水稻OsMKK4突变蛋白及其编码基因与应用的制作方法

文档序号：14983718发布日期：2018-07-20 20:39阅读：512来源：国知局

本发明涉及基因工程及遗传育种领域，具体地说，涉及水稻osmkk4突变蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

水稻是世界上重要的粮食作物之一。随着耕地面积的减少和人口的快速增长，提高水稻产量对保证我国粮食安全具有十分重要的意义。水稻产量是由有效分蘖数、穗粒数和粒型所决定。水稻粒型包括籽粒的长度、宽度和厚度。通过增加水稻籽粒的长度和宽度可以有效的提高水稻产量。目前，水稻中已经发现了一些与粒型相关的基因，例如：gs3，gw2，gw5，gs5，gw8，gl7基因等。

osmkk4蛋白属于促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein-kinase,mapk)级联途径中的一个蛋白激酶，该级联途径包括三种蛋白激酶：即mapkk、mapkk和mapk。它们以逐级磷酸化的方式放大信号,并将信号向下传递给靶蛋白，参与植物生长发育的多个过程。在前期的研究工作中，我们发现osmkk4缺失功能会导致水稻的籽粒变小(smallgrain1,whichencodesamitogen-activatedproteinkinasekinase4,influencesgrainsizeinrice.plantj.2014，77(4):547-57.)。然而osmkk4的功能活性位点及其在调控水稻籽粒性状中的研究和应用仍然没有报道。

目前对水稻突变体的研究大多局限于形态学和生理学特征的描述，从突变体出发，直接鉴定和克隆的功能基因和突变基因还很少。因此，发现水稻粒形性状突变体并对其相关基因进行深入研究，对于最终阐明水稻籽粒发育的调控网络，以期真正从分子水平改良水稻产量及品质具有重要意义。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供水稻osmkk4突变蛋白及其编码基因与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供水稻osmkk4突变蛋白，所述osmkk4突变蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：

1)如seqidno.1所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列为野生型osmkk4蛋白的第227位丙氨酸突变为苏氨酸；

2)如seqidno.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有与所述osmkk4突变蛋白相同功能的氨基酸序列。

进一步地，本发明提供编码水稻osmkk4突变蛋白的基因。

具体地，所述基因具有以下任意一种核苷酸序列：

1)如seqidno.2所示的核苷酸序列；

2)如seqidno.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失得到的编码与所述osmkk4突变蛋白相同功能蛋白的核苷酸序列；

3)在严格条件下，能够与1)或2)所述的核苷酸序列杂交且编码与所述osmkk4突变蛋白相同功能蛋白的核苷酸序列。

seqidno.2所示的核苷酸序列是如seqidno.3所示的水稻osmkk4基因的第679位碱基由g突变为a而得。

更进一步地，本发明还提供了含有所述基因的载体，以及含有所述基因或所述载体的宿主细胞。

在本发明的具体实施方式中，使用的载体为pmdc99，使用的宿主细胞为大肠杆菌细胞和农杆菌细胞。

本领域技术人员应当理解，虽然本发明在具体实施方式中以上述载体和宿主为例进行示例性说明，但并不代表载体和宿主的选择仅限于此。随着科技发展，所述载体和宿主细胞的选择也许会发生变化，或在非转基因目的的应用领域，也同样涉及载体和宿主细胞的利用，但只要含有本发明所述基因或本发明所述的载体，均在本发明的保护范围之内。

本发明通过实验发现，转化osmkk4突变蛋白的水稻的籽粒长度较野生型相比提高了33％，因此，本发明提供的osmkk4突变蛋白具有提高水稻籽粒长度的功能。水稻籽粒长度决定了水稻的籽粒大小和粒重，并进一步地影响水稻的产量，鉴于此，本发明还提供了所述水稻osmkk4突变蛋白、其编码基因及含有所述基因的载体在提高植物籽粒长度、籽粒大小和/或重量、以及植物产量中的应用。

最后，本发明提供了所述水稻osmkk4突变蛋白在制备转基因植物中的应用。

转基因植物的制备为本领域常规技术手段，本发明不另作限定，利用本发明所述基因进行水稻转基因育种的技术方案均在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果在于：

本发明发现了水稻osmkk4突变蛋白及其编码基因，并通过试验验证了所述osmkk4突变蛋白具有提高籽粒大小的功能，转化osmkk4突变蛋白的水稻的籽粒长度较野生型相比提高了33％，从而可以提高水稻的产量和品质。本发明提供的技术方案为水稻的选育和转基因水稻的制备提供了新的方向，且通过构建转化所述osmkk4突变蛋白编码基因的转基因水稻，能够有利于水稻的产量的提高。

附图说明

图1为水稻品种中花11(野生型)的籽粒(左侧两个)以及转化osmkk4突变蛋白编码基因的水稻品种中花11的籽粒(右侧两个)，图中标尺为1mm。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的pmdc99(agatewaycloningvectorsetforhigh-throughputfunctionalanalysisofgenesinplanta.plantphysiol.2003,133:462-469)，实施例中的水稻品种中花11(朱旭东，陈红旗，罗达，张建军，方红民，闵绍楷。水稻中花11辐射突变体的分离与鉴定。中国水稻科学，2003，17(3):205-210)，实施例中根癌农杆菌gv3101(controloffinalseedandorgansizebytheda1genefamilyinarabidopsisthaliana.genesdev2008,22,1331-1336)，以及水稻材料large11-1d(发明人通过筛选突变体获得)，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1水稻突变体的筛选与获得

1、水稻突变体库及m1、m2代种植与性状观察

通过叠氮化钠诱变处理野生型空育131种子，种植后单株收取m1种子，得到m2。每一株m1得到的m2种植24株。田间观察筛选到1个籽粒变大的显性突变体命名为水稻突变体large11-1d。

2、osmkk4突变体获得

对获得的水稻突变体large11-1d进行重测序，基因克隆及序列比对分析显示，导致水稻突变体large11-1d籽粒变大的目标基因为osmkk4。，重测序及克隆基因的方法按照已有报道进行(genomesequencingrevealsagronomicallyimportantlociinriceusingmutmap.natbiotechnol.2012jan22；30(2):174-8.doi:10.1038/nbt.2095.)。osmkk4基因的一个碱基改变导致其编码蛋白的227位的氨基酸从丙氨酸突变为苏氨酸，从而导致水稻籽粒变大。

实施例2水稻osmkk4突变蛋白osmkk4^a227t编码基因的扩增

液氮研碎水稻中花11和水稻突变体large11-1d的叶片，用植物总rna提取试剂盒(tiangen)，提取总rna。将得到的总rna用分光光度计(eppendorf公司,德国)检测样品中总rna的浓度。

根据rap-db(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)上的osmkk4基因序列设计一对引物如下：

seqidno.4：gosmkk4-f：cgggccccccctcgaggcgcgcccacagtgtgtcttggagcccgctgc

seqidno.5：gosmkk4-r：accatgattacgaattcgagctctacagcatcaccacattgatgg

取5μg总rna，用反转录试剂盒(invitrogen)进行反转录，分别以水稻中花11和水稻突变体large11-1d反转录得到的cdna为模板，用引物对gosmkk4-f和gosmkk4-r进行pcr扩增，对pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为4600bp的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(tiangen)回收该片段，经测序分析，确定片段分别为osmkk4野生型基因和osmkk4突变蛋白osmkk4^a227t编码基因。

实施例3osmkk4^a227t编码基因表达载体的构建

采用无缝克隆试剂盒(tiangen)将实施例1中回收的osmkk4^a227t编码基因与pmdc99做无缝克隆连接，将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，根据载体上的壮观霉素抗性标记筛选阳性克隆，经pcr鉴定和测序分析验证，确认得到含有osmkk4^a227t编码基因的重组质粒，命名为pmdc99-osmkk4^a227t。

将pmdc99-osmkk4^a227t导入根癌农杆菌gv3101，得到含有pmdc99-osmkk4^a227t的重组根癌农杆菌菌株，将得到的菌株命名为gv3101-osmkk4^a227t。

gv3101-osmkk4的构建方法同gv3101-osmkk4^a227t。

实施例4转基因植株的获得

用gv3101-osmkk4^a227t转化水稻品种中花11，获得转gv3101-osmkk4^a227t的转基因植株。具体操作如下：

1、水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养

去壳的水稻成熟种子先用70％乙醇浸泡1-2min，然后用0.1％升汞浸泡10min，进行表面灭菌，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织共培养。

2、农杆菌的培养

将gv3101-osmkk4^a227t在含有50mg/l壮观霉素的lb平板上划线,28℃黑暗培养3天,用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养cm液体培养基中,调整菌体浓度至od600为0.3-0.5,加入乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮终浓度为100mm,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

3、水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

挑选状态较好(继代培养5-7天、色泽淡黄)的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中,加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可),室温放置20min,并不时晃动。倒掉菌液,将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养2-3天。

4、抗性愈伤组织的筛选

将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。

5、抗性愈伤组织的分化

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/l潮霉素的分化培养基上,先暗培养3天,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。

6、生根、壮苗和移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时,将小苗移到生根培养基上,培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，移栽至田间。分别得到30株t0代转osmkk4^a227t基因的植株。

其中，所用的培养基配方如下：

诱导培养基：n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+b5有机+2,4-d2.5mg/l+proline500mg/l+glutamine500mg/l+ch300mg/l+麦芽糖/蔗糖30g/l+gelrite2.6mg/l，ph5.8。

继代培养基：同诱导培养基，但是2,4-d改为2.0mg/l。

共培养(固体)培养基：n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+b5有机+2,4-d2.0mg/l+ch500mg/l+肌醇2000mg/l+as100μm+麦芽糖/蔗糖30g/l+gelrite2.6mg/l，ph5.5。(液体选择培养基无gelrite)。

筛选培养基：n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+b5有机+2,4-d2.0mg/l+proline500mg/l+glutamine500mg/l+ch300mg/l+麦芽糖/蔗糖30g/l+gelrite2.6mg/l+cef250mg/l+hyg50mg/l，ph5.8。

分化培养基：n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+b5有机+naa0.1mg/l+kt4mg/l+proline500mg/l+glutamine500mg/l+ch300mg/l+麦芽糖/蔗糖30g/l+gelrite2.6mg/l+cef.250mg/l+hyg50mg/l，ph5.8。

生根培养基：1/2n6大量元素+ms-fe盐+b5微量元素+蔗糖30g/l+agar0.8％，ph5.8。

7、转osmkk4^a227t基因植株的鉴定

分别将步骤6得到的30株t0代转osmkk4^a227t基因的植株通过pcr来进一步鉴定。以新鲜的转基因植株叶片的基因组dna为模板，用潮霉素引物对hyg-f/hyg-r进行pcr扩增。转基因植株可以扩增出324bp条带。

seqidno.6：hyg-f：gtccatcacagtttgccagt

seqidno.7：hyg-r：agatcgttatgtttatcggcact

osmkk4野生型基因转基因植株的获得同osmkk4^a227t。

实施例5转基因植株的表型鉴定

将实施例中步骤6得到的t0代转基因植株和作为转基因受体的水稻品种中花11在田间自然条件下生长，成熟后收取转基因植株和野生型对照中花11的籽粒，放在体式镜(leicas8apo,德国)下观察并拍照(leicadfc420，德国)。用imagej1.41软件测量籽粒的长度，利用excel进行统计分析，结果如表1和图1所示。

表1.转osmkk4^a227t基因基因植物的表型统计(**代表与野生型相比有显著差异)

结果表明，与野生型对照相比，转osmkk4^a227t基因植株的籽粒长度提高了33％。转化osmkk4^a227t突变体能够显著提高水稻籽粒的长度。

而过表达野生型osmkk4仅能够稍微增加籽粒的大小，尽管显著性测验为显著。结果如表2所示。

表2.转野生型osmkk4基因植物的表型统计(**代表与野生型相比有显著差异)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>水稻osmkk4突变蛋白及其编码基因与应用

<130>khp181112211.8

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>369

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metargproglyglyproproserleuargalaglyleuglnglngln

151015

glnglnglnglnproglythrproglyargserargargargproasp

202530

leuthrleuproleuproglnargaspleuthrserleualavalpro

354045

leuproleuproleuproproserseralaproserserthrserser

505560

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65707580

glyseralaproproalaproproproleusergluleugluargval

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100105110

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progluphelysserpheilesercyscysleuglnlysasnproala

325330335

argargproseralaalaglnleuleuglnhisargphevalalagly

340345350

proglnglnglnglnglnproglnproglnproleualapropropro

355360365

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<211>1110

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gacctcacgtcgctcgcggtgccgctgccgctgccgctgccgccgtcgtcggcgccgtcg180

tcgacgtcgtcgtccgggtcgtcctcgctcggcggcgtgcccaccccgccgaattcggtc240

ggctccgcgccgccggccccgccgccgctgtcggagctggagcgcgtccgccgcatcggg300

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<210>3

<211>1110

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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