干燥5min,pbs洗涤3次,2min/次;0.5%tritonx-100(dpbs配)孵育20min,pbs洗涤3次,2min/次;滴加探针、封胶,83℃变性6min,42℃杂交过夜;72℃的0.4×ssc洗2min,37℃的2×ssc洗2min,70%的乙醇洗30s,100%的乙醇洗2min;加dapi,盖玻片贴附载玻片,荧光显微镜镜下观察。以已知her2阳性的bt-474乳腺癌细胞株为阳性对照。鉴于her2呈弱阳性表达,进一步借助fish技术通过荧光标记的her2基因和该基因所在的第17号染色体着丝粒(cepl7)序列的双探针对l533进行检测,荧光显微镜下观察结果显示(图9),her2基因拷贝量低,her2为阴性。同时,以已知her2阳性的bt-474乳腺癌细胞株为阳性对照,荧光显微镜下可见明显红绿双色荧光,显示her2基因拷贝。(9)成瘤实验:通过裸鼠成瘤试验观察原代细胞的致瘤能力。将l533细胞扩大培养,胰酶消化,1200rpm离心5min,pbs洗涤2遍,细胞计数;用pbs稀释细胞液,调整细胞浓度分为3组,分别为1×106、0.75×106、0.5×106。于裸鼠背部行皮下接种,每组接种6只裸鼠,50μl/只,皮下接种。观察肿瘤生长情况,记录成瘤时间,成瘤大小和裸鼠体重变化。结果见图10,以1×106个l533细胞皮下接种后,5只成瘤(成瘤率为83.3%);以0.75×106个l533细胞皮下接种后,2只成瘤(成瘤率为33.3%);以0.5×106个l533细胞皮下接种后,仅1只成瘤(成瘤率为16.7%)。由此可见,l533具有致瘤性,其最佳致瘤细胞数为1×106个。同时,将皮下接种肿瘤用10%福尔马林固定、取材、石蜡包埋、切片并行h&e染色,显微镜下观察见肿瘤细胞排列紊乱,细胞密度高,肿瘤细胞核浆比明显失调,细胞核大深染、大小不一、异形明显(图11,放大倍数400倍)。以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本
技术领域
的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。当前第1页12
当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1