本发明属于细胞基因工程领域，尤其涉及一种人蛋白基因Notch3胞内片段克隆载体及其制备方法和应用。
背景技术：
：Notch基因于1917年在果蝇体内被发现，因其基因的部分缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口(Notch)而得名。Notch信号通路在大部分脊椎和非脊椎动物中都存在，有较高程度的保守性。既往研究表明，Notch受体与配体可以在相邻细胞间结合，传递Notch信号，从而对器官形成和形态产生影响。研究表明，Notch信号通路的改变与肿瘤、遗传性疾病、神经退行性疾病以及心血管病变等的发生、发展密切相关。在人体中，Notch基因存在四种亚型分别是Notch1、2、3、4。成熟的Notch受体蛋白由胞外结构域(extracellularnotch，ECN)、跨膜结构域(notchtransmembrane，NTM)和胞内结构域组成。胞外结构域通过其具有的3个串联Lin/Notch重复序列(Lin/Notchrepeats，LNR)以非共价键的形式与跨膜结构域相互结合形成异二聚体。此外，胞外结构域中还包含一个表皮生长因子样重复序列(epidermalgrowthfactor-likerepeats，EGF-R)，通常作为配体结合位点发挥相关生理作用。在信号传导过程中，激活后的Notch受体蛋白会发生多次剪接切，此时Notch胞内区域(notchintracellulardomain，NICD))会从细胞膜上被剪切下来，进入细胞核与核转录因子结合，激活下游靶基因转录而发挥一系列生物学作用。Notch3主要表达于平滑肌细胞中，经证实与心肌重构、心动脉平滑肌细胞的分化与成熟等有关，是研究心血管相关发育缺陷和生理疾病的重要基因。Notch3基因胞内片段由于其碱基序列GC值含量较高，极易在分子克隆过程中形成二级结构或发卡结构而影响扩增过程，普通分子克隆酶无法获得目的片段。此外，目前市场上已有的N3ICD载体价格昂贵，这些现状都为Notch3信号通路的研究带来了巨大阻碍，影响了研究工作的开展。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种人蛋白基因Notch3胞内片段克隆载体及其制备方法和应用，为子心肌系统疾病的相关研究提供巨大便利。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：人蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体，在pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间构建有人蛋白基因NOTCH3胞内片段(N3ICD蛋白片段)序列。人蛋白基因NOTCH3胞内片段来自Notch3基因(人细胞系hela)，其具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列，其编码的蛋白具有序列表SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。碱基序列在第533位和1820位碱基存在氨基酸同义突变。上述蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体的制备方法，将人蛋白基因NOTCH3胞内片段碱基序列克隆到pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间，KpnI酶切位点位于碱基序列的上游，XbaI酶切位点位于碱基序列的下游，从而构建成为可以完成细胞瞬转过表达的N3ICD-pcDNA3.1过表达载体。人蛋白基因NOTCH3胞内片段碱基序列属于Notch3基因，其具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。上述蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体的制备方法，按以下步骤操作进行：<1>根据NCBI上Notch3基因核苷酸序列(基因登录号：NM000435.2的5063-7042)，以Hela细胞总RNA反转录为cDNA为模板，克隆Notch3胞内碱基序列；<2>所克隆得到的Notch3胞内碱基序列(N3ICD序列)插入到pcDNA3.1载体KpnI和XbaI酶切位点之间。蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体的制备方法，克隆使用巢式PCR技术配合高GCbuffer进行，克隆所用引物为：巢式外部引物：O-N3ICD-F1：5’-gtcattctcgtcctgggtgtcatg-3’(序列表SEQ.ID.NO.3)，O-N3ICD-R1：5’-gtctcaggccaacacttgcctc-3’(序列表SEQ.ID.NO.4)；内部引物：N3ICD-KpnI-F2：5’-ccggtaccatggtggcccggcgcaagc-3’(序列表SEQ.ID.NO.5)，N3ICD-XbaI-R2：5’-tttctagatcaggccaacacttgcctct-3’(序列表SEQ.ID.NO.6)。PCR扩增产物长度为1980bp。上述蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体的制备方法，克隆的反应体系和条件以及反应程序分别为：巢式第一轮PCR反应体系和条件为：巢式第一轮PCR反应程序为：接着，以第一轮PCR产物稀释100倍的溶液为模板，进行巢式PCR产物反应，反应体系及条件为：上述蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体在细胞系过表达N3ICDmRNA或蛋白方面的应用。针对目前心肌系统疾病的相关研究存在问题，发明人设计并构建了一种人蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体，在pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间构建有人蛋白基因NOTCH3胞内片段序列。据此，还建立了相应构建方法，即将人蛋白基因NOTCH3胞内片段碱基序列克隆到pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间，KpnI酶切位点位于碱基序列的上游，XbaI酶切位点位于碱基序列的下游，从而构建成为可以直接用于常规过表达载体亚克隆的N3ICD-pcDNA3.1过表达载体。实验结果显示，使用该测序验证后的过表达质粒转染的细胞经qPCR检测和蛋白质免疫印迹检测，均可在细胞中特异性高表达N3ICD的mRNA及蛋白，测定结果清晰准确，价格低廉，大幅缩减实验成本。因此，本发明构建的N3ICD过表达载体可以作为现成的亚克隆模板，参与到过表达载体构建和过表达慢病毒包装中，为心肌系统疾病的研究带来巨大便利。经验证，来源于该载体的片段在经过过表达慢病毒包装后可以在在细胞系中特异性高表达Notch3基因的胞内结构mRNA以及蛋白胞内结构域。可见，本发明有效解决了人源N3ICD片段克隆困难和在细胞系中高表达的问题，为notch3基因通路研究提供了实验基础。与现有技术相比，本发明的突出优势在于：(1)本发明的N3ICD-pcDNA3.1过表达载体可直接用于常规过表达载体亚克隆，并用于细胞系转化，获得瞬时转染的高表达N3ICD细胞株。(2)本发明的N3ICD-pcDNA3.1过表达载体经转染之后效果经qPCR、蛋白质免疫印迹证实准确可靠。附图说明图1是琼脂糖凝胶电泳分析图，图中：M：marker。图2是单克隆琼脂糖凝胶电泳分析图，图中：M：marker，1-9分别是9个单克隆的菌液PCR电泳结果。图3是qPCR检测N3ICD表达柱状图。图4是WB检测N3ICD过表达蛋白免疫印迹图。图5是WB检测N3ICD过表达蛋白免疫印迹灰度图。具体实施方式实施例1N3ICD克隆质粒用于慢病毒包装、细胞系转染过表达mRNA一、基因克隆(一)Hela细胞mRNA的提取(1)样本的前期处理：500xg离心收集细胞(＜1x107细胞)，去除培养液，涡旋或用手指弹打松散细胞团，加入1mLTRNzol，移液枪吸打3-5次，静置5分钟，让细胞充分裂解；(2)分相：加入200μl体积的氯仿(为TRNzol总体积的1/5)，充分颠倒混匀，室温下静置3分钟，12000rpm4℃离心15分钟，溶液分层，小心吸取含RNA的上清移到一新的离心管中。(3)RNA沉淀：向吸取的上清中加入1μLRNA共沉淀剂，混匀，再加入异丙醇400μL，颠倒数次混匀，室温静置10min，12000rpm4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清。(4)RNA清洗：在离心管中加入1mL75％乙醇(DEPC水新鲜配制)，颠倒混匀，12000rpm4℃离心5分钟。小心地弃上清。(5)RNA溶解：敞开离心管口，室温干燥5～10分钟使残留液体挥发，待RNA略干后，加30μLDEPC水溶解沉淀，取少量检测，其余可保存于-80℃或液氮中。(二)去DNA表1去DNA体系和条件(三)逆转录(Thermo试剂盒逆转录)表2逆转录体系和条件接着加入以下试剂：表3逆转录加入试剂(四)PCR以Hela细胞的cDNA为模板，以巢式PCR原理设计两对引物，分别为：外围引物：O-N3ICD-F1：5’-GTCATTCTCGTCCTGGGTGTCATG-3’O-N3ICD-R1：5’-GTCTCAGGCCAACACTTGCCTC-3’内部引物：N3ICD-KpnI-F2：5’-CCGGTACCATGGTGGCCCGGCGCAAGC-3’N3ICD-XbaI-R2：5’-TTTCTAGATCAGGCCAACACTTGCCTCT-3’PCR扩增产物长度为1980bp。以Hela细胞的cDNA为模板，反应体系及条件如下：巢式第一轮PCR体系：表4巢式第一轮PCR反应体系表5巢式第一轮PCR反应程序以第一轮PCR产物稀释100倍的溶液为模板，进行巢式PCR产物反应，反应体系及条件如下：表6巢式PCR反应体系及条件表7巢式PCR反应程序PCR反应完取2μLPCR产物进行1％琼脂糖电泳分析，结果如图1，可见扩增出片段大小与理论大小相符。(五)PCR产物加A尾表8PCR产物加A尾体系和程序(六)产物的纯化回收按照凝胶纯化试剂盒(AXYGEN，货号：AP-GX-250)说明书进行产物纯化。(1)事先称量一只2.0mL的空EP管重量并记录于管壁；(2)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。(3)加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。(4)加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀。(5)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，12，000×g离心1min。弃滤液。(6)将制备管置回2mL离心管，加500μlBufferW1，12，000×g离心30s，弃滤液。(7)将制备管置回2mL离心管，加700μlBufferW2，12，000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μLBufferW2洗涤一次12，000×g离心1min。(8)将制备管置回2mL离心管中，12，000×g离心1min。(9)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加30μLEluent或去离子水，室温静置1min。12，000×g离心1min洗脱DNA。(10)取少量检测浓度，其余可保存于-20℃中。(七)连接连接反应体系如下：表9连接反应体系和条件(八)转化(1)取连接产物加到50μLDH5α感受态细胞中，混匀，冰浴30分钟。(2)将上述转化液置于42℃水浴90秒，取出后立即置于冰浴中放置2-3分钟。(3)向其中加入800μL37℃预热的LB(不含抗生素)培养基，200rpm、37℃振荡培养1小时。(4)2500rpm离心5min，将上清液吸走，留100μL混匀菌液，加到含Amp抗生素LB固体琼脂培养基上(抗生素浓度100μg/mL)，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。(九)菌落PCR鉴定随机挑取上述平板上的若干单菌落，于加有400μLAMP液体培养基1.5mLEP中，标好编号(共挑取9个单菌落)，200rpm、37℃振荡培养4小时。依据编号另取相等灭菌数量PCR管，反应体系及条件如下：表10菌落PCR鉴定体系表11菌落PCR鉴定程序PCR反应完取2μLPCR产物进行1％琼脂糖电泳分析，结果如图2。由电泳图可知条带大小相符，取2、6、8号进行测序鉴定。将阳性的克隆送测序公司测序进一步鉴定确认得到N3ICD过表达载体。二、qPCR检测(一)细胞提取RNA1、细胞来源以本克隆载体序列为模板，构建到慢病毒载体pAd-EFla-GFP中进行病毒包装，以收获的病毒感染细胞进行N3ICD过表达。细胞感染分3组：空白+凝聚胺，AV-GFP，AV-N3ICD。2、提取步骤(TRIZOL法)(1)从-80℃冰箱中拿出已用TRIZOL裂解的细胞，解冻15min，摇匀。(2)加入100μl氯仿，大力摇15s，静置5min。(3)4℃12000g离心15min。(4)小心吸取上层水相(大概200μl)，加入等量异丙醇，轻轻混匀，静置10min。(5)4℃12000g离心10min，弃上清。(6)加入1ml75％乙醇，使沉淀悬浮，4℃12000g离心10min，弃上清。(7)干燥沉淀(大概5min)，加入20μlDEPCH2O。(二)检测RNA浓度表12检测RNA浓度(三)去DNA处理取全部RNA样品进行后续实验，实验体系：表13去DNA体系和条件(四)逆转录1、去DNA处理完成后，重新测定浓度表14重新测定浓度2、mRNA逆转录取1μgRNA进行逆转录(采用Thermo试剂盒)(1)在冰上将下列体系配制好表15逆转录体系TemplateRNA1μgOligo(dT)Primer0.5μLWater，nuclease-freeTo6μLTotalvolume6μL(2)混匀，离心后，65℃孵育5min，立即放冰上5min。(3)加入下列试剂表16逆转录体系5xReactionBuffer2μL10mMdNTPMix1μLRiboLockRNaseInhibitior(20U/μL)0.5μLRevertAidM-MuLVRT(200U/μL)0.5μLTotalvolume10μL(4)混匀，离心后，42℃60min，70℃5min。(五)qPCR检测1、模板制备取逆转录好的样品稀释5倍，其余cDNA样品稀释10倍，后作为模板进行后续的实验。2、qPCR检测(采用QIAGEN试剂盒)qPCR检测反应体系如下：表17qPCR检测反应体系qPCR检测程序如下：表18qPCR检测反应程序(六)检测结果2-RealtimePCR实验检测结果如图3，结果显示，转染了过表达载体的细胞较转染空载和空白细胞存在更高的Notch3mRNA水平，表明过表达载体能够实现Notch3的mRNA过表达。实施例2N3ICD克隆质粒用于慢病毒包装、细胞系转染过表达蛋白一、细胞蛋白提取1、细胞来源以本发明克隆载体序列为模板，构建到慢病毒载体pAd-EF1a-GFP中进行病毒包装，以收获的病毒感染细胞进行N3ICD过表达。细胞感染分3组：空白+凝聚胺，AV-GFP，AV-N3ICD。2、蛋白样品蛋白制备：在细胞样品中加入适量裂解液RIPA(含蛋白抑制剂)冰上裂解30min，再经过超声波细胞粉碎机超声破碎，4℃，13000rpm离心30min。离心完成后移取上清至洁净离心管中，立即使用或者-80℃保存。3、总蛋白浓度检测：蛋白样品提取完成后将上清做倍数稀释后以BCA蛋白定量法测定蛋白吸光值(OD)值，再通过标准曲线计算蛋白样品的浓度。二、蛋白免疫印迹实验(Western-Blot)2.1、12％分离胶和5％浓缩胶的配置(m1)表1912％分离胶和5％浓缩胶的配制2.2、制胶：将玻璃板刷洗干净，用双蒸水冲净，晾干。在制胶架上安装玻璃板，按上表配方配制分离胶，注入两块玻璃板中间，并在液面上加入适量超纯水压平胶面，静置30min。待胶凝固后，倒掉上层水并用滤纸将水分吸干。然后按配方配制浓缩胶注入玻璃板中，小心插入梳子，静置30min待胶凝固后将胶板夹紧到电泳槽上，小心拔出梳子，用滴头冲洗泳道中的碎胶。2.3、蛋白变性：将待测蛋白以一定倍数稀释后再和loadingbuffer以3∶1的体积比混合，沸水浴10min，然后取出样品管置于冰上降温。2.4、上样2.5、电泳：在电泳槽内加入电泳缓冲液，接通电源，80V恒压电泳至溴酚蓝跑出浓缩胶层，时间大约为30min。分离胶电泳为120V，当溴酚蓝迁移至距离分离胶下缘约1cm时，关掉电源，停止电泳。2.6、转膜(1)预先配置1L1×转移电泳缓冲液预冷至4℃。(2)先将PVDF膜在甲醇中浸泡30s，再将其转移至转膜缓冲液浸泡15min，然后把滤纸、凝胶一起放到转膜缓冲液中浸泡15min。(3)按夹心法依次将(转膜夹黑色面)海绵、滤纸、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、滤纸、海绵(白色面)按顺序放好，小心赶除所有的气泡，将转膜夹放入转印槽中，倒入适量转膜缓冲液，400mA稳流电转移1h(转膜条件依据不同蛋白进行优化)。2.7、封闭PVDF膜，去离子水洗涤。将PVDF膜浸入5％脱脂牛奶的封闭液中，室温封闭1h。2.8、孵育抗体取出已封闭的PVDF膜，置于1×TBS-T缓冲液中，于摇床上缓慢洗涤3×5min。然后移入第一抗体中，室温摇床孵育或者4℃孵育过夜。一抗孵育完成后将一抗回收，将PVDF膜置于1×TBS-T缓冲液中，于摇床上缓慢洗涤3×5min。然后分别对应移入有HRP标记的第二抗体中，室温摇床孵育1h。内参孵育：取出已封闭的PVDF膜，浸于1×TBS-T缓冲液中，于摇床上缓慢洗涤3×5min。然后移入内参抗体中，室温摇床孵育或者4℃孵育过夜。2.9、洗膜将PVDF膜浸于1×TBS-T缓冲液中，于摇床上缓慢浸洗3×10min。2.10、ECL化学发光显影将PVDF膜至于保鲜膜上，取适量等体积的A液和B液混合，混匀后加在膜的表面，移至凝胶成像分析仪中，曝光显影，如图4，WB结果显示，转染了过表达载体的细胞其NOTCH3蛋白表达量远高于空载和空白组，证明过表达载体能够实现NOTCH3的高表达。2.11、灰度值分析用ImageJ软件对目的条带进行灰度值(面积)计算结果如图5，WB灰度图显示转染了过表达载体的细胞其NOTCH3蛋白表达量远高于空载和空白组，证明过表达载体能够实现NOTCH3的高表达。结论(1)本发明构建的人源N3ICD序列克隆载体可以作为模板参与到多种基因操作中，避免了克隆所带来的人员与试剂成本。(2)本发明构建的人源N3ICD序列克隆载体可进一步亚克隆到慢病毒载体中并实现mRNA和蛋白的高表达。序列表<110>南宁维尔凯生物科技有限公司<120>人蛋白基因Notch3胞内片段克隆载体及其制备方法和应用<160>6<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>1980<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1atggtggcccggcgcaagcgcgagcacagcaccctctggttccctgagggcttctcactg60cacaaggacgtggcctctggtcacaagggccggcgggaacccgtgggccaggacgcgctg120ggcatgaagaacatggccaagggtgagagcctgatgggggaggtggccacagactggatg180gacacagagtgcccagaggccaagcggctaaaggtagaggagccaggcatgggggctgag240gaggctgtggattgccgtcagtggactcaacaccatctggttgctgctgacatccgcgtg300gcaccagccatggcactgacaccaccacagggcgacgcagatgctgatggcatggatgtc360aatgtgcgtggcccagatggcttcaccccgctaatgctggcttccttctgtgggggggct420ctggagccaatgccaactgaagaggatgaggcagatgacacatcagctagcatcatctcc480gacctgatctgccagggggctcagcttggggcacggactgaccgtactggcgagactgcc540ttgcacctggctgcccgttatgcccgtgctgatgcagccaagcggctgctggatgctggg600gcagacaccaatgcccaggaccactcaggccgcactcccctgcacacagctgtcacagcc660gatgcccagggtgtcttccagattctcatccgaaaccgctctacagacttggatgcccgc720atggcagatggctcaacggcactgatcctggcggcccgcctggcagtagagggcatggtg780gaagagctcatcgccagccatgctgatgtcaatgctgtggatgagcttgggaaatcagcc840ttacactgggctgcggctgtgaacaacgtggaagccactttggccctgctcaaaaatgga900gccaataaggacatgcaggatagcaaggaggagacccccctattcctggccgcccgcgag960ggcagctatgaggctgccaagctgctgttggaccactttgccaaccgtgagatcaccgac1020cacctggacaggctgccgcgggacgtagcccaggagagactgcaccaggacatcgtgcgc1080ttgctggatcaacccagtgggccccgcagcccccccggtccccacggcctggggcctctg1140ctctgtcctccaggggccttcctccctggcctcaaagcggcacagtcggggtccaagaag1200agcaggaggccccccgggaaggcggggctggggccgcaggggccccgggggcggggcaag1260aagctgacgctggcctgcccgggccccctggctgacagctcggtcacgctgtcgcccgtg1320gactcgctggactccccgcggcctttcggtgggccccctgcttcccctggtggcttcccc1380cttgaggggccctatgcagctgccactgccactgcagtgtctctggcacagcttggtggc1440ccaggccgggcgggtctagggcgccagccccctggaggatgtgtactcagcctgggcctg1500ctgaaccctgtggctgtgcccctcgattgggcccggctgcccccacctgcccctccaggc1560ccctcgttcctgctgccactggcgccgggaccccagctgctcaacccagggacccccgtc1620tccccgcaggagcggcccccgccttacctggcagtcccaggacatggcgaggagtacccg1680gcggctggggcacacagcagccccccaaaggcccgcttcctgcgggttcccagtgagcac1740ccttacctgaccccatcccccgaatcccctgagcactgggccagcccctcacctccctcc1800ctctcagactggtccgaatccacgcccagcccagccactgccactggggccatggccacc1860accactggggcactgcctgcccagccacttcccttgtctgttcccagctcccttgctcag1920gcccagacccagctggggccccagccggaagttacccccaagaggcaagtgttggcctga1980<210>2<211>659<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2MetValAlaArgArgLysArgGluHisSerThrLeuTrpPheProGlu151015GlyPheSerLeuHisLysAspValAlaSerGlyHisLysGlyArgArg202530GluProValGlyGlnAspAlaLeuGlyMetLysAsnMetAlaLysGly354045GluSerLeuMetGlyGluValAlaThrAspTrpMetAspThrGluCys505560ProGluAlaLysArgLeuLysValGluGluProGlyMetGlyAlaGlu65707580GluAlaValAspCysArgGlnTrpThrGlnHisHisLeuValAlaAla859095AspIleArgValAlaProAlaMetAlaLeuThrProProGlnGlyAsp100105110AlaAspAlaAspGlyMetAspValAsnValArgGlyProAspGlyPhe115120125ThrProLeuMetLeuAlaSerPheCysGlyGlyAlaLeuGluProMet130135140ProThrGluGluAspGluAlaAspAspThrSerAlaSerIleIleSer145150155160AspLeuIleCysGlnGlyAlaGlnLeuGlyAlaArgThrAspArgThr165170175GlyGluThrAlaLeuHisLeuAlaAlaArgTyrAlaArgAlaAspAla180185190AlaLysArgLeuLeuAspAlaGlyAlaAspThrAsnAlaGlnAspHis195200205SerGlyArgThrProLeuHisThrAlaValThrAlaAspAlaGlnGly210215220ValPheGlnIleLeuIleArgAsnArgSerThrAspLeuAspAlaArg225230235240MetAlaAspGlySerThrAlaLeuIleLeuAlaAlaArgLeuAlaVal245250255GluGlyMetValGluGluLeuIleAlaSerHisAlaAspValAsnAla260265270ValAspGluLeuGlyLysSerAlaLeuHisTrpAlaAlaAlaValAsn275280285AsnValGluAlaThrLeuAlaLeuLeuLysAsnGlyAlaAsnLysAsp290295300MetGlnAspSerLysGluGluThrProLeuPheLeuAlaAlaArgGlu305310315320GlySerTyrGluAlaAlaLysLeuLeuLeuAspHisPheAlaAsnArg325330335GluIleThrAspHisLeuAspArgLeuProArgAspValAlaGlnGlu340345350ArgLeuHisGlnAspIleValArgLeuLeuAspGlnProSerGlyPro355360365ArgSerProProGlyProHisGlyLeuGlyProLeuLeuCysProPro370375380GlyAlaPheLeuProGlyLeuLysAlaAlaGlnSerGlySerLysLys385390395400SerArgArgProProGlyLysAlaGlyLeuGlyProGlnGlyProArg405410415GlyArgGlyLysLysLeuThrLeuAlaCysProGlyProLeuAlaAsp420425430SerSerValThrLeuSerProValAspSerLeuAspSerProArgPro435440445PheGlyGlyProProAlaSerProGlyGlyPheProLeuGluGlyPro450455460TyrAlaAlaAlaThrAlaThrAlaValSerLeuAlaGlnLeuGlyGly465470475480ProGlyArgAlaGlyLeuGlyArgGlnProProGlyGlyCysValLeu485490495SerLeuGlyLeuLeuAsnProValAlaValProLeuAspTrpAlaArg500505510LeuProProProAlaProProGlyProSerPheLeuLeuProLeuAla515520525ProGlyProGlnLeuLeuAsnProGlyThrProValSerProGlnGlu530535540ArgProProProTyrLeuAlaValProGlyHisGlyGluGluTyrPro545550555560AlaAlaGlyAlaHisSerSerProProLysAlaArgPheLeuArgVal565570575ProSerGluHisProTyrLeuThrProSerProGluSerProGluHis580585590TrpAlaSerProSerProProSerLeuSerAspTrpSerGluSerThr595600605ProSerProAlaThrAlaThrGlyAlaMetAlaThrThrThrGlyAla610615620LeuProAlaGlnProLeuProLeuSerValProSerSerLeuAlaGln625630635640AlaGlnThrGlnLeuGlyProGlnProGluValThrProLysArgGln645650655ValLeuAla<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3gtcattctcgtcctgggtgtcatg24<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>4gtctcaggccaacacttgcctc22<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>5ccggtaccatggtggcccggcgcaagc27<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>6tttctagatcaggccaacacttgcctct28当前第1页1 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