本发明涉及一种鸡hs6st3基因43bpindel多态性标记及其应用、检测引物、试剂盒，属于分子遗传学育种技术领域。
背景技术：
目前，随着对畜禽生长和饲料效率的选育，畜禽的生产性能得到了很大的提高，畜禽的肉质满足了人类稳定蛋白摄入的需要，成为了人类生活所必需的物质基础。但是，对家禽的不利选育又会导致某些优势基因型的丢失，而在低选育的地方鸡中仍然保留着某些优势基因型。因此，我们可以在确保地方种质资源优质性状的前提下，对地方鸡的生长速度、产蛋率得以改善，进一步对畜禽遗传资源进行保护开发利用。
6-o硫酸基转移酶(hs6st)是一种专一性硫酸化修饰硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)糖链上6-o糖基位点的酶，共有四种亚型(hs6stl、hs6st2、hs6st2s、hs6st3)，硫酸乙酰肝素6-o-磺基转移酶3(hs6st3)基因参与硫酸乙酰肝素、肝素代谢。研究表明，该基因参与脂质代谢过程并导致疾病。jiangetal使用牛作为生物模型研究该基因与脂质代谢调节的关联，他们得出特定的6-o-硫酸盐基团在脂蛋白结合和摄取中起着重要作用(jiangz,michaljj,wuxl,etal.theheparanandheparinmetabolismpathwayisinvolvedinregulationoffattyacidcomposition.internationaljournalofbiologicalsciences,2011,7(5):659-63.)。另有研究分别分析了中国台湾人群和高加索人中hs6st3基因的新型snp突变与糖尿病视网膜病变的易感性和肥胖、甘油三酯的遗传关联(wangks,wangl,liux,etal.associationofhs6st3genepolymorphismswithobesityandtriglycerides:genexgenderinteraction.journalofgenetics,2013,92(3):395.huangyc,linjm,linhj,etal.genome-wideassociationstudyofdiabeticretinopathyinataiwanesepopulation.ophthalmology,2011,118(4):642.)。然而，hs6st3基因在畜禽生长和胴体性状方面的研究较少，在鸡上还没有基因多态性的相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鸡hs6st3基因第1内含子43bpindel多态性标记，该标记与鸡的生长性能及屠体性状相关性高。
本发明还提供了上述多态性标记的应用。
本发明还提供了上述hs6st3基因第1内含子43bpindel多态性标记的检测引物及检测试剂盒。
本发明通过鉴定hs6st3基因的序列变异并探讨hs6st3基因是否可作为分子标记来选择家禽体重指标或其他生产性状，为鸡分子育种提供理论依据。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种鸡hs6st3基因第1内含子43bpindel多态性标记，其核苷酸序列如seqidno.1所示，5‘端起第176-218位存在插入或缺失。
上述的多态性标记位于hs6st3基因的第1内含子部位，43bp插入发生在hs6st3基因12076-12077之间，鸡基因序列的ncbigenbank登录号nc_006088。本发明首次检测了hs6st3基因第1内含子43bpindel多态性标记在地方鸡、高产蛋鸡中的分布，分析了其在不同品种鸡的基因型分布及等位基因频率。随后将该突变多态与固始鸡-安卡鸡f2资源群体的经济性状进行关联分析，发现该多态性标记与鸡生长性状密切相关，这为筛选出纯合高品质的地方鸡群体奠定基础。
上述的多态性标记在鸡生长性状和/或屠宰性状选育中的应用。具体的，鸡胫围、胸深、盆骨宽、体重、屠体重、半净膛、全净膛、胸肌重、腿肌重、心脏重、腿重性状选育中的应用。优选的，上述的多态性标记在鸡12周龄胫围、4周胸深、12周龄胸深、4周体重、6周体重、4周盆骨宽生长性状选育中的应用。优选的，上述的多态性标记在鸡胸肌重、腿肌重、腿重等屠宰性状选育中的应用。
本发明的新发现的多态性标记可用于鸡的辅助选择和分子育种，有助于节省生产成本并加快遗传选育进展，具有很大的经济应用价值和科研价值。
上述的多态性标记的应用是通过检测如seqidno.1所示序列5‘端起第176-218位插入或缺失，优先选择该片段为纯合缺失的基因型的鸡个体，弃去该片段为纯合插入或杂合插入的基因型的鸡个体。本发明中发现如seqidno.1所示序列5‘端起第176-218位为纯合缺失的基因型的鸡体重及屠宰性状明显优于该片段不缺失或者杂合缺失的基因型的鸡个体，因此弃去该片段为纯合插入或杂合插入的基因型的鸡个体。
具体的，通过pcr扩增检测第176-218位插入或缺失，所述pcr扩增时使用的引物如下所示：上游引物p-f：5‘-ctgtggttcccatgtcactc-3’；
下游引物p-r：5‘-agttagcaaacctgaagagggag-3’。
所述扩增的反应体系为：2×taqpcrmastermix5.00μl，ddh2o3.00μl，p-f0.5μl，p-r0.5μl，dna模板1.0μl。所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
在pcr扩增后，可通过琼脂糖凝胶电泳检测所述pcr扩增的产物的条带大小，以判断所述第176-218位是否缺失。具体的，当在第1内含子区为43bp纯合插入时，扩增产物为一条带，条带大小为247bp，命名为ii基因型；当在第1内含子区发生43bp纯合缺失时，扩增产物为一条带，条带大小为204bp，命名为dd基因型；当该位点为杂合基因型的个体时，扩增产物为两条带，条带大小分别为247bp和204bp，命名为id基因型。
hs6st3基因43bpindel多态性与f2资源群的经济性状的关联性分析表明多态性与鸡的部分重要生产性状有显著关联，d等位基因即43bp的缺失利于鸡的生长，i等位基因即43bp的插入不利于鸡的生长发育，dd基因型为优势基因型。
本发明采用琼脂糖凝胶电泳法检测pcr产物的条带大小，是一种在dna水平上筛查和检测与鸡生长性状密切相关分子遗传标记的方法。所述琼脂糖凝胶电泳检测所用的琼脂的质量分数为3.0％。所述琼脂糖凝胶电泳的电压为120v，电泳时间为50min。
本发明建立的分子生物学方法不需要酶切，分辨率高、检测灵敏、判型准确、操作简单、成本低、周期短，大大提高了该位点基因型判定的准确性，不需要特殊的仪器，易推广普及。试验表明本发明的方法能有效地判定鸡hs6st3基因43bpindel多态性的基因型，可以用于鸡的经济性状位点的分子标记辅助选择，进而建立一个纯合高产的地方鸡种群。
一种鸡hs6st3基因第1内含子43bpindel多态性的检测引物，依据如seqidno.1所示的序列设计，所述检测引物的扩增片段覆盖该序列5‘端起的第176-218位。该引物可以采用现有技术中常用的方法进行设计，也可以根据检测方法的不同进行设计。
具体的，所述引物序列如下所示：
上游引物p-f：5‘-ctgtggttcccatgtcactc-3’；
下游引物p-r：5‘-agttagcaaacctgaagagggag-3’。
包含上述检测引物的检测试剂盒。具体的，还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶中的一种或几种。
上述的检测引物或检测试剂盒在鸡生长性状和/或屠宰性状选育中的应用。
本发明的检测引物及试剂盒，检测结果准确可靠，可操作性强，不需要特殊的仪器，易推广普及，可以用于鸡的辅助选择和分子育种。
附图说明
图1为本发明实施例4的技术流程示意图；
图2为提取的鸡基因组dna琼脂糖凝胶电泳图；
图3为鸡hs6st3基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为鸡hs6st3基因插入、缺失基因型测序图，(a)为插入基因型，(b)为缺失基因型。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1
本实施例中鸡hs6st3基因第1内含子43bpindel多态性标记，其核苷酸序列如seqidno.1所示，5‘端起第176-218位插入或缺失。
该多态性标记中43bp缺失发生在hs6st3基因第一内含子12076与12077位点之间，该基因序列的ncbigenbank登录号为nc_006088。该突变位点的发现是前期对5个淅川乌骨鸡的全基因组重测序数据结果的分析，进一步对该5个个体进行了验证。随后，在不同品种大规模群体中开展了本试验。
实施例2
本实施例中鸡hs6st3基因第1内含子43bpindel多态性标记的检测引物如下所示：
上游引物p-f：5’-ctgtggttcccatgtcactc-3’；
下游引物p-r：5’-agttagcaaacctgaagagggag-3’。
实施例3
本实施例中用于鸡hs6st3基因第1内含子43bpindel多态性标记的检测试剂盒，包括如实施例2所示的引物，还包括dntps、pcr反应缓冲液、dna聚合酶。
实施例4
本实施例中鸡hs6st3基因第1内含子43bpindel多态性标记的应用，其实验思路如图1所示：通过pcr鉴定待测样本43bpindel多态性标记的基因型，最终根据基因型结果，选留需要的优势基因纯合基因型鸡个体。包括如下步骤：
(1)试样的制备与保存
动物材料：固始鸡-安卡鸡f2资源群体、淅川乌骨鸡、东乡鸡、长顺鸡、固始鸡、卢氏鸡、罗曼、b系、h系、海兰褐壳蛋鸡的血液dna均由河南农业大学家禽种质资源创新工程研究中心提供。dna样品均保存于-20℃冰箱保存备用，随机挑选不同品种的血液dna进行琼脂糖凝胶电泳质量检测，鸡基因组dna的检测结果如图2所示。从图中可以看出，这些鸡基因组的质量可靠(其中泳道1、2、3为固始鸡-安卡鸡f2资源群体，4为淅川乌骨鸡，5、6为东乡鸡，7、8为长顺鸡，9、10、11为固始鸡，12、13、14为卢氏鸡，15、16、17、18为海兰褐壳蛋鸡)。
(2)引物设计
以hs6st3基因序列(genbankaccessionnc_006088)为模板设计引物对p，
上游引物p-f：5’-ctgtggttcccatgtcactc-3’；
下游引物p-r：5’-agttagcaaacctgaagagggag-3’。
(3)pcr扩增
以引物对p为引物，建立了10.0μl扩增体系：2×taqpcrmastermix(购自北京康为公司)5.00μl，ddh2o3.00μl，p-f0.5μl，p-r0.5μl，dna模板1.0μl。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
(4)琼脂糖凝胶电泳
称取3.0g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×tbe100ml，微微震荡使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾拿出冷却至65℃后向其中加入6ul的dna核酸染料，充分混匀后快速将琼脂糖溶液倒入已制备好的胶板里，注意防止出现气泡。经过20min待琼脂糖凝胶完全冷却凝固后，拔掉梳子，将凝胶移入电泳槽中。取5ul的pcr扩增产物，上样至琼脂糖凝胶的梳孔中，120v电压电泳50min。
(5)凝胶成像系统成像
结果如图3所示，泳道3、7为扩增产物，其片段大小为204bp，从图中可以看出其与理论设计的大小一致，因此可以证明已成功扩增出鸡hs6st3基因第1内含子区的片段。其中，泳道9：dnamarker(1500，1000，800，600，500，400，300，200和100bp)；泳道1、2、4、5、8泳道为一条带，条带大小为247bp，命名为基因型ii。泳道3、7扩增产物为一条带，条带大小为204bp，命名为基因型dd；泳道6泳道为两条带，条带大小为247bp和204bp，命名为基因型id基因型。
(6)扩增产物测序
选取不同基因型个体的pcr扩增产物进行测序，发现鸡hs6st3基因第1内含子区中存在43bpindel位点，结果见图4。插入时为ii基因型如图4(a)，缺失时为dd基因型如图4(b)，该位点为杂合个体时，为id基因型。其中(a)图虚线框内为43bp的插入序列，b图箭头处为43bp插入位点。测序结果与琼脂糖凝胶电泳判别的基因型完全相同，证实了本检测方法的有效性和准确性。
(7)鸡hs6st3基因43bpindel位点在不同鸡品种中基因型分布及等位基因频率统计
等位基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率，取值在0～1之间。hs6st3基因43bpindel在不同品种鸡中基因型及等位基因频率分布如下表1。
表1hs6st3基因43bpindel在不同品种鸡中基因型及等位基因频率分布
(8)鸡hs6st3基因43bpindel多态性与f2资源群体经济性状的关联分析
对于检测的777个个体f2资源群体中具有完整经济性状记录，可用于该多态位点的关联分析。经济性状测定方法参考文献(hanrl,lizj,limj,etal.novel9-bpindelinvisfatingeneanditsassociationswithchickengrowth.brpoultsci,2011,52(1):52-57.)。其中测定的生长、屠宰指标及肉质指标共57项指标)。
(9)关联分析模型
利用spss(20.00)软件分析基因位点与经济性状的相关性。确保每个性状数据呈正态分布，再利用最小二乘法分析对数据校正根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应和benferroni多重比较法比较各基因型间的差异，结果见表2、3。
表2f2资源群体中hs6st3基因43bp多态性与鸡生长性状的关联分析
表3f2资源群体中hs6st3基因43bp多态性与鸡屠宰性状的关联分析
注：同一行字母相同为差异不显著，不同字母为差异显著。
表2、3关联分析结果显示：该43bp突变多态与12周龄胫围、4周胸深、12周龄胸深、4周体重、6周体重生长性状显著相关(p<0.05)，与4周盆骨宽生长性状极显著相关(p<0.01)。另外与胸肌重、心脏重、腿重屠宰性状显著相关(p<0.05)。虽然很多性状并没有达到统计学显著性，但是整体上dd基因型个体的体重以及体尺指标数值都高于ii基因型，显示dd基因型为优势基因型。所以，我们可以加强对dd基因型个体的选育，来提高鸡的经济性能。
<110>河南农业大学
<120>一种鸡hs6st3基因43bpindel多态性标记及其应用、检测引物、试剂盒
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<211>247
<212>dna
<213>鸡
<221>含43bp插入的hs6st3基因第一内含子特异分子标记
<400>1
ctgtggttcccatgtcactcacaagaattttacttctacaaattcttttcaatttttaaa60
gtagtttctatttaagaaagaaaaaaaggattttttaggggagagaaaacatgtttgttc120
ttgtaagagtcatacatatatttttacagaacaactatttatcacaaatactttgaacca180
catactgcaagtggtggtcagaactacagagcaaaaaaaactttctccctcttcaggttt240
gctaact247
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>上游引物p-f
<400>2
ctgtggttcccatgtcactc20
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<221>下游引物p-r
<400>3
agttagcaaacctgaagagggag23