本发明属于分子生物学领域，涉及一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建及接种方法。
背景技术：
：：柑桔衰退病毒(citrustristezavirus,ctv)是对世界柑桔生产具有严重危害的一种病原物。目前世界柑桔产量第二的巴西，曾一度因ctv为害而使其柑桔业濒临崩溃。迄今为止，ctv毁灭的柑桔树达1亿株以上，并且依然威胁着世界上以酸橙为砧木的柑桔和对ctv茎陷点型株系敏感的葡萄柚、柚和某些甜橙等品种(系)的生产。在我国，ctv分布较为普遍，初步鉴定表明株系分布亦很广泛。但由于我国宽皮柑桔和甜橙生产上常用的砧木枳、酸桔、红桔、红黎檬、枸头橙等多抗病或耐病而未造成严重为害。个别地区如云南宾川、建水等由于使用了感病的香橼作砧木而导致柑桔植株大量死亡。ctv能够侵染柑桔属绝大多数种、栽培种和杂交种，还可侵染柑桔属一些近缘属植物。ctv可以通过包含韧皮部的组织嫁接传播，在田间由桔蚜、棉蚜、桔二叉蚜和绣线菊蚜等蚜虫以非循环半持久方式进行传播。此外，ctv还可以通过菟丝子传播。在人工接种条件下ctv可侵染本生烟。ctv是甲型长线形病毒科，长线形病毒属的一种正义单链单分体rna病毒，是目前已知最大的植物病毒(karasevetal.，1995)。其基因组为19226-19296nt的正义单链rna，包装于2000×11nm的螺旋对称的线形病毒粒体当中，螺距3.5-3.7nm，每圈螺旋由8.5-10个外壳蛋白亚基构成。对t385序列分析表明，ctv基因组包含12个开放读码框(orf1a、orf1b、orf2-orf11)以及5’非转译区(5’utr)、3’非转译区(3’utr)。侵染性克隆不仅为病毒研究提供背景单一而可靠的遗传材料，还可用于研究病毒的移动、复制及其致病机理，同时还为深入研究病毒与寄主互作机制、进行病毒载体化改造和应用奠定坚实的基础。然而，病毒全长cdna侵染性克隆的构建技术性较强，构建工作难度大。由于ctv是最大的植物病毒，目前为止，仅有一个t36型ctv分离株获得了侵染性克隆，该克隆采用传统的酶切连接法构建，费时费力且成功率极低。同时，该克隆必须首先接种本生烟，2个月左右后提取病毒粒子才能够接种和侵染柑桔，侵染周期长，侵染率较低，也限制了该克隆的应用。此外，有研究表明，利用大肠杆菌构建较大基因组rna病毒全长cdna克隆时，由于其自身编码的病毒蛋白可能会对宿主菌产生毒性作用，从而导致非特异性重组，出现不稳定现象。这成为病毒侵染性克隆构建面临的最大困难和挑战。病毒全长基因组克隆在e.coli中存在的不稳定现象的机制仍不清楚。通常利用以下几个方法解决：将病毒序列分段克隆，侵染前再短暂的连接；或利用拷贝数目较低的载体；或是调控细菌生长的环境(如降低培养温度等)来减少毒性；也有利用插入内含子到病毒全基因组序列中来避免产生具有毒性的蛋白。但这些方法均耗时耗力且成功率低。在前期的尝试中，利用大肠杆菌作宿主绝大多数ctv分离株都未能获得侵染性克隆，猜测可能与前述不稳定性有关。酵母转化伴随的同源重组(tar)是一种利用酵母高效同源重组系统来实现多个相互存在同源序列的dna片段组装方法。youssef等(yousseff,maraisa,faurec,gentitp,candresset.strategiestofacilitatethedevelopmentofunclonedorclonedinfectiousfull-lengthviralcdnas:applechloroticleafspotvirusasacasestudy.virologyjournal,2011,8(1):1-12)在构建苹果褪绿叶斑病毒(applechloroticleafspotvirus,aclsv)时，从36个经限制性内切酶酶切正确的e.coli克隆中仅鉴定出1个有侵染性的克隆，表明aclsv克隆在e.coli细胞存在着不稳定性，但经酵母tar技术获重组克隆后，直接通过农杆菌介导接种获得了稳定的aclsv的侵染性克隆。庹德财等(庹德财,沈文涛,言普,黎小瑛,周鹏.一种e.coli-free的酵母同源重组系统稳定快速构建pldmv侵染性克隆的新方法.热带作物学报,2017,38(8):1492-1500)在构建番木瓜畸形花叶病毒(papayaleafdistortionmosaicvirus,pldmv)时，发现pldmv在大肠杆菌中也存在不稳定现象，而当在pldmv的p3基因中插入内含子时，经酵母重组后转化e.coli能获得测序正确的稳定的侵染性克隆。技术实现要素：本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建及接种方法。本发明实现其目的的技术方案为：一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建方法，包括如下步骤：(1)ctv基因组全长cdna的长链rt-pcr扩增：提取感染ctv的植株总rna，合成其基因组全长cdna第一链，进而使用三对特异引物ctv1f、ctv1r，ctv2f、ctv2r与ctv3f、ctv3r分别进行pcr扩增，得到覆盖ctv基因组全长的三个特异片段ctv1、ctv2、ctv3；所述引物ctv1f、ctv1r、ctv2f、ctv2r与ctv3f、ctv3r的序列分别如seqidno:3～8所示；(2)三元穿梭载体pcy线性化：采用限制性内切酶stui、smai酶切如seqidno:17所示的三元穿梭载体pcy，得到pcy线性化的载体；(3)tar克隆：采用醋酸锂转化法将ctv1、ctv2、ctv3回收片段和线性化的三元穿梭载体pcy共转化酵母菌yph501，在酵母细胞内通过同源重组完成ctv基因组全长cdna克隆的构建；(4)转化农杆菌：提取步骤(3)所获酵母重组质粒，通过电击转入c58c1或gv3101农杆菌感受态细胞；(5)农杆菌介导接种：接种柑桔或本生烟幼苗，从而鉴定获得ctv侵染性克隆。所述步骤(2)中所述的三元穿梭载体pcy的构建方法为：a、采用限制性内切酶sacii单酶切双元表达载体质粒dk1317-2，得到线性化的载体；b、以pyes1lvector为模板，如seqidno:1～2所示的pyes2117f、pyes2117r为引物扩增，然后回收目的片段；c、将线性化dk1317-2载体和步骤b得到的回收片段进行重组构建，转化大肠杆菌jm109，挑选阳性克隆，即得。所述步骤(5)农杆菌介导接种的方法为真空浸润法接种，或者通过农杆菌注射接种4-6叶期的本生烟后再提取ctv病毒粒子接种柑桔。一种柑桔衰退病毒侵染性克隆的接种方法，采用农杆菌介导的真空浸润法，具体包括如下步骤：(1)播种：柑桔种子剥去外种皮，播于培养基上暗培养5-10天；(2)ctv接种缓冲液准备：分别离心收集携带ctv侵染性克隆与hc-pro或p19表达质粒的农杆菌细胞，用接种缓冲液悬浮，使其od600分别为0.8～1.2和0.2～0.5；(3)真空浸润：将步骤(1)所获幼苗浸入步骤(2)的缓冲液，在真空下保持20～40秒并迅速释放；(4)暗培养：接种后置于培养箱暗培养5～7天，转入自然条件下培养。上述接种方法的步骤(2)中携带ctv侵染性克隆质粒的农杆菌细胞是通过权利要求1中步骤(1)至(4)得到的。上述接种方法的步骤(2)中用于悬浮农杆菌细胞的缓冲液中包含10mmol·l-1mgcl2，10mmol·l-1mes，200μmol·l-1as。本发明的有益效果是：本发明利用酵母高效同源重组系统来构建ctv基因组全长cdna克隆，有效克服了传统酶切链接法中酶切位点的限制，整个重组过程仅需一次酵母转化即可，2周内即可获得病毒全长cdna克隆，速度快、效率高；该发明通过tar技术将覆盖病毒基因组全长cdna的片段与三元穿梭表达载体pcy同源重组后，不转化大肠杆菌，而是直接转化农杆菌c58c1，从而获得病毒侵染性克隆，有效克服了病毒基因组全长cdna在大肠杆菌中产生毒性或不稳定导致克隆失败的现象，侵染性克隆获得率显著提高，可达50％左右。该发明通过农杆菌真空浸润法直接接种柑桔幼苗，避免了常规接种所必需的本生烟富集病毒颗粒的过程(1-2月)，接种效率显著提高。总之，本发明可在1-2个月内实现从ctv长片段rt-pcr、tar克隆、农杆菌真空浸润到柑桔显症从而获得侵染性克隆的全过程，快速、高效且成本低廉。附图说明图1是三元穿梭载体pcy的质粒图谱。图2是分三段ctv1、ctv2、ctv3扩增ctv基因组全长cdna的结果图，其中，m：dl10000dnamarker；1：水；2～8：样品。图3是ctv全长cdna克隆的菌落pcr鉴定结果，其中，m：2000bp分子量marker；1～5：ctv全长cdna；6：ddh2o；7：阳性对照。图4是农杆菌介导pcy-ctv接种柑桔后的症状图，其中，a、b：侵染型克隆；c、d：空载体对照。图5是农杆菌介导pcy-pvx接种本生烟后的症状图。图6为pvx的rt-pcr检测结果，其中，m：dl2000dnamarker；1～2：样品；3：阳性对照；4：阴性对照。具体实施方式本发明所用材料和试剂来源如下：酵母菌株yph501、农杆菌菌株c58c1由法国thierrycandresse教授惠赠。限制性内切酶sacii、stui、smai购自北京neb公司；lataqase、primerstarmaxpremix、in-fusionhdcloningkit、primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit、jm109购自大连takara公司；trizol试剂、pyes1lvector购自美国invitrogen公司。根据ncbi中已报道ctv全基因组序列(genbank登录号为eu937520)，利用primerpriemer5.0软件设计扩增ctv基因序列的特异引物。ctv1f、ctv1r，ctv2f、ctv2r与ctv3f、ctv3r分别用于扩增覆盖ctv基因组全长的三个特异片段ctv1、ctv2、ctv3；pyes2117f和pyes2117r用于扩增包含酵母复制起始位点的片段；pcy-pvx-f和pcy-pvx-r用于扩增pvx全长以验证穿梭载体的有效性。在引物设计时，ctv1f与酶切后的pcy载体、ctv1r与ctv2f、ctv2r与ctv3f、ctv3r与酶切后的pcy载体、pcy-pvx-r与酶切后的pcy载体、pcy-pvx-f与酶切后的pcy载体之间都分别有25～32bp的重叠序列，以便于在酵母中完成同源重组。引物均由英骏(上海)生物技术有限公司合成(表1)。表1引物设计及其序列注：方框内为sacii限制性内切酶识别序列，下划线部分是与pcy载体同源的30bp。实施例1构建三元穿梭载体pcy首先构建双元载体质粒dk1317-2：用质粒pcmbia1301及pxt1改造得到，pcmbia1301从市场上购买得到，pxt1载体由南京农业大学陶小荣教授惠赠。以pxt1载体为模板，用引物(tl1310f/tl1310r)扩增包含pxt1基因表达组件(lb-2x35s-mcs-hdvrz-nos-rb)的片段。pcambia1301质粒用pvui消化。然后用凝胶提取试剂盒对包含预期片段的扩增和酶切产物进行提纯和融合重组。所获融合质粒用vspi酶切，大的片段重新连接起来以构建pcambi-2x35s-mcs-hdvrz-nos，即dk1317-2。采用限制性内切酶sacii单酶切双元载体质粒dk1317-2，得到线性化的载体。酶切反应体系：质粒dk1317-212μl，限制性内切酶sacii2.5μl，10×nebbuffer5μl，双蒸水23μl。酶切反应条件：37℃反应0.5h。以pyes1lvector为模板，pyes2117f、pyes2117r为引物扩增含有酵母相关复制起始位点的片段pyes1l-2117：反应体积为25μl，包括双蒸水8.5μl，primerstarmaxpremix(2×)12.5μl，特异性上下游引物各1μl，模板pyes1lvector1μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，58℃15s，72℃2min，30个循环；72℃5min，4℃保存。然后利用dna凝胶纯化试剂盒回收目的片段，命名为pyes1l-2117。采用in-fusionhdcloningkit进行重组，其体系包括：线性化dk1317-2载体加2μl，插入片段pyes1l-2117加4μl，in-fusionenzyme加2μl，ddh2o补齐至10μl。50℃，水浴30min，4℃保存。转化大肠杆菌jm109，37℃过夜培养，挑选阳性克隆，获得可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中生长的三元穿梭载体pcy(其质粒图谱见图1)。pcy含有酵母(ars4/cen5)，根癌土壤杆菌(pvs1或iv)和大肠杆菌(pbr322ori)的复制元件，基因表达盒2x35s-mcs-hdvrz-nos位于t-dna插入元件左臂和右臂之间。因此，载体pcy可以用于酵母细胞中dna片段的同源组装以及随后将重组dna分子转化到农杆菌或大肠杆菌中。此外，当病毒全长cdna克隆到pcy的stui和smai限制性酶切位点之间时，基因表达盒2x35s-mcs-hdvrz-nos将确保病毒基因组在精确位点处的精确起始和终止。三元穿梭载体pcy的核苷酸序列见seqidno:17。实施例2ctv基因组全长cdna分段扩增(1)采用trizol法提取柑桔叶片总rna。(2)引物设计根据ncbi中已报道ctv全基因组序列(genbank登录号：eu937520)并结合5′race，利用primerpriemer5.0软件设计扩增ctv基因序列的特异引物。在引物设计时，ctv1f与酶切后的pcy载体、ctv1r与ctv2f、ctv2r与ctv3f、ctv3r与酶切后的pcy载体、pcy-pvx-r与酶切后的pcy载体、pcy-pvx-f与酶切后的pcy载体之间都分别有25～32bp的重叠序列，以便于在酵母中完成同源重组。引物均送至英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。(3)ctv全长cdna扩增①第一链合成：采用invitrogen公司的superscripttmⅱ进行第一链cdna的合成。解链：运行程序：65℃变性5min，迅速置冰浴，室温配制buffermix运行程序：42℃孵育2min最后分别加入1μl(200u·μl-1)superscripttm，反应程序：42℃50min，70℃灭活15min，4℃保存作为下一步pcr反应的模板。②长链pcr反应条件：利用lataq酶(takara公司)，采用25μl反应体系，40个热循环，为进行ctv全长cdna的扩增。1)配制混合液:mi、m2、m3分别用于扩增覆盖ctv基因组全长的三个特异片段ctv1、ctv2、ctv3。2)运行程序琼脂糖凝胶电泳结果显示(图2)，pcr产物片段大小分别为7060bp、6007bp、6335bp，符合预期大小。③利用dna凝胶纯化试剂盒回收目的片段ctv1、ctv2、ctv3。实施例3构建ctv的侵染性克隆(1)采用限制性内切酶stui、smai酶切质粒pcy，得到pcy线性化的载体。反应体系：质粒pcy13μl，限制性内切酶smai1.0μl，10×nebbuffer5μl，双蒸水31μl。酶切反应条件：25℃反应0.5h，然后再加入stui1.0μl，37℃孵育0.5h。(2)利用醋酸锂转化法转化酵母参照tuo等(tuod,shenw,yanp,lix,zhoup.rapidconstructionofstableinfectiousfull-lengthcdnacloneofpapayaleafdistortionmosaicvirususingin-fusioncloning.viruses,2015,7(12):6241-6250)和youssef等(yousseff,maraisa,faurec,gentitp,candresset.strategiestofacilitatethedevelopmentofunclonedorclonedinfectiousfull-lengthviralcdnas:applechloroticleafspotvirusasacasestudy.virologyjournal,2011,8(1):1-12)采用的醋酸锂转化法，取制备好的酵母感受态细胞yph501100μl至2ml的离心管中，按顺序加入以下试剂：peg4000(50％w/v)240μl，1mol/l的liac36μl、10mg/ml的鲑鱼精dna25μl和pcy线性化的载体200ng、ctv1、ctv2、ctv3胶回收片段各200ng，震荡使转化体系中的组分充分混匀，在30℃摇床中250r/min摇菌30min，42℃水浴热激15min；6000r/min离心3min，弃去上清液，使用300μlddh2o重悬细胞，均匀涂布在trp缺陷型筛选平板上，于30℃培养2～4d。(3)酵母菌落pcr检测待酵母菌落长至1-3mm，用牙签挑取菌落的1/3，以10μlddh2o悬浮，98℃处理10min(破壁)后进行pcr。采用的pcr反应体系如下：pcr反应程序如下：菌落pcr鉴定结果显示(图3)，所获片段大小与预期结果一致。阳性克隆进一步提取质粒并按前述方法分别扩增ctv1、ctv2、ctv3以鉴定ctv基因组全长cdna克隆，命名为pcy-ctv。在第一批所挑取的20个克隆中，有7个阳性全长克隆，阳性率为35％。第二批挑取的20个克隆中，有11个阳性全长克隆，阳性率为55％。两轮独立tar克隆所得ctv基因组全长cdna克隆阳性率为45％。(3)农杆菌转化及接种提取ctv阳性克隆质粒，通过电击转入农杆菌c58c1。挑取ctv阳性单克隆接种含相应抗生素的lb液体培养基(20mg·l-1rif，50mg·l-1kan)，200r·min-1，28℃振荡培养12～16h。同时，接种培养表达hc-pro或p19等基因沉默抑制子的农杆菌单克隆。离心收集菌体，用缓冲液悬浮(悬浮缓冲液：10mmol·l-1mgcl2，10mmol·l-1mes，200μmol·l-1as)，使其od600分别为0.8～1.2和0.2～0.5，静置2h后备用。同时，以pcy空载质粒的农杆菌作为阴性对照。锦橙(c.sinensis)种子去外种皮后播种至ms培养基，暗培养5-10天后用于接种。将幼苗浸入上述接种缓冲液，抽真空并保持30秒，迅速释放，置于培养箱暗培养7天，转入自然条件下培养。采集接种30天后的柑桔叶片，利用plus法抽提叶片总核酸进行普通rt-pcr检测。结果显示，pcy-ctv接种的上位叶片扩增出与预期672bp大小相符的目的条带，侵染率90％，说明pcy-ctv是具有侵染性的克隆。接种90天后的症状观察结果显示(图4)：浸润pcy-ctv的柑桔叶片出现脉明、黄化等ctv侵染症状，空白对照则没有表现ctv侵染的症状。进一步说明ctv侵染性克隆构建成功。本发明利用酵母高效同源重组系统来构建ctv基因组全长cdna克隆，有效突破了传统酶切链接法中酶切位点的限制，整个重组过程仅需一次酵母转化，2周内获得了ctv全长cdna克隆；该发明通过tar技术将覆盖病毒基因组全长cdna的片段与三元穿梭表达载体pcy同源重组后，不转化大肠杆菌，而是直接转化农杆菌c58c1，从而获得病毒侵染性克隆，有效克服了病毒基因组全长cdna在大肠杆菌中产生毒性或不稳定导致克隆失败的现象，侵染性克隆获得率显著提高，达到45％。该发明通过农杆菌真空浸润法直接接种柑桔幼苗，避免了常规接种所必需的本生烟富集病毒颗粒的过程(1-2月)，接种效率显著提高。总之，本实施例2个月内实现了从ctv长片段rt-pcr、tar克隆、农杆菌真空浸润到柑桔显症从而获得侵染性克隆的全过程，快速、高效且成本低廉。实施例4穿梭载体pcy用于pvx侵染性克隆构建参照前面实施例的方法将本发明中的穿梭载体pcy及方法用于pvx(potatovirusx)侵染性克隆构建，pvx全长cdna的扩增采用引物pcy-pvxf、pcy-pvxr，酵母菌落pcr检测采用引物pvx-f、pvx-r。将验证为阳性的pcy-pvx质粒转化农杆菌c58c1并通过农杆菌注射浸润法接种本生烟，接种10天后的观察结果显示：注射pcy-pvx的烟草症状和阳性对照的完全一样，与阴性对照形成明显的对比(如图5所示)。采集接种10天后的本生烟嫩叶，利用plus法抽提叶片总核酸进行普通rt-pcr检测。结果显示，pcy-pvx接种的上位叶片扩增出与预期大小相符的目的条带(如图6所示)。这说明基于三元穿梭载体pcy的酵母重组克隆体系具有良好的适用性，可用于pvx及其他病毒的侵染性克隆构建。实施例5穿梭载体pcy用于clbv侵染性克隆构建参照前面实施例的方法将本发明的穿梭载体pcy用于柑桔叶斑驳病毒(citrusleafblotchvirus，clbv)侵染性克隆构建。通过酵母重组获得的clbv全长cdna克隆的效率可以达到70％以上。这进一步说明基于三元穿梭载体pcy的酵母重组克隆体系具有良好的适用性。序列表<110>西南大学<120>柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建及接种方法<160>17<210>1<211>39<212>dna<213>人工序列<223>pyes2117f<400>1gccgattttgaaaccgcggagtcagtgagcgaggaagcg39<210>2<211>39<212>dna<213>人工序列<223>pyes2117r<400>2ctgcctgtgatcaccgcggcatcttttactttcaccagc39<210>3<211>52<212>dna<213>人工序列<223>ctv1f<400>3ctatataaggaagttcatttcatttggagaggaatttctcaaattcacccgt52<210>4<211>45<212>dna<213>人工序列<223>ctv1r<400>4taccacgaagaccgggtgtgtcactaagcaacgactcatccaact45<210>5<211>47<212>dna<213>人工序列<223>ctv2f<400>5agttggatgagtcgttgcttagtgacacacccggtcttcgtggtaac47<210>6<211>44<212>dna<213>人工序列<223>ctv2r<400>6accgactaccactagcttcaaactttgcgactcgggcatactag44<210>7<211>44<212>dna<213>人工序列<223>ctv3f<400>7ctagtatgcccgagtcgcaaagtttgaagctagtggtagtcggt44<210>8<211>74<212>dna<213>人工序列<223>ctv3r<400>8cgcgaggaggtggagatgccatgccgacccgggttttttttttttttttttttttttttt60tttggacctatgtt74<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<223>ctv-cp3<400>9tcaacgtgtgttgaattt18<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列<223>ctv-cp1<400>10atggacgacgaaacaaag18<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<223>pvx-f<400>11atgtcagcaccagctagcac20<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列<223>pvx-r<400>12ggatccttatggtggtggtagag23<210>13<211>41<212>dna<213>人工序列<223>tl1310f<400>13aactcgagcttgtcgattaatgcatgcctgcagtcaacatg41<210>14<211>33<212>dna<213>人工序列<223>tl1310r<400>14aaatgtttgaacgatcggggaaattcgagctct33<210>15<211>56<212>dna<213>人工序列<223>pcy-pvx-f<400>15atataaggaagttcatttcatttggagaggagaaaactaaaccatacaccaccaac56<210>16<211>99<212>dna<213>人工序列<223>pcy-pvx-r<400>16cgcgaggaggtggagatgccatgccgacccgggttttttttttttttttttttttttttt60tttttttttttttttttttttttttttttttttatttat99<210>17<211>10347<212>dna<213>人工序列<223>三元穿梭载体pcy<400>17attaatgcatgcctgcagtcaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaata60tcaaagatacagtctcagaagaccagagggctattgagacttttcaacaaagggtaatat120cgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtag180aaaaggaagatggcttctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaaa240gaatgcctctaccgacagtggtcccaaagatggaccccccacccacgaggaacatcgtgg300aaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgataacatggtgg360agcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccagaggg420ctattgagactttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagc480tatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaagatggcttctacaaatgccatca540ttgcgataaaggaaaggctatcgttcaagaatgcctctaccgacagtggtcccaaagatg600gacccccacccacgaggaacatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagc660aagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatcctt720cgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggcctatgagtaaag780gagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatg840ggtacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttaccc900ttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactt960tctcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaagcggcacgacttct1020tcaagagcgccatgcctgagggatacgtgcaggagaggaccatcttcttcaaggacgacg1080ggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgagggagacaccctcgtcaacaggatcg1140agcttaagggaatcgatttcaaggaggacggaaacatcctcggccacaagttggaataca1200actacaacttccacaacgtatacatcatggccgacaagcaaaagaacggcatcaaagcca1260acttcaagacccgccacaacatcgaagacggcggcgtgcaactcgctgatcattatcaac1320aaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacac1380aatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttg1440taacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataacccgggtcggcat1500ggcatctccacctcctcgcggtccgacctgggcatccgaaggaggacgtcgtccactcgg1560atggctaagggagagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttctt1620aagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgt1680taagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgat1740tagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaacta1800ggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattaaactatcagtg1860tttgacaggatatattggcgggtaaacctaagagaaaagagcgtttattagaataacgga1920tatttaaaagggcgtgaaaaggtttatccgttcgtccatttgtatgtgcatgccaaccac1980agggttcccctcgggatcaaagtactttgatccaacccctccgctgctatagtgcagtcg2040gcttctgacgttcagtgcagccgtcttctgaaaacgacatgtcgcacaagtcctaagtta2100cgcgacaggctgccgccctgcccttttcctggcgttttcttgtcgcgtgttttagtcgca2160taaagtagaatacttgcgactagaaccggagacattacgccatgaacaagagcgccgccg2220ctggcctgctgggctatgcccgcgtcagcaccgacgaccaggacttgaccaaccaacggg2280ccgaactgcacgcggccggctgcaccaagctgttttccgagaagatcaccggcaccaggc2340gcgaccgcccggagctggccaggatgcttgaccacctacgccctggcgacgttgtgacag2400tgaccaggctagaccgcctggcccgcagcacccgcgacctactggacattgccgagcgca2460tccaggaggccggcgcgggcctgcgtagcctggcagagccgtgggccgacaccaccacgc2520cggccggccgcatggtgttgaccgtgttcgccggcattgccgagttcgagcgttccctaa2580tcatcgaccgcacccggagcgggcgcgaggccgccaaggcccgaggcgtgaagtttggcc2640cccgccctaccctcaccccggcacagatcgcgcacgcccgcgagctgatcgaccaggaag2700gccgcaccgtgaaagaggcggctgcactgcttggcgtgcatcgctcgaccctgtaccgcg2760cacttgagcgcagcgaggaagtgacgcccaccgaggccaggcggcgcggtgccttccgtg2820aggacgcattgaccgaggccgacgccctggcggccgccgagaatgaacgccaagaggaac2880aagcatgaaaccgcaccaggacggccaggacgaaccgtttttcattaccgaagagatcga2940ggcggagatgatcgcggccgggtacgtgttcgagccgcccgcgcacgtctcaaccgtgcg3000gctgcatgaaatcctggccggtttgtctgatgccaagctggcggcctggccggccagctt3060ggccgctgaagaaaccgagcgccgccgtctaaaaaggtgatgtgtatttgagtaaaacag3120cttgcgtcatgcggtcgctgcgtatatgatgcgatgagtaaataaacaaatacgcaaggg3180gaacgcatgaaggttatcgctgtacttaaccagaaaggcgggtcaggcaagacgaccatc3240gcaacccatctagcccgcgccctgcaactcgccggggccgatgttctgttagtcgattcc3300gatccccagggcagtgcccgcgattgggcggccgtgcgggaagatcaaccgctaaccgtt3360gtcggcatcgaccgcccgacgattgaccgcgacgtgaaggccatcggccggcgcgacttc3420gtagtgatcgacggagcgccccaggcggcggacttggctgtgtccgcgatcaaggcagcc3480gacttcgtgctgattccggtgcagccaagcccttacgacatatgggccaccgccgacctg3540gtggagctggttaagcagcgcattgaggtcacggatggaaggctacaagcggcctttgtc3600gtgtcgcgggcgatcaaaggcacgcgcatcggcggtgaggttgccgaggcgctggccggg3660tacgagctgcccattcttgagtcccgtatcacgcagcgcgtgagctacccaggcactgcc3720gccgccggcacaaccgttcttgaatcagaacccgagggcgacgctgcccgcgaggtccag3780gcgctggccgctgaaattaaatcaaaactcatttgagttaatgaggtaaagagaaaatga3840gcaaaagcacaaacacgctaagtgccggccgtccgagcgcacgcagcagcaaggctgcaa3900cgttggccagcctggcagacacgccagccatgaagcgggtcaactttcagttgccggcgg3960aggatcacaccaagctgaagatgtacgcggtacgccaaggcaagaccattaccgagctgc4020tatctgaatacatcgcgcagctaccagagtaaatgagcaaatgaataaatgagtagatga4080attttagcggctaaaggaggcggcatggaaaatcaagaacaaccaggcaccgacgccgtg4140gaatgccccatgtgtggaggaacgggcggttggccaggcgtaagcggctgggttgtctgc4200cggccctgcaatggcactggaacccccaagcccgaggaatcggcgtgacggtcgcaaacc4260atccggcccggtacaaatcggcgcggcgctgggtgatgacctggtggagaagttgaaggc4320cgcgcaggccgcccagcggcaacgcatcgaggcagaagcacgccccggtgaatcgtggca4380agcggccgctgatcgaatccgcaaagaatcccggcaaccgccggcagccggtgcgccgtc4440gattaggaagccgcccaagggcgacgagcaaccagattttttcgttccgatgctctatga4500cgtgggcacccgcgatagtcgcagcatcatggacgtggccgttttccgtctgtcgaagcg4560tgaccgacgagctggcgaggtgatccgctacgagcttccagacgggcacgtagaggtttc4620cgcagggccggccggcatggccagtgtgtgggattacgacctggtactgatggcggtttc4680ccatctaaccgaatccatgaaccgataccgggaagggaagggagacaagcccggccgcgt4740gttccgtccacacgttgcggacgtactcaagttctgccggcgagccgatggcggaaagca4800gaaagacgacctggtagaaacctgcattcggttaaacaccacgcacgttgccatgcagcg4860tacgaagaaggccaagaacggccgcctggtgacggtatccgagggtgaagccttgattag4920ccgctacaagatcgtaaagagcgaaaccgggcggccggagtacatcgagatcgagctagc4980tgattggatgtaccgcgagatcacagaaggcaagaacccggacgtgctgacggttcaccc5040cgattactttttgatcgatcccggcatcggccgttttctctaccgcctggcacgccgcgc5100cgcaggcaaggcagaagccagatggttgttcaagacgatctacgaacgcagtggcagcgc5160cggagagttcaagaagttctgtttcaccgtgcgcaagctgatcgggtcaaatgacctgcc5220ggagtacgatttgaaggaggaggcggggcaggctggcccgatcctagtcatgcgctaccg5280caacctgatcgagggcgaagcatccgccggttcctaatgtacggagcagatgctagggca5340aattgccctagcaggggaaaaaggtcgaaaaggtctctttcctgtggatagcacgtacat5400tgggaacccaaagccgtacattgggaaccggaacccgtacattgggaacccaaagccgta5460cattgggaaccggtcacacatgtaagtgactgatataaaagagaaaaaaggcgatttttc5520cgcctaaaactctttaaaacttattaaaactcttaaaacccgcctggcctgtgcataact5580gtctggccagcgcacagccgaagagctgcaaaaagcgcctacccttcggtcgctgcgctc5640cctacgccccgccgcttcgcgtcggcctatcgcggccgctggccgctcaaaaatggctgg5700cctacggccaggcaatctaccagggcgcggacaagccgcgccgtcgccactcgaccgccg5760gcgcccacatcaaggcaccctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgac5820acatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaag5880cccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcac5940gtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgag6000agtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcag6060gcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagc6120ggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcagg6180aaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgct6240ggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtca6300gaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccct6360cgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttc6420gggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgt6480tcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatc6540cggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagc6600cactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtg6660gtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagcc6720agttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtag6780cggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaaga6840tcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggat6900tttggtcatgcattctaggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttatttt6960ctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttcccc7020gatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgcc7080gcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtc7140tcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatc7200atacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatc7260ggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggctgtctaagctattcgt7320atagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctc7380gataatcttttcagggctttgttcatcttcatactcttccgagcaaaggacgccatcggc7440ctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaac7500aggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggt7560ccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggttttcattttctcccaccagctt7620atataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtatttttcgatcag7680ttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttcta7740cagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttc7800cttgcattctaaaaccttaaataccagaaaacagctttttcaaagttgttttcaaagttg7860gcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccgcggagtcagtgagcgaggaag7920cgcgtaactataacggtcctaaggtagcgaatcctgatgcggtattttctccttacgcat7980ctgtgcggtatttcacaccgcatagatcggcaagtgcacaaacaatacttaaataaatac8040tactcagtaataacctatttcttagcatttttgacgaaatttgctattttgttagagtct8100tttacaccatttgtctccacacctccgcttacatcaacaccaataacgccatttaatcta8160agcgcatcaccaacattttctggcgtcagtccaccagctaacataaaatgtaagctttcg8220gggctctcttgccttccaacccagtcagaaatcgagttccaatccaaaagttcacctgtc8280ccacctgcttctgaatcaaacaagggaataaacgaatgaggtttctgtgaagctgcactg8340agtagtatgttgcagtcttttggaaatacgagtcttttaataactggcaaaccgaggaac8400tcttggtattcttgccacgactcatctccatgcagttggacgatatcaatgccgtaatca8460ttgaccagagccaaaacatcctccttaagttgattacgaaacacgccaaccaagtatttc8520ggagtgcctgaactatttttatatgcttttacaagacttgaaattttccttgcaataacc8580gggtcaattgttctctttctattgggcacacatataatacccagcaagtcagcatcggaa8640tctagagcacattctgcggcctctgtgctctgcaagccgcaaactttcaccaatggacca8700gaactacctgtgaaattaataacagacatactccaagctgcctttgtgtgcttaatcacg8760tatactcacgtgctcaatagtcaccaatgccctccctcttggccctctccttttcttttt8820tcgaccgaattaattcttaatcggcaaaaaaagaaaagctccggatcaagattgtacgta8880aggtgacaagctatttttcaataaagaatatcttccactactgccatctggcgtcataac8940tgcaaagtacacatatattacgatgctgttctattaaatgcttcctatattatatatata9000gtaatgtcgtgatctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaag9060ccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggc9120atccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcacc9180gtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaa9240tgtcatgataataatggtttcttagacggatcgcttgcctgtaacttacacgcgcctcgt9300atcttttaatgatggaataatttgggaatttactctgtgtttatttatttttatgttttg9360tatttggattttagaaagtaaataaagaaggtagaagagttacggaatgaagaaaaaaaa9420ataaacaaaggtttaaaaaatttcaacaaaaagcgtactttacatatatatttattagac9480aagaaaagcagattaaatagatatacattcgattaacgataagtaaaatgtaaaatcaca9540ggattttcgtgtgtggtcttctacacagacaaggtgaaacaattcggcattaatacctga9600gagcaggaagagcaagataaaaggtagtatttgttggcgatccccctagagtcttttaca9660tcttcggaaaacaaaaactattttttctttaatttctttttttactttctatttttaatt9720tatatatttatattaaaaaatttaaattataattatttttatagcacgtgatgaaaagga9780cccaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaat9840acattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattg9900aaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggc9960attttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgccgcggt10020gatcacaggcagcaacgctctgtcatcgttacaatcaacatgctaccctccgcgagatca10080tccgtgtttcaaacccggcagcttagttgccgttcttccgaatagcatcggtaacatgag10140caaagtctgccgccttacaacggctctcccgctgacgccgtcccggactgatgggctgcc10200tgtatcgagtggtgattttgtgccgagctgccggtcggggagctgttggctggctggtgg10260caggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcggac10320gtttttaatgtactgaattaacgccga10347当前第1页12当前第1页12