本发明属于药物化学领域，具体涉及了一种吡唑并[3,4-b]吡啶类化合物，制备方法，及其作为alk抑制剂在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康的疾病。其中，肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，肺癌包括非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)和小细胞肺癌，非小细胞肺癌在所有肺癌中占比85％。在病理学上，非小细胞肺癌又包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。对于早期确诊的患者，经过手术治疗后可以起到很好的预后效果。然而多数患者在确诊时已经处于晚期，传统手术治疗以及化疗效果并不能有效控制病情，五年内生存率极低。因此针对非小细胞肺癌的靶向药物的开发极为迫切。
靶向疗法是指通过阻断与肿瘤生长或抑制相关信号通路的某个位点的系统治疗方法。表皮生长因子受体(egfr)小分子抑制剂是最早应用于临床非小细胞肺癌靶向治疗的药物。2007年棘皮动物微管相关蛋白4(eml4)和alk的融合致癌基因被发现，为非小细胞肺癌的分子疗法又提供了新的靶点。
间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，alk)是一种受体酪氨酸激酶，结构上隶属于胰岛素受体超家族。alk在间变性大细胞淋巴瘤中作为t(2；5)染色体易位的融合伴侣，正常表达的核仁磷酸化蛋白的n末端部分与alk激酶结构域融合形成npm-alk融合蛋白，其中npm部分能够使alk激酶结构域二聚并且使之激活。此外，在某些癌症组织样品中还发现了染色体2p内部出现部分倒置，导致部分棘皮动物微管相关蛋白4(eml4)和alk融合基因的形成。eml4-alk融合基因具有“致癌基因依赖性”的特征，与大部分非小细胞肺癌密切相关。
人类的alk基因位于染色体2p23位点，从碱基对29、192和773到29、921和610。alk基因具有26个外显子，由6226个碱基对组成的cdna编码出一段具有1620个氨基酸、长达177422da的多肽，经翻译后修饰得到长达约220kda的成熟alk蛋白。
目前已经发现22种不同的基因能够与alk发生重排形成融合蛋白，这表明alk基因座可能由于某些目前未知的原因而容易发生易位。尽管一定数量的融合蛋白已经被实验确证，但是只有少数被广泛研究，包括间变性大细胞淋巴瘤(aclc)中的npm-alk融合蛋白和非小细胞肺癌(nsclc)中的eml4-alk融合蛋白。
由于过去十几年间科学家对于alk激酶和alk融合蛋白的深入研究，alk已经成为一个治疗非小细胞肺癌的药物靶点。目前已有多个alk激酶抑制剂被开发并且进入临床试验。例如辉瑞制药开发的克唑替尼(crizotinib)、诺华制药开发的色瑞替尼(ceritinib)、罗氏制药开发的艾乐替尼(alectinib)和ariad制药开发的entrectinib等。以上化合物均在alk阳性的非小细胞肺癌患者中表现出强效的临床药物活性。早在2010年，克唑替尼被fda批准用于治疗alk阳性的非小细胞肺癌，成为第一个上市的alk激酶抑制剂。随后，在2014年色瑞替尼被fda批准用于alk阳性的、癌细胞转移的以及使用克唑替尼后复发的非小细胞肺癌患者。2015年，艾乐替尼被fda加快批准用于使用克唑替尼治疗后病情出现进展的非小细胞肺癌患者。
因为alk在肿瘤的发生和发展过程起着关键性的作用，通过开发选择性alk靶向小分子抑制剂，可以有效的提高治疗水平，显著延长患者生存期，造福广大肿瘤患者，因此研发alk抑制剂是非常具有应用前景的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种吡唑并[3,4-b]吡啶类化合物及其制备方法。同时这类化合物的酶活性试验(tr-fret)和抗肿瘤活性(karpass-299)都达到了较好的效果。
本发明所提供的一种吡唑并[3,4-b]吡啶类化合物具有如下所示结构通式(ⅰ)：
其中：
环a选自五元或六元杂环芳基或芳基，所述取代基选自r4基团；
r1选自氢、卤原子、羟基、氨基、氰基、烷氧基、-oc(＝o)ra，ra任选自烷基、烷氧基、烷胺基、五元或六元的脂肪杂环或芳杂环，所述的杂环包含1～2个o、n的杂原子；
r2选自氢、卤原子、烷基；
r3选自氢、卤原子、烷基；
r4选自氢、烷基、烷胺基、取代或无取代的五元或六元脂肪杂环中的一个或者多个(此处，r4也可以表示位于不同位置的多个取代基)，所述的杂环包含1～2个选自o、n的杂原子，所述的取代基选自烷基、羟甲基、酰胺基。
进一步地，本发明优选的化合物具有通式(ⅱ)的结构：
其中：
r1选自氢、卤原子、羟基、氨基、氰基、烷氧基、-oc(＝o)ra，ra任选自烷基、烷氧基、烷胺基、五元或六元的脂肪杂环或芳杂环，所述的杂环包含1～2个o、n的杂原子；
r2选自氢、卤原子、烷基；
r3选自氢、卤原子、烷基；
r4选自氢、烷基、烷胺基、取代或无取代的五元或六元脂肪杂环，所述的杂环包含1～2个选自o、n的杂原子，所述的取代基选自烷基、羟甲基、酰胺基。
进一步地，本发明优选的化合物具有通式(ⅲ)的结构：
r1选自氢、卤原子、羟基、氨基、氰基、烷氧基、-oc(＝o)ra，ra任选自烷基、烷氧基、烷胺基、五元或六元的脂肪杂环或芳杂环，所述的杂环包含1～2个o、n的杂原子；
r2选自氢、卤原子、烷基；
r3选自氢、卤原子、烷基；
r4选自氢、烷基、烷胺基、取代或无取代的五元或六元脂肪杂环，所述的杂环包含1～2个选自o、n的杂原子，所述的取代基选自烷基、羟甲基、酰胺基；
r5选自氢、烷基、烷氧基。
更具体地，本发明通式(ⅱ)结构的优选化合物选自：
4-(3-(5-甲基呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11a)
4-(3-(5-(吗啉代甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11b)
4-(3-(5-(哌啶-1-基甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11c)
4-(3-(5-(吡咯烷-1-基甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11d)
4-(3-(5-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11e)
4-(3-(5-((二甲基氨基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11f)
4-(3-(5-((2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11g)
4-(3-(5-((4-异丙基哌嗪-1-基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11h)
4-(3-(5-((2-(羟基甲基)哌啶-1-基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11i)
1-((5-(6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)呋喃-2-基)甲基)哌啶-3-甲酰胺(11j)
4-(3-(5–(((2-羟基乙基)(甲基)氨基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11k)
2-氟-4-(3-(5-甲基呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11l)
2-(4-(3-(5-甲基呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯基)丙-2-醇(11m)
4-(3-(5-甲基呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯甲腈(11n)
更具体地，本发明通式(ⅲ)结构的优选化合物选自：
6-(4-氟苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18a)
6-(3,4-二氟苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18b)
6-(3,5-二氟苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18c)
6-(4-氯苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18d)
6-(4-氨基苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18e)
6-(4-氨基-3-氟-苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18f)
2-(4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯基)丙-2-醇(18g)
4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯甲腈(18h)
2-氟-4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(18i)
2，6-二氟-4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(18j)
4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(18k)
2-(4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯基)丙-2-醇(18l)
2-氟-4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(18m)
本发明的另一个目的是提供上述吡唑并[3,4-b]吡啶类化合物的制备方法，可以通过以下步骤实现：
合成方案1反应式：
r1，r2，r3，r4分别如通式(ii)所述；
2，6-二氯吡啶(1)与取代的糠醛(2)在正丁基锂，n,n-二异丙基乙胺作用下反应生成化合物3，3经二氧化锰氧化后生成酮类化合物4，化合物4与水合肼环化成结构通式为吡唑并[3,4-b]吡啶类化合物5，再经boc2o保护形成化合物6，最后在合适的钯催化剂三(二亚苄基丙酮)二钯-氯仿加合物(pd2(dba)3-chcl3)作用下与取代的芳基硼酸类化合物7经suzuki偶联反应生成化合物8，8经nbs溴代之后生成化合物9，9与亲核试剂发生亲核取代反应生成化合物10，10再经三氟乙酸脱保护后生成目标化合物11，即通式(ⅱ)定义的化合物。
合成方案2反应式：
r1，r2，r3，r4，r5分别如通式(iii)中所述；
2，6-二氯吡啶(1)与取代的苯甲醛(12)在正丁基锂，二异丙胺作用下反应生成化合物13，13经过二氧化锰氧化后生成酮类化合物14，化合物14与水合肼环化成结构通式为吡唑并[3,4-b]吡啶类化合物15，再经boc2o保护形成化合物16，最后在合适的钯催化剂三(二亚苄基丙酮)二钯-氯仿加合物(pd2(dba)3-chcl3)作用下与取代的芳基硼酸类化合物7经suzuki偶联反应生成化合物17，再经三氟乙酸脱保护生成目标化合物18，即通式(ⅲ)定义的化合物。
本发明的再一个目的是提供所述吡唑并[3,4-b]吡啶类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。药理研究证实，本发明提供的这类化合物可用来抑制alk激酶的活性，也可以用来治疗癌症。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明。以下的实施例是说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。
制备实施例1(2,6-二氯吡啶-3-基)(5-甲基呋喃基)甲醇(3a)
在二口圆底烧瓶中，加入二异丙胺(3.4ml,24mmol)和无水四氢呋喃，冷却至-78℃，缓慢滴加的n-buli(1.6minhexane)(13.8ml,22mmol)。搅拌30分钟后，将2,6-二氯吡啶(2.9g,20mmol)溶于无水四氢呋喃中缓慢加入烧瓶中，滴加完后在-78℃下搅拌2h。随后将5-甲基糠醛(2.6g,24mmol)溶于无水四氢呋喃中缓慢滴加入烧瓶中，滴加完后，关闭制冷，搅拌过夜。反应完毕后，加入饱和氯化铵溶液淬灭，浓缩后，加水，使用乙酸乙酯提取三次，合并有机相，使用饱和氯化钠溶液洗涤两次，无水硫酸钠干燥，浓缩后柱层析得黄色液体3a，收率91％。
制备实施2(2,6-二氯吡啶-3-基)(5-甲基呋喃基)甲酮的合成(4a)
在单口圆底烧瓶中，将上步产物3a(4.9g,19mmol)溶于无水二氯甲烷中，加入活性二氧化锰(8.3g,95mmol)后，室温搅拌24h。经tlc监测反应进度，反应完全后，反应液经硅藻土除去二氧化锰，用二氯甲烷洗涤，旋干溶剂后经柱层析得黄色固体4a，收率95％。
制备实施例36-氯-3-(5-甲基呋喃基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡唑(5a)
在单口圆底烧瓶中，将上步产物4a(4.9g,19mmol)溶于乙醇和四氢呋喃的混合溶剂中，冷却至0℃，滴加二异丙基乙胺(2.5g,19mmol)，随后滴加水合肼(1.04ml,21mmol)，升至室温，随后加热至70℃搅拌过夜。反应完全后，冷却至室温，将溶剂浓缩后加入水，用乙酸乙酯提取三次，合并有机相后，用饱和氯化钠溶液洗涤两次，无水硫酸镁干燥，旋干溶剂后经柱层析得黄色固体5a，收率97％。
制备实施例46-氯-3-(5-甲基呋喃基)吡唑并[3,4-b]吡啶-1-甲酸叔丁酯(6a)
在二口圆底烧瓶中，分别加入上步产物5a(2.1g,9mmol)，dmap(110mg,0.9mmol)，加入三乙胺(3.8ml,27mmol)，将boc2o(3g,27mmol)溶解于二氯甲烷中，加入反应瓶中，45℃下回流搅拌过夜。反应完全后，直接加入二氯甲烷，经饱和氯化钠洗涤三次，无水硫酸镁干燥，旋干二氯甲烷，柱层析得淡黄色固体6a，收率94％。
制备实施例53-(5-甲基呋喃基)-6-(4-((四氢-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)-吡唑并[3,4-b]吡啶-1-羧酸叔丁酯(8a)
在二口圆底烧瓶中分别加入上步产物6a(333.5mg,1mmol)，4-((四氢-2h-吡喃-2-基)氧基)苯硼酸(444mg,2mmol)，pd2(dba)3(40mg,0.05mmol)，p(t-bu)3hbf4(50mg,0.2mmol)，碳酸铯(978mg,3mmol)，加入二氧六环5ml，水0.5ml，在100℃下回流搅拌过夜。经tlc监测反应进度，反应完全后，直接加入乙酸乙酯，用饱和氯化钠溶液洗涤三次后，无水硫酸镁干燥，旋干溶剂，柱层析得白色固体8a，收率71％。
制备实施例63-(5-(1-溴甲基)呋喃基)-6-(4-((四氢-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)-吡唑并[3,4-b]吡啶-1-羧酸叔丁酯的合成(9a)
在二口圆底烧瓶中，分别加入(100mg，0.21mmol)上步产物8a，溴代二酰亚胺(nbs)(38mg，0.21mmol)，偶氮二异丁腈(aibn)(3.6mg，0.021mmol)，氩气交换后，加入四氯化碳，加热回流2h。经tlc监测反应进度，反应完全后，直接旋干溶剂，得粗品9a。
制备实施例73-(5-(1-吗啡啉甲基)呋喃基)-6-(4-((四氢-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)-吡唑并[3,4-b]吡啶-1-羧酸叔丁酯(10a)
在单口圆底烧瓶中，将上步粗品产物(0.2mmol)溶于无水甲苯，使用加入吗啡啉(74ul，0.8mmol)，在70℃下加热7h。经tlc监测反应进度，反应完全后，旋干溶剂，经柱层析得无色粘稠液体10a，收率54％。
制备实施例83-(5-(1-吗啡啉甲基)呋喃基)-6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(11b)
在单口圆底烧瓶中，称取上步产物10a(57.8mg,0.1mmol)溶于无水二氯甲烷，加入三氟乙酸(tfa)(29ul,0.4mmol)，加热回流过夜。经tlc监测反应进度，反应完全后，加入饱和碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯萃取三次后，合并有机相，经无水硫酸镁干燥，柱层析得纯净黄色固体11b，收率87％。
m.p.>300℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.71(s,1h),9.91(s,1h),8.47(d,j＝8.8hz,1h),8.04(d,j＝8.8hz,2h),7.78(d,j＝8.4hz,1h),7.01(d,j＝3.2hz,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),6.51(d,j＝3.2hz,1h),3.63(s,2h),3.59(t,j＝4.4hz,3h),2.46(t,j＝4.4hz,3h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:159.11,156.13,152.67,151.58,147.64,135.43,130.74,129.39,128.73,115.69,114.07,110.92,109.63,107.87,66.19,54.38,52.80；hrms(esi)(m/z):calcdforc21h21n4o3(m+h+):377.1614；found:377.1613.
制备实施例94-(3-(5-甲基呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11a)
制备方法同制备实施例8，由8a与三氟乙酸在二氯甲烷中加热回流反应，柱层析得黄色固体11a，收率87％。
m.p.247-251℃；1hnmr(400mhz,acetone-d6),δ:8.51(d,j＝8.8hz,1h),8.31-8.09(m,2h),7.69(d,j＝8.8hz,1h),7.00-6.97(m,2h),6.88(d,j＝3.2hz,1h),6.24(dd,j1＝3.2hz,j2＝0.8hz,1h),2.43(s,3h)；13cnmr(acetone-d6,100mhz),δ:159.88,157.50,154.01,153.04,148.46,137.43,131.72,131.41,129.68,116.42,114.74,110.96,108.52,108.40,13.60；hrms(esi)(m/z):calcdforc17h14n3o2(m+h+):292.1086；found:292.1090.
制备实施例104-(3-(5-(哌啶-1-基甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11c)
制备方法同制备实施例7-8，由9a与哌啶反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得黄色固体11c，收率80％。
m.p.226-230℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.74(s,1h),9.90(s,1h),8.50(d,j＝8.0hz,1h),8.05(d,j＝8.4hz,2h),7.79(d,j＝8.8hz,1h),7.05(s,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),6.61(s,1h),3.79(s,2h),2.60(br,4h),1.59(br,4h),1.42(br,2h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:159.16,156.18,152.68,148.14,135.30,130.80,129.35,128.73,124.31.115.70,114.10,112.12,109.67,107.91,53.80,53.00,31.18,24.69.
制备实施例114-(3-(5-(吡咯烷-1-基甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11d)
制备方法同制备实施例7-8，由9a与吡咯烷反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得黄色固体11d，收率83％。
m.p.210-213℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.78(s,1h),9.92(s,1h),8.56-8.54(m,1h),8.05(d,j＝8.4hz,2h),7.79(d,j＝8.8hz,1h),7.06(d,j＝3.2hz,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),6.70(s,1h),4.20(s,2h),2.98(br,4h),1.84(br,4h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:159.18,156.24,152.68,148.67,135.14,130.93,129.32,128.74,124.31,115.71,114.15,112.73,109.69,107.86,53.00,49.94,31.19.
制备实施例124-(3-(5-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11e)
制备方法同制备实施例7-8，由9a与1-甲基哌嗪反应，并经三氟乙酸脱保护后柱层析得黄色固体11e，收率75％。
m.p.276-279℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.71(s,1h),9.93(s,1h),8.47(d,j＝8.8hz,1h),8.04(d,j＝8.8hz,2h),7.78(d,j＝8.8hz,1h),7.01(d,j＝3.2hz,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),6.50(d,j＝3.2hz,1h),3.65(s,2h),2.54(br,4h),2.42(br,3h),2.28(br,4h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:159.15,156.14,152.68,151.68,147.64,135.39,130.73,129.35,128.72,124.38,115.70,114.05,109.62,107.86,54.13,53.75,51.32,44.78.
制备实施例134-(3-(5-((二甲基氨基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11f)
制备方法同制备实施例7-8，由9a与二甲基胺反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得黄色固体11f，收率86％。
m.p.181-184℃；1hnmr(500mhz,dmso-d6),δ:13.69(s,1h),9.89(s,1h),8.47(d,j＝8.5hz,1h),8.04(d,j＝8.5hz,2h),7.78(d,j＝8.5hz,1h),7.00(d,j＝3.0hz,1h),6.91(d,j＝8.5hz,2h),6.49(d,j＝3.0hz,1h),3.58(s,2h),2.24(s,6h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:159.11,156.14,152.67,147.85,140.25,135.39,130.76,129.37,128.72,123.20,115.68,114.06,109.64,107.71,54.71,44.31.
制备实施例144-(3-(5-((2-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11g)
制备方法同制备实施例7-8，由9a与2-羟甲基吡咯烷反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得黄色固体11g，收率79％。
m.p.145-147℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.75(s,1h),9.92(s,1h),8.51(d,j＝8.4hz,1h),8.10(d,j＝7.8hz,1h),8.05(d,j＝8.4hz,2h),7.79(d,j＝8.8hz,1h),7.04(s,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),5.21-5.13(m,1h),3.51(s,2h),3.12(br,2h),2.33(br,2h),1.72-1.61(m,4h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:159.24,158.30,157.99,156.24,153.73,135.29,130.87,129.36,128.76,118.78,115.76,114.15,109.72,107.86,67.31,53.93,49.64,48.66,31.60,22.37.
制备实施例154-(3-(5-((4-异丙基哌嗪-1-基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11h)
制备方法同制备实施例7-8，由9a与1-异丙基哌嗪反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得黄色固体11h，收率75％。
m.p.184-187℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.73(s,1h),9.97(s,1h),8.48(d,j＝8.4hz,1h),8.05(d,j＝8.8hz,2h),7.78(d,j＝8.4hz,1h),7.04(d,j＝3.2hz,1h),6.91(d,j＝8.4hz,2h),6.53(d,j＝3.2hz,1h),3.92-3.83(m,1h),3.71(s,2h),3.16-2.32(m,8h),1.12(s,6h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:159.11,156.08,152.61,151.13,147.71,135.27,130.66,129.24,128.63,115.63,113.97,111.13,109.53,107.79,55.66,53.23,50.19,47.59,17.05；hrms(esi)(m/z):calcdforc24h28n5o2(m+h+):418.2243；found:418.2243.
制备实施例164-(3-(5-((2-(羟基甲基)哌啶-1-基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11i)
制备方法同制备实施例7-8，由9a与2-羟甲基哌啶反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得黄色固体11i，收率81％。
m.p.135-138℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.81(s,1h),10.07(s,1h),8.53(d,j＝8.8hz,1h),8.05(d,j＝8.8hz,2h),7.78(d,j＝8.4hz,1h),7.06(d,j＝3.2hz,1h),6.92(d,j＝8.8hz,2h),6.74(s,1h),6.18(s,1h),4.31(s,2h),3.74-3.72(m,1h),3.20-3.02(m,2h),2.84-2.67(m,2h),1.76-1.58(m,6h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:159.28,158.20,157.89,156.25,152.71,130.91,129.30,128.74,124.03,118.78,115.76,114.21,109.73,107.85,61.52,59.41,59.07,57.42,24.75,21.96,21.43.
制备实施例171-((5-(6-(4-羟基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)呋喃-2-基)甲基)哌啶-3-甲酰胺(11j)
制备方法同制备实施例7-8，由9a与哌啶-2-甲酰胺反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得黄色固体11j，收率75％。
m.p.192-195℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.74(s,1h),9.92(s,1h),8.51(s,1h),8.05(d,j＝8.8hz,2h),7.78(d,j＝8.8hz,1h),7.04(s,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),6.56(s,1h),3.67(s,2h),3.07-2.64(m,3h),2.33-1.99(m,2h),1.72-1.50(m,4h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:177.83,159.43,158.41,154.38,153.53,147.42,136.96,131.38,130.97,128.73,115.87,114.40,110.53,109.03,108.99,58.42,54.88,53.90,44.05,27.83,23.94.
制备实施例184-(3-(5–(((2-羟基乙基)(甲基)氨基)甲基)呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11k)
制备方法同制备实施例7-8，由9a与2-甲氨基乙醇反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得黄色固体11k，收率81％。
m.p.148-152℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.74(s,1h),9.95(s,1h),8.50(d,j＝8.8hz,1h),8.05(d,j＝8.8hz,2h),7.78(d,j＝8.8hz,1h),7.02(d,j＝3.2hz,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),6.58(d,j＝2.4hz,1h),3.87(s,2h),3.59-3.57(m,2h),3.16(s,1h),2.65(br,2h),2.38(s,3h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:159.24,156.22,153.47,152.72,148.19,135.39,130.85,129.37,128.75,115.75,114.13,111.95,109.71,107.77,58.04,53.07,48.67,41.66；hrms(esi)(m/z):calcdforc20h21n4o3(m+h+):365.1614；found:365.1609.
制备实施例192-氟-4-(3-(5-甲基呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(11l)
制备方法同制备实施例5，8，由6a与(3-氟-4-((四氢-2h-吡喃-2-基)氧基))苯硼酸经suzuki偶联反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得白色固体11l，收率80％。
m.p.210-213℃；1hnmr(400mhz,acetone-d6),δ:12.73(s,1h),9.03(s,1h),8.53(d,j＝8.4hz,1h),8.01(dd,j1＝12.8hz,j2＝2.0hz,1h),7.92(dd,j1＝8.4hz,j2＝1.2hz,1h),7.80(d,j＝8.4hz,1h),7.14(t,j＝8.8hz,1h),6.89(d,j＝3.2hz,1h),6.24(dd,j1＝2.8hz,j2＝0.8hz,1h),2.43(s,3h)；13cnmr(150mhz,acetone-d6),δ:156.24(d,j＝3hz),153.73(d,j＝79.5hz),153.22,151.87,148.43,147.28(d,j＝12hz),137.61,132.46(d,j＝6hz),132.05,124.64(d,j＝3hz),118.84,115.68(d,j＝21hz),114.85,111.45,108.74,108.50,13.67；hrms(esi)(m/z):calcdforc17h13fn3o2(m+h+):310.0992；found:310.0999.
制备实施例202-(4-(3-(5-甲基呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯基)丙-2-醇(11m)
制备方法同制备实施例5，8，由6a与4-(2-((四氢-2h-吡喃-2-基)氧基)丙-2-基)苯硼酸经suzuki偶联反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得白色固体11m，收率76％。
m.p.240-243℃；1hnmr(400mhz,cd3cl),δ:10.53(s,1h),8.53(d,j＝8.4hz,1h),8.23-8.21(m,2h),7.85-7.81(m,2h),7.71(d,j＝8.4hz,1h),6.89(d,j＝3.2hz,1h),6.20-6.19(m,1h),2.47(s,3h)；13cnmr(150mhz,dmso-d6),δ:153.72,152.38,152.10,146.23,142.76,135.75,132.82,131.54,127.92,118.72,115.05,111.82,110.91,108.53,107.89,13.40.
制备实施例214-(3-(5-甲基呋喃-2-基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯甲腈(11n)
制备方法同制备实施例5，8，由6a与4-氰基苯硼酸经suzuki偶联反应，并经三氟乙酸脱保护后，柱层析得黄色固体11n，收率82％。
m.p.240-243℃；1hnmr(400mhz,cd3cl),δ:10.53(s,1h),8.53(d,j＝8.4hz,1h),8.23-8.21(m,2h),7.85-7.81(m,2h),7.71(d,j＝8.4hz,1h),6.89(d,j＝3.2hz,1h),6.20-6.19(m,1h),2.47(s,3h)；13cnmr(150mhz,dmso-d6),δ:153.72,152.38,152.10,146.23,142.76,135.75,132.82,131.54,127.92,118.72,115.05,111.82,110.91,108.53,107.89,13.40.
制备实施例226-(4-氟苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18a)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得黄色固体18a，收率73％。
m.p.259-262℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.67(s,1h),8.59(d,j＝8.4hz,1h),8.27-8.23(m,2h),7.95-7.93(m,2h),7.84(d,j＝8.4hz,1h),7.40-7.35(m,2h),7.14(s,2h),3.52(br,4h),3.18(br,4h),2.67(br,1h),1.23(s,6h).
制备实施例236-(3,4-二氟苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18b)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得黄色固体18b，收率75％。
m.p.251-254℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.69(s,1h),8.61(d,j＝8.4hz,1h),8.26-8.21(m,1h),8.10-8.07(m,1h),7.91-7.87(m,3h),7.64-7.57(m,1h),7.09-7.06(m,2h),3.22(t,j＝4.8hz,4h),2.72-2.66-8.07(m,1h),2.60(t,j＝4.8hz,4h),1.02(d,j＝6.8hz,6h).
制备实施例246-(3,5-二氟苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18c)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得黄色固体18c，收率77％。
m.p.238-241℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.75(s,1h),8.63(d,j＝8.8hz,1h),7.96-7.91(m,5h),7.42-7.36(m,1h),7.10(s,2h),3.98(br,1h),3.20(br,4h),2.61(br,4h),1.04(br,6h).
制备实施例256-(4-氯苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18d)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得黄色固体18d，收率70％。
m.p.249-252℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.67(s,1h),8.60(d,j＝8.4hz,1h),8.22(d,j＝8.0hz,2h),7.92-7.84(m,3h),7.61(d,j＝8.0hz,2h),7.10(s,2h),3.21(br,4h),2.61(br,4h),1.23(s,6h).
制备实施例266-(4-氨基苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18e)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得黄色固体18e，收率72％。
m.p.271-274℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.37(s,1h),8.41(d,j＝8.8hz,1h),7.92-7.86(m,4h),7.64(d,j＝8.8hz,1h),7.06(d,j＝8.0hz,2h),6.67(d,j＝8.8hz,2h),5.55(s,2h),3.21(br,4h),2.63(br,5h),1.05(s,6h)；hrms(esi)(m/z):calcdforc25h29n6(m+h+):413.2454；found:413.2448.
制备实施例276-(4-氨基-3-氟-苯基)-3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶(18f)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得黄色固体18f，收率70％。
m.p.269-272℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.45(s,1h),8.44(d,j＝8.0hz,1h),7.87-7.69(m,5h),7.05(d,j＝6.8hz,2h),6.87(t,j＝8.0hz,1h),5.62(s,2h),3.20(br,4h),2.62(br,5h),1.03(s,6h).
制备实施例282-(4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯基)丙-2-醇(18g)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得黄色固体18g，收率81％。
m.p.221-224℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.59(s,1h),8.55(d,j＝8.4hz,1h),8.12(d,j＝8.0hz,2h),7.89(d,j＝8.4hz,2h),7.80(d,j＝8.4hz,1h),7.62(d,j＝8.0hz,2h),7.07(d,j＝8.4hz,2h),5.11(s,1h),3.21(br,4h),2.74-2.66(m,1h),2.60(br,4h),1.48(s,6h),1.12(d,j＝6.4hz,6h)；13cnmr(150mhz,dmso-d6),δ:174.68,155.20,151.93,140.46,137.94,131.17,127.17,126.60,125.08,123.43,122.35,118.22,116.74,115.22,70.65,53.68,48.22,48.04,31.85,18.26.
制备实施例294-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯甲腈(18h)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得黄色固体18h，收率85％。
m.p.253-257℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.75(s,1h),8.65(d,j＝8.4hz,1h),8.40-8.38(m,2h),8.02-8.00(m,2h),7.95-7.90(m,3h),7.08(d,j＝8.4hz,2h),3.21(br,4h),2.67(br,1h),2.60(br,4h),1.02(d,j＝5.2hz,6h)；13cnmr(150mhz,dmso-d6),δ:153.06,150.94,149.62,142.89,132.83,131.75,127.87,127.27,118.75,115.24,114.64,117.71,111.63,53.68,48.14,48.01,18.22.
制备实施例302-氟-4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(18i)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得黄色固体18i，收率80％。
m.p.284-287℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.53(s,1h),10.30(s,1h),8.51(d,j＝8.4hz,1h),7.98(d,j＝13.2hz,1h),7.88(d,j＝8.4hz,3h),7.76(d,j＝8.4hz,1h),7.11-7.05(m,3h),3.22(br,4h),2.72(br,1h),2.63(br,4h),1.04(d,j＝5.2hz,6h)；13cnmr(150mhz,dmso-d6),δ:154.05,153.10,152.05,150.45,146.35,131.16,130.30,127.18,123.55,117.93,115.25,114.53,113.51,110.55,54.90,47.98,18.18；hrms(esi)(m/z):calcdforc25h27fn5o(m+h+):432.2200；found:432.2204.
制备实施例312，6-二氟-4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(18j)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得棕色固体18j，收率78％。
m.p.>300℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.68(s,1h),10.79(s,1h),8.56(d,j＝8.4hz,1h),7.96-7.90(m,4h),7.86(d,j＝8.4hz,1h),7.15(d,j＝8.4hz,2h),3.90(br,1h),3.47(br,4h),3.17(br,4h),1.31(d,j＝5.6hz,6h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6),δ:154.33,153.71,152.89,152.85,143.25,142.60,131.34,127.31,115.90,113.70,110.90,110.48,99.49,56.78,47.35,16.52.
制备实施例324-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(18k)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得棕色固体18k，收率85％。
m.p.215-218℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.42(s,1h),9.82(s,1h),8.12(d,j＝8.4hz,1h),8.02(d,j＝8.8hz,2h),7.64(d,j＝8.8hz,1h),7.48(d,j＝8.4hz,1h),6.91(d,j＝8.8hz,2h),6.69(d,j＝1.6hz,1h),6.64-6.61(m,1h),3.83(s,3h),3.27(br,4h),2.67(br,5h),1.06(d,j＝5.2hz,6h)；13cnmr(150mhz,dmso-d6),δ:158.79,157.43,155.14,152.88,141.73,132.21,130.66,129.73,128.50,115.58,112.82,112.07,107.32,98.94,55.19,47.95,18.04；hrms(esi)(m/z):calcdforc26h30n5o2(m+h+):444.2400；found:444.2403.
制备实施例332-(4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯基)丙-2-醇(18l)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得白色固体18l，收率80％。
m.p.267-271℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.54(s,1h),8.18(d,j＝8.4hz,1h),8.10(d,j＝8.4hz,2h),7.73(d,j＝8.4hz,1h),7.61(d,j＝8.0hz,2h),7.49(d,j＝8.4hz,1h),6.69(s,1h),6.62(d,j＝8.4hz,1h),5.10(s,1h),3.84(s,3h),3.25(br,4h),2.72(br,1h),2.64(br,4h),1.48(s,6h),1.03(d,j＝6.0hz,6h)；13cnmr(150mhz,dmso-d6),δ:157.45,155.01,152.86,152.67,151.77,136.60,132.44,130.69,128.03,126.56,125.05,113.47,112.65,107.29,98.85,70.65,55.19,53.87,48.01,31.85,18.15.
制备实施例342-氟-4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯酚(18m)
制备方法同制备实施例1-8，柱层析得黄色固体18m，收率78％。
m.p.219-222℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.48(s,1h),10.30(s,1h),8.14(d,j＝8.4hz,1h),7.95(dd,j1＝13.2hz,j2＝2.0hz,1h),7.87-7.84(m,1h),7.69(d,j＝8.8hz,1h),7.48(d,j＝8.4hz,1h),7.08(t,j＝8.8hz,1h),6.69(s,1h),6.63(d,j＝8.4hz,1h),3.83(s,3h),3.28(br,4h),2.67(br,5h),1.06(d,j＝4.0hz,6h)；13cnmr(150mhz,dmso-d6),δ:157.45,153.82,150.46,146.30,132.43,130.68,130.53,130.49,123.47,117.92,114.47,112.92,107.35,98.75,55.21,53.73,51.17,47.95,18.00；hrms(esi)(m/z):calcdforc26h29fn5o2(m+h+):462.2305；found:462.2310.
制备实施例352-氟-4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)乙酸苯酯(18n)
制备方法由18i与乙酰氯，三乙胺在四氢呋喃中反应，反应完全后加水，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗两次，无水硫酸镁干燥，旋干溶剂，柱层析得黄色固体18n，收率73％。
m.p.195-198℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.71(s,1h),8.62(d,j＝8.0hz,1h),8.17(dd,j1＝11.6hz,j2＝1.6hz,1h),8.10(d,j＝8.4hz,1h),7.91(dd,j1＝8.4hz,j2＝4.4hz,3h),7.48(t,j＝8.0hz,1h),7.09(d,j＝8.4hz,2h),3.22(s,4h),2.67(s,1h),2.61(s,4h),2.38(s,3h),1.03(m,6h).
制备实施例362-氟-4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯基甲基碳酸酯(18o)
制备方法同制备实施例35，由18i与氯甲酸甲酯反应，柱层析得黄色固体18o，收率70％。
m.p.213-216℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.71(s,1h),8.62(d,j＝8.4hz,1h),8.20(d,j＝11.2hz,1h),8.11(d,j＝8.0hz,1h),7.90(d,j＝7.6hz,3h),7.60(t,j＝8.4hz,1h),7.07(d,j＝7.6hz,2h),3.91(s,3h),3.21(s,4h),2.60(s,5h),1.02(s,6h).
制备实施例372-氟-4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)烟酸苯酯(18p)
制备方法同制备实施例35，由18i与烟酰氯反应，柱层析得黄色固体18p，收率60％。
m.p.223-226℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.74(s,1h),9.33(s,1h),8.97(d,j＝4.0hz,1h),8.65(d,j＝8.4hz,1h),8.55(d,j＝8.0hz,1h),8.26(d,j＝12.0hz,1h),8.18(d,j＝8.4hz,1h),7.94(t,j＝7.6hz,3h),7.70(q,j1＝8.9hz,j2＝7.4hz,2h),7.10(d,j＝8.4hz,2h),3.22(s,4h),2.62(s,5h),1.05(s,6h).
制备实施例382-氟-4-(3-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)苯基)-1h-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-基)苯基哌啶基-1-碳酸酯(18q)
制备方法同制备实施例35，由18i与哌啶基甲酰氯反应，柱层析得黄色固体18q，收率70％。
m.p.262-272℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6),δ:13.66(s,1h),8.60(d,j＝8.4hz,1h),8.12(d,j＝12.0hz,1h),8.05(d,j＝7.6hz,1h),7.89(t,j＝7.6hz,3h),7.45(t,j＝8.4hz,1h),7.08(d,j＝8.4hz,2h),3.61(s,2h),3.44(s,2h),3.22(s,4h),2.60(s,5h),1.61(s,6h),1.02(d,j＝6.4hz,6h).
生物实验实施例：吡唑并[3,4-b]吡啶类衍生物对alk的抑制活性测试
我们使用基于tr-fret技术的lanthascreentm激酶实验来测定候选化合物的激酶抑制活性。所有实验都在384孔板上进行。在酶反应开始之前先制备4组不同浓度的待测化合物溶液。先后在50mmhepes(ph7.5)，0.01％brij-35，10mmmgcl2，4mmmncl2，1mmegta和2mmdtt4中制备4组重组人类alk蛋白和2组底物/atp混合物。最终10ul的激酶反应包括5μl1×底物/atp混合物(0.2μm底物和5μmatp)，2.5μl的alk蛋白(5ng/ml)和2.5μl具有所需浓度的1×待测化合物组成。将测定板在振荡器上摇动30秒以充分混合反应物。在室温(20–25℃)下激酶反应保温1小时后，然后加入10μl预先制备的由20mmedta和4nmtb标记的抗体溶液以终止激酶反应并引发抗体结合，将测定板在室温下再温育1小时。随后，将测定板置于荧光板读数器(bioteksynergytm4)中，以100μs的延迟时间和200μs积分测量荧光素和铽发射信号(激发：340nm；发射：分别为520和495nm)时间。最后，由tr-fret发射比(即荧光素发射强度/铽发射强度)计算的所得抑制活性相对于抑制剂的浓度作图，并将数据拟合为具有可变斜率的浓度—响应曲线，从曲线中计算ic50值，实验结果见表1。
表1吡唑并[3,4-b]吡啶类衍生物的alk抑制活性
由表1可知，以目前已经上市的alk激酶抑制剂克唑替尼(crizotinib)和色瑞替尼(ldk-378)作为阳性对照，该类全新结构的化合物中有部分化合物表现出了较好的alk抑制活性，其中化合物18i的激酶ic50达到了1.58nm，超过阳性对照克唑替尼和色瑞替尼，为制备癌症治疗药物的研究提供了新的依据。