本发明涉及多孔基材，包括它们的制备方法以及其在安全有效施用活性剂和诊断中的用途，所述多孔基材在孔内嵌入至少一种活性剂，所述孔被用能够在与分析物缔合并形成易于切割的构象后控制所述试剂的释放的核苷酸序列加帽。
现有技术
作为背景被视为本发明公开的主题相关的参考文献列出如下：
1.zhang等人acsnano,7(10),8455–8468(2013)
2.zhang等人j.am.chem.soc.135,1934-1940(2013)
3.yang,q.；wang,s.；fan,p.；wang,l.；di,y.；lin,k.；xiao,f.-s.chem.mater.2005,17,5999-6003.
4.gao,q.；xu,y.；wu,d.；shen,w.；deng,f.langmuir2010,26,17133-17138.
5.zheng,h.；wang,y.；che,s.j.phys.chem.c2011,115,16803-16813.
6.liu,n.；dunphy,d.r.；atanassov,p.；bunge,s.d.；chen,z.；lopez,g.p.；boyle,t.j.；brinker,c.j.nanolett.2004,4,551-554.
7.aznar,e.；casasus,r.；garcia-acosta,b.；marcos,m.d.；mar-tinez-manez,r.；sancenon,f.；soto,j.；amoros,p.adv.mater.2007,19,2228-2231.
8.liu,r.；zhao,x.；wu,t.；feng,p.j.am.chem.soc.2008,130,14418-14419.
9.luo,z.；cai,k.；hu,y.；zhao,l.；liu,p.；duan,l.；yang,w.angew.chem.int.ed.2011,50,640-643.
10.wan,x.；wang,d.；liu,s.langmuir2010,26,15574-15579.
11.yu,a.；wang,y.；barlow,e.；caruso,f.adv.mater.2005,17,1737-1741.
12.park,c.；kim,h.；kim,s.；kim,c.j.amchem.soc.2009,131,16614-16615.
13.lei,c.；shin,y.；liu,j.；ackerman,e.j.j.am.chem.soc.2002,124,11242-11243.
14.takahashi,h.；li,b.；sasaki,t.；miyazaki,c.；kajino,t.；inagaki,s.chem.mater.2000,12,3301-3305.
15.nguyen,t.d.；tseng,h.-r.；celestre,p.c.；flood,a.h.；liu,y.；stoddart,j.f.；zink,j.i.proc.natl.acad.sci.c2005,102,10029-10034.
16.nguyen,t.d.；liu,y.；saha,s.；leung,k.c.-f.；stoddart,j.f.；zink,j.i.j.am.chem.soc.2007,129,626-634.
17.li,d.；wieckowska,a.；willner,i.angew.chem.int.ed.2008,47,3927-3931.
18.miyake,y.；togashi,h.；tashiro,m.；yamaguchi,h.；oda,s.；kudo,m.；tanaka,y.；kondo,y.；sawa,r.；fujimoto,t.；machina-mi,t.；ono,a.j.am.chem.soc.2006,128,2172-2173.
19.ono,a.；togashi,h.angew.chem.int.ed.2004,43,4300-4302.
20.freeman,r.；finder,t.；willner,i.angew.chem.int.ed.2009,48,7818-7821.
21.huang,w.t.；shi,y.；xie,w.y.；luo,h.q.；li,n.b.chem.commun.2011,47,7800-7802.
22.wang,z.-g.；elbaz,j.；remacle,f.；levine,r.d.；willner,i.proc.natl.acad.sci.usa2010,107,21996-22001.
23.liu,j.；cao,z.；lu,y.chem.rev.2009,109,1948-1998.
24.tombelli,s.；minunni,m.；mascini,m.biosens.bioelectron.2005,20,2424-2434.
25.willner,i.；zayats,m.angew.chem.int.ed.2007,46,6408-6418.
26.li,d.；shlyahovsky,b.；elbaz,j.；willner,i.j.am.chem.soc.2007,129,5804-5805.
27.niazov,t.；pavlov,v.；xiao,y.；gill,r.；willner,i.nanolett.2004,4,1683-1687.
28.liu,j.；lu,y.j.am.chem.soc.2004,126,12298-12305.
29.liu,j.；lu,y.j.am.chem.soc.2007,129,9838-9839.
30.dittmer,w.u.；reuter,a.；simmel,f.c.angew.chem.int.ed.2004,43,3550-3553.
31.shlyahovsky,b.；li,d.；weizmann,y.；nowarski,r.；kotler,m.；willner,i.j.am.chem.soc.2007,129,3814-3815.
32.liu,y.；lin,c.；li,h.；yan,h.angew.chem.int.ed.2005,44,4333-4338.
33.kang,h.；o’donoghue,m.b.；liu,h.；tan,w.chem.com-mun.2010,46,249-251.
34.liu,j.；lee,j.h.；lu,y.anal.chem.2007,79,4120-4125.
35.seelig,g.；soloveichik,d.；zhang,d.y.；winfree,e.science2006,314,1585-1588.
36.elbaz,j.；lioubashevski,o.；wang,f.；remacle,f.；levine,r.d.；willner,i.naturenanotech.2010,5,417-422.
37.winfree,e.qian,l.science2011,332,1196-1201.
38.chen,c.；pu,f.；huang,z.；liu,z.；ren,j.；qu,x.nucleicacidsres.2011,39,1638-1644.
39.he,d.；he,x.；wang,k.；cao,j.；zhao,y.adv.funct.mater.2012,doi:10.1002/adfm.201201343
40.zhang,y.；yuan,q.；chen,t.；zhang,x.；chen,y.；tan,w.anal.chem.2012,84,1956-1962
本文中上述参考文献的承认不应被推断为意指这些以任何方式与本发明公开的主题的专利性相关。
背景
介孔二氧化硅(si-mp)是允许在孔中包封底物的多孔结构，且它的表面可进行化学修饰。应用这些性质使用si-mp作为用于催化、药物递送和成像的多用途的混合材料。此外，si-mp的化学修饰使得能够设计用于从基质的孔控释底物的信号响应基质。
实施不同的刺激，诸如ph[2-5]光子信号[6,7]、氧化还原试剂[8-10]或酶[11-14]触发孔的开口，导致包封的底物的控释。因此，si-mp的孔加帽了闸门单元，该闸门单元将底物锁定在孔中，并允许响应刺激解锁闸门和释放底物。例如，实施半轮烷孔加帽的纳米结构的光子拆解(dethreading)以打开孔并释放存储的底物[15,16]。
在核酸的碱基序列中编码的信息提供了发展dna纳米技术领域的机会的丰富的舞台。实施序列引导的和ph刺激的单链dna向i-基序(i-motif)的组装或经由金属离子(例如通过t-hg2+-t桥)的dna双链体的协同结合以发展不同的dna机器[17-19]并发展逻辑闸门[20,21]和有限状态逻辑机器[22]。类似地，序列特异性核酸链揭示对低分子量底物或高分子底物(适体)的特异性结合特性[23-25]或表现出催化性能(dna核酶)[26-29]。适体已被实施以开发dna机器[30，31]或组装程控的纳米结构，[32-34]且催化的核酸被用于开发逻辑闸门和逻辑闸门级联[35-37]。
核酸至介孔sio2的缀合使得能够实现dna“锁定”和“解锁”sio2的孔的信号触发的功能。例如，孔负载了染料底物，并通过i-基序、c-四重体、加帽单元被“锁定”，且随后通过在中性ph值下分离庞大的i-基序结构为随机单链而被“解锁”，从而允许释放底物[38]。在相关的系统中，ph的变化和孔的打开通过光化学过程来刺激[39]。可选择地，介孔sio2的孔用双链体dna单元加帽，且加帽链通过在hg2+离子的存在下的链置换过程被分离，以产生增强的稳定性的t-hg2+-t桥接双链体结构。孔截留的底物的释放，使荧光检测hg2+离子成为可能[40]。
如果任何人可设计其中生物催化过程由特别感兴趣的分析物或生物标志物的主感应(primarysensing)或识别事件激活以确保至特定位点的安全并有效的药物递送的门控系统将是重大的进步。
概述
在它的第一个方面，本发明提供了多孔基材，所述多孔基材包含被截留在所述基材的所述孔内的至少一种活性剂；其中当所述至少一种活性剂被截留在所述孔中时，所述孔(即孔开口)被具有锁定构象的至少一种核酸序列加帽；所述加帽核酸序列能够在与至少一种第一分析物缔合后形成易于切割的构象；从而使所述加帽核酸序列能够被切割并允许释放所述嵌入的至少一种活性剂。
当提及多孔基材时，应该理解为包括支撑常规多孔结构的任何纳米多孔材料(是有机的、金属、半金属或无机的，天然的或人工的)框架。孔的尺寸通常为100纳米或更小。所述基材可呈任何可用的形式，包括纳米颗粒、薄膜、膜等等。多孔基材的非限制性实例包括活性炭、沸石、二氧化硅、氧化锆、氧化铝及其任何组合。所述多孔基材可为微孔材料(具有介于约0.2-2nm之间的孔径)、介孔材料(具有介于约2-50nm之间的孔径)或大孔材料(具有介于约50-1000nm之间的孔径)或其任何组合。
所述基材的孔在它们内截留至少一种活性剂，从而在所述孔内嵌入所述至少一种活性剂。为了在所述孔内截留并锁定(即维持和保持)所述至少一种活性剂，所述孔开口(即，所述孔外部暴露于周围环境的一部分)被至少一种核酸序列加帽。所述加帽通过孔开口的化学修饰而促成，即在孔开口处将所述至少一种核酸序列化学键合至所述多孔材料。
加帽核酸序列(本文中还称为加帽序列或加帽核酸序列)具有这样的构象(本文中称为锁定构像)，所述构象使所述至少一种活性剂截留在所述孔中成为可能，从而允许所述至少一种活性剂保持在所述孔内而不渗漏至所述基材的周围环境。所述加帽核酸序列是包含形成具有以下构象的大分子的至少5个核苷酸的生物抗性序列：在与至少一种第一分析物缔合之前能够加帽它所附着至的孔洞并且防止所述至少一种活性剂扩散出所述基材的孔并将所述活性剂锁定在所述孔内的构象。
在所述加帽核酸序列与至少一种第一分析物缔合后，所述加帽序列能够形成易于切割的构象，即不同于锁定构象的构象，其中所述加帽序列可用于切割(在一些实施方案中，构象至易于切割构象的所述变化允许所述序列水合、所述序列被生物催化剂切割等等)。仅当加帽序列形成时，所述易于切割构象是序列可能的会话(例如通过将核苷酸从其序列暴露于生物催化剂)。加帽序列的切割使所述序列通过由所述生物催化剂破坏加帽序列中的至少一个化学键而从孔开口分离。在切割加帽序列后，被截留在基材的所述孔内的所述至少一种活性剂被释放至所述基材的直接周围环境。
在一些实施方案中，所述孔由至少两种独立的核酸序列加帽。
在其他实施方案中，所述加帽核酸序列是或单链的或双链的。
在一些另外的实施方案中，所述加帽核酸序列包含dna核酶序列。dna核酶序列(还称为脱氧核酶、dna酶或催化的dna)是具有进行化学反应，诸如由与金属离子缔合触发的催化作用，的能力的dna分子。因此，在一些实施方案中，所述加帽序列的所述切割由所述dna核酶加帽序列本身促成。因此，在切割所述dna核酶序列后，靶至少一个第一分析物的再生形成，触发所述活性剂的释放。因此，所述试剂从基材的释放通过甚至小量的分析物(生物标志物)的存在来实现，使得本发明的所述基材对反映所述生物标志物的存在的条件敏感。
在一些另外的实施方案中，所述dna核酶序列被扩展有异质(另外的)核苷酸结构域(具有至少5个更多个核苷酸)，所述异质核苷酸结构域具有游离构象(即不包含任何化合物或不与任何化合物缔合的构象)和在所述异质区域与至少一个第二分析物(其可与第一分析物相同或不同)缔合后实现的活性构象；所述异质或另外的核苷酸结构域可以是适体结合序列或离子结合序列，因此在所述另外的结构域与至少一种适体或至少一种离子缔合后，dna核酶序列的构象变构地改变。仅在达到所述活性构象后，在与所述至少一种第一分析物缔合后，整个所述dna核酶序列能够形成易于切割的构象，从而促使切割所述加帽核酸序列，并允许释放所述嵌入的至少一种活性剂。
在其他实施方案中，所述加帽核酸序列包含rna核酶序列。
在其他实施方案中，所述加帽至少一种核酸序列是发卡环序列。所述发卡环(或茎-环分子内碱基配对)是可发生在单链dna或rna序列中的模式。当同一链的通常以相反方向阅读时核苷酸序列互补的两个区域碱基配对以形成结束于未配对的环的双螺旋时，发卡环结构或构象出现。
在一些实施方案中，所述至少两种独立的加帽核酸序列是至少两种独立的发卡环序列(其可相同或不同)。
在一些实施方案中，具有至少一种核酸发卡环序列的加帽序列在与至少一种第一分析物偶联缔合后形成易于切割的构象，所述至少一种分析物是具有互补序列从而形成双链的核酸链。
在一些实施方案中，所述加帽序列选自以下非限制性列表：
(1)5’-sh(ch2)6caacaacatraggacatagaagaagaag-3’(seq.no.1)
(4)5’-cttcttcttctatgtcagcgatccggaacggcacccatgttgttgtt-g-3’(seq.no.2)
(5)5’-cttcttcttctatgtctccgagccggtcgaaatgttgttg-3’(seq.no.3)
(6)5’-cttcttcttctatgtcagcgatcctgggggagtattgcggaggaag-gcacccatgttgttgttg-3’(seq.no.4)
(7)5’-cttcttcttctatgtcagcgatcttttcggaaacgtttagcacccat-gttgttgttg-3’(seq.no.5)
(8)5’-cttcttcttctatgtctcatgggggagtattgcggaggaaggtcgaaatgttgttg-3’(seq.no.6)
在其他实施方案中，所述加帽序列选自以下非限制性列表：
(1)5’-sh(ch2)6caagggcagaagtcttcactgcccttgcacact-3’tm＝67.3℃(seq.no.7)
(2)5’-agtgtgcaagggcagtgaagacttgattgt-3’(seq.no.8)
(3)5’-agtgtgcaagagcagtgaagacttgattgt-3’(seq.no.9)
(4)5’-agtgtgctagagcagtgaagacttgattgt-3’(seq.no.10)
(5)5’-agtgtgctagagcagttaagacttgattgt-3’(seq.no.11)
(6)5’-sh(ch2)6aacgaagctgaggatgtgttcgtt-3’tm＝58.9℃(seq.no.12)
(7)5’-atcctcagcttcg-3’(seq.no.13)
(8)5’-atcctgagcttcg-3’(seq.no.14)
(9)5’-atcatgagcttcg-3’(seq.no.15)
(10)5’-atcatgagcgtcg-3’(seq.no.16)
(11)5’-sh(ch2)6cctccgctacctgggggagtattgcggaggaaggta-3’tm＝69.8℃(seq.no.17)
(12)5’-sh(ch2)6cctccgcaatactccgctgaggcctgggggagtattgcggaggaaggcctcagc-3’tm＝74.9℃(seq.no.18)
至少一种第一分析物和/或至少第二种第一分析物各自独互地是为至少一种核酸链、至少一种肽、至少一个适体(dna、rna或肽适体)、至少一种金属离子(诸如例如mg+2、zn+2、hg+2)、或其任何组合的生物物质。
在一些实施方案中，所述至少一种第一分析物和/或至少第二种第一分析物是用于至少一种病痛或状况的生物标志物。生物标志物，或生物学标志物是用作一些生物学状态、状况或病痛的指示物的任何物质、化合物或分析物。生物标志物被测量和评估，以检查正常的生物进程、致病进程、或治疗性干预的药物应答。因此，在所述加帽序列与所述至少一种第一分析物和/或至少一种第二分析物缔合后，通过本发明的所述基材进行与这样的分析物相关的状况的识别。仅在这样的识别事件后，加帽序列确实变得易于切割，从而仅当需要时释放所述基材的孔内截留的活性剂。因此，本发明的基材提供了活性剂的安全施用方法(由于如果识别未实现，则试剂不被释放，患者经受较少的副作用)和由于在分析物/生物标志物存在的部位处进行释放的更有效的施用方法。
在一些实施方案中，所述发夹环序列包含使得在与至少一种分析物缔合后能够形成所述易于切割的构象的核苷酸结构域。
在一些另外的实施方案中，所述发夹环序列还包含具有游离构象和在与至少一种第二分析物缔合后的活性构象的核苷酸结构域。
在一些实施方案中，所述加帽序列含切口酶(nicking-enzyme)特异性核苷酸(即易于被切口酶切口或切割的特异性核苷酸位点)。
在一些实施方案中，所述切割通过生物催化剂(即，通过与所述序列催化反应催化所述加帽序列的切割或切口使得它从孔开口中化学地除去的酶)进行。在一些其他实施方案中，所述生物催化剂是外切核酸酶或内切核酸酶。在一些另外的实施方案中，所述生物催化剂是切口酶。
外切核酸酶是通过从多核苷酸链的末端(外)一次一个地切割核苷酸而工作的酶。破坏磷酸二酯键的水解反应在3’或5’末端处发生。内切核酸酶，是切割多核苷酸链的中间(内)的磷酸二酯键的酶。切口酶(或切口内切核酸酶)是在称为限制性位点的特异性识别核苷酸序列处切割双链dna的一条链的酶。这样的酶水解(切开)dna双链体的仅一条链，以产生是“带切口”的，而不是切割的dna分子。
在一些实施方案中，所述基材是半金属氧化物纳米颗粒。在其他实施方案中，所述基材是介孔二氧化硅纳米颗粒。
术语活性剂应理解为包含在它从所述基材的孔释放后具有有益于治疗和/或诊断施用其的患者的生物活性的任何物质。在一些实施方案中，所述至少一种活性剂是药物成分，诸如抗癌药、抗炎药、抗微生物药、抗高血压药、神经保护剂、抗hiv剂等等以及其任何组合。在其他实施方案中，所述活性剂是能够在它从所述基材的孔释放后被检测到的诊断剂。所述诊断剂的检测可通过本领域已知的任何方法，诸如磁共振技术、ct、pet、或其任何组合，来进行。
在另外的方面，本发明提供了向需要其的患者施用活性剂的方法，所述活性剂的释放是状况依赖性的，所述方法包括向所述患者施用多孔基材，所述多孔基材包含被嵌入所述基材的所述孔内的至少一种活性剂；其中所述孔由至少一种核酸序列加帽，所述至少一种核酸序列当所述至少一种活性剂被截留在所述孔中时具有锁定构象；所述加帽核酸序列能够在与与所述状况相关的至少一种第一生物标志物缔合后形成易于切割的构象；从而促使所述加帽核酸序列能够被切割并允许释放所述嵌入的至少一种活性剂。
本发明提供了多孔基材，所述多孔基材包含被嵌入所述基材的所述孔内的至少一种活性剂；其中所述孔由至少一种核酸序列加帽，所述至少一种核酸序列当所述至少一种活性剂被截留在所述孔中时具有锁定构象；所述加帽核酸序列能够在与与至少一种病痛、状况或疾病或其任何症状相关的至少一种第一生物标志物缔合后形成易于切割的构象；从而促使所述加帽核酸序列能够被切割并允许释放所述嵌入的至少一种活性剂；所述基材用于在所述至少一种病痛、状况或疾病或其任何症状的治疗。
如本文所用的术语治疗意指为了与疾病、病痛、紊乱或状况或其任何症状斗争的目的而管理并护理患者。该术语意在包括疾病、病痛、紊乱或状况或其任何症状的进展的延迟，症状和并发症的缓和或减轻，和/或疾病、病痛、紊乱或状况或其任何症状的治愈或消除。待治疗的患者优选地是哺乳动物，特别是人类。
本发明还设想了诊断患者的状况或病痛的方法的方面，所述方法包括向所述患者施用多孔基材，所述多孔基材包含被嵌入所述基材的所述孔内的至少一种试剂；其中所述孔由具有锁定构象的至少一种核酸序列加帽，其中所述至少一种试剂被截留在所述孔中；所述加帽核酸序列能够在与所述状况或病痛的至少一种第一生物标志物缔合后形成易于切割的构象；从而促使所述加帽核酸序列能够被切割并允许向所述患者的体液释放所述嵌入的至少一种试剂；以及在所述患者的所述液体中检测所述至少一种试剂。
本发明提供了制备本发明的多孔基材的方法，所述方法包括以下步骤：(a)连接(即在孔开口处形成化学键)多孔基材与至少一种第一单链核酸序列，从而形成功能化基材；(b)使所述功能化多孔基材与至少一种活性剂接触，从而将所述试剂嵌入所述基材的孔中；(c)使所述嵌入的功能化与互补的第二单链核酸序列接触，从而用所述加帽序列加帽所述多孔基材的所述孔(孔开口)并将所述至少一种活性剂截留在所述孔中；其中所述加帽序列能够在与至少一种第一分析物缔合后形成易于切割的构象。
在本发明的方法的一些实施方案中，所述第二互补单链核酸序列包含具有游离构象和在与至少一种第二分析物缔合后的活性构象的核苷酸结构域；其中所述第二链的活性构象促使所述加帽序列能够在与至少一种第一分析物缔合后形成易于切割的构象。
在另外的方面，本发明提供了制备本发明的多孔质基材的方法，所述方法包括以下步骤：(a)连接多孔基材与至少一种发卡单链核酸序列，从而形成功能化基材；(b)使所述功能化多孔基材与至少一种活性剂在其中所述发卡序列呈随机构象的温度下接触；从而将所述试剂嵌入所述基材的孔中；(c)降低所述功能化嵌入的基材的温度，从而形成所述发卡构象，并加帽所述多孔基材的所述孔，且将所述至少一种活性剂截留在所述孔中；其中所述加帽序列能够在与至少一种第一分析物缔合后形成易于切割的构象。
在一些实施方案中，所述至少一种发卡序列包含具有游离构象和在与至少一种第二分析物缔合后的活性构象的核苷酸结构域；其中活性构象促使所述加帽序列能够在与至少一种第一分析物缔合后形成易于切割的构象。
在本发明的方法的另外的实施方案中，所述加帽序列包含切口酶特异性核苷酸。
在另外的方面，本发明提供了包含本发明的至少一种多孔基材的药物组合物。
当提及包含本发明的至少一种多孔基材的药物组合物时，应理解为包括与药学上可接受的辅助剂，以及任选地其他治疗剂混合的本发明的所述至少一种多孔基材。辅助剂从与组合物的其他成分相容的意义上说必须是“可接受的”且对其接受者是无害的。
药物组合物包括适合于口服、直肠、鼻、局部(包括经皮、口腔和舌下)、阴道或非肠道(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)施用或通过植入物施用的那些。组合物可通过药学领域中熟知的任何方法来制备。
这些方法包括促使本发明的至少一种多孔基材与任何辅助剂缔合的步骤。辅助剂，还称为补助成分，包括本领域那些常规的辅助剂，诸如载体、填充剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味剂、抗氧化剂，和润湿剂。
适于口服施用的药物组合物可呈现为离散的剂量单位，诸如丸剂、片剂、锭剂或胶囊剂，或者呈现为粉末或颗粒，或呈现为溶液或悬浮液。药物成分还可呈现为大丸剂或糊剂。组合物还可加工成栓剂或灌肠剂用于直肠施用。
本发明还包括药物组合物，如以上所述，与包装材料组合，该包装材料包括该组合物用于如上所述的用途的使用说明。
对于非肠道施用，合适的组合物包括水性和非水性无菌注射液。组合物可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的小瓶和安瓿，且可存储于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要加入无菌液体载体，例如水，然后使用。对于经皮施用，可预期例如凝胶剂、贴剂或喷雾剂。适合于肺部施用例如通过鼻吸入的组合物或制剂包括可通过计量剂量的加压气溶胶、喷雾器或吹入器产生的细粉剂或雾。
组合物的施用的确切剂量和方案将必然取决于待实现的治疗或营养效果，且可随特定制剂、施用的途径，及待被施用组合物的个体受试者的年龄和状况而变化。
本申请的发明人已在介孔sio2np作为用于控制孔截留的底物的释放的纳米容器的应用中引入了新的概念。
(i)金属依赖性dna核酶作为功能组分用于“锁定”和“解锁”孔。dna核酶的金属离子驱动催化性能提供孔截留的底物的释放的触发和控制；
(ii)实施两种介孔sio2基质的混合，所述两种介孔sio2基质被用mg2+-或zn2+-依赖性dna核酶功能化，mg2+-或zn2+-依赖性dna核酶作为催化触发物用于各自的孔的多路复用开口。此外，由于不同离子依赖性dna核酶在不同ph值下工作，人们可通过环境ph变化规划孔的dna核酶介导的打开。还可通过电化学或光化学方式调整这样的ph变化；
(iii)孔的离子驱动打开和两种不同荧光染料的释放依据逻辑操作被合理化，其中离子充当输入信号且释放的荧光团提供读出输出信号。因此，可认为系统是用于输入引导底物释放的“智能材料”。这样的系统可用于受控的药物递送、靶向释放药物、和信号触发的启动子产生的药物激活。
(iv)适体底物复合物和/或有毒hg2+-离子变构激活与mp-sio2容器缔合的dna核酶。因此，设想这些系统用作自主感应和治疗系统，其提供了纳米医药的新的方面。生物标志物-引导的适体复合物的形成或有毒金属刺激的dna核酶的活化可提供进入反作用药物的自主释放的指示感应(识别)事件。
由于设计的门控系统中，生物催化过程由特别感兴趣的分析物或生物标志物的初级感应或识别事件激活，并且其中生物催化过程回收并再生分析物，本发明的基材提供了重大的进展。这样的系统释放底物(药物)，作为检测微量生物标志物的结果。
本发明已引入了被截留在mp-sio2np中的底物的新的加帽和释放机制。机制基于将底物封闭在np的孔中的定制的核酸帽和通过分析物(生物标志物)诱导的核酸帽的孔解锁，所述核酸帽在exoiii或切口酶的存在下经受催化断裂。这些耦合感应/催化断裂过程导致分析物(生物标志物)的再生。加帽核酸单元通过互补双链体结构或适体-底物复合物的形成识别基因或分子标志物。该系统提出了感应-和-释放纳米结构，并提出了通过分析物(生物标志物)的再生释放截留的底物的扩大感应过程的手段。
然后，用于从mp-sio2np释放底物的生物催化过程应用于使用核酸或atp作为用于在exoiii或切口酶nb.bbvci的存在下解锁孔的触发物从各锁定的孔释放刺激抗癌药物、喜树碱、cpt。由于与正常细胞比较，atp的代谢合成在癌细胞中增强，且认识到显示exoiii型活性的生物催化剂endogi存在于癌细胞中，因此检查了用atp依赖性发卡(6)锁定的负载cpt的mp-sio2np对mda-231乳腺癌细胞和mcf-10a正常乳腺细胞的存活力的效应。证实了，48小时的时间间隔后，观察到癌细胞的65％细胞死亡，其中正常细胞仅25％细胞遭遇死亡。较高cpt诱导的癌细胞的死亡与癌细胞中atp的增强的合成良好相关。这些结果凸显了在靶癌细胞处通过细胞内生物标志物(atp)解锁并释放化学治疗药物的“智能”负载药物的纳米多孔纳米颗粒的开发。
本申请提供了以下内容：
项目1.一种多孔基材，所述多孔基材包含被截留在所述基材的所述孔中的至少一种活性剂；
其中，当所述至少一种活性剂被截留在所述孔中时，所述孔被具有锁定构象的至少一种核酸序列加帽；
在与至少一种第一分析物缔合后，所述加帽核酸序列能够形成易于切割的构象；从而促使所述加帽核酸序列能够被切割，并允许释放所述嵌入的至少一种活性剂。
项目2.根据项目1所述的多孔基材，其中所述孔通过至少两种独立的核酸序列被加帽。
项目3.根据项目1或2所述的多孔基材，其中所述加帽核酸序列是单链的或双链的。
项目4.根据前述项目的任一项所述的多孔基材，其中所述加帽核酸序列包含dna核酶序列。
项目5.根据项目4所述的多孔基材，其中，所述dna核酶序列被扩展有具有游离构象和在与至少一种第二分析物缔合后的活性构象的异质核苷酸结构域；其中所述dna核酶序列的所述活性构象能够在与所述至少一种第一分析物缔合后形成易于切割的构象，从而使得能够切割所述加帽核酸序列，并允许释放所述嵌入的至少一种活性剂。
项目6.根据项目1所述的多孔基材，其中所述加帽至少一种核酸序列是发卡环序列。
项目7.根据项目2所述的多孔基材，其中所述至少两种独立的核酸序列是至少两种独立的发卡环序列。
项目8.根据项目6所述的多孔基材，其中所述加帽至少一种核酸发卡环序列在与至少一种分析物核酸链偶联缔合后形成易于切割的构象。
项目9.根据项目8所述的多孔基材，其中所述至少一种分析物核酸链是至少一种病痛或状况的生物标志物。
项目10.根据项目6所述的多孔基材，其中所述发夹环序列包含核苷酸结构域，所述核苷酸结构域在与至少一种分析物缔合后促使所述易于切割的构象的能够形成。
项目11.根据项目6所述的多孔基材，其中所述发夹环序列还包含核苷酸结构域，所述核苷酸结构域具有游离构象和在与至少一种第二分析物缔合后的活性构象。
项目12.根据前述项目的任一项所述的多孔基材，其中所述加帽序列包含切口酶特异性核苷酸。
项目13.根据前述项目的任一项所述的多孔基材，其中所述切割通过生物催化剂来进行。
项目14.根据项目13所述的多孔基材，其中所述生物催化剂是外切核酸酶或内切核酸酶。
项目15.根据项目13所述的多孔基材，其中所述生物催化剂是切口酶。
项目16.根据前述项目的任一项所述的多孔基材，其中所述基材是半金属氧化物纳米颗粒。
项目17.根据前述项目的任一项所述的多孔基材，其中所述基材是介孔二氧化硅纳米颗粒。
项目18.一种向需要其的患者施用活性剂的方法，所述活性剂的释放是状况依赖性的，所述方法包括向所述患者施用多孔基材，所述多孔基材包含被嵌入在所述基材的所述孔内的至少一种活性剂；其中当所述至少一种活性剂被截留在所述孔中时所述孔被具有锁定构象的至少一种核酸序列加帽；所述加帽核酸序列能够在与与所述状况相关的至少一种第一生物标志物缔合后形成易于切割的构象；从而促使所述加帽核酸序列能够被切割并允许释放所述嵌入的至少一种活性剂。
项目19.一种诊断患者的状况或病痛的方法，所述方法包括向所述患者施用多孔基材，所述多孔基材包含被嵌入所述基材的所述孔内的至少一种试剂；其中所述孔由具有锁定构象的至少一种核酸序列加帽，其中所述至少一种试剂被截留在所述孔中；所述加帽核酸序列能够在与所述状况或病痛的至少一种第一生物标志物缔合后形成易于切割的构象；从而促使所述加帽核酸序列能够被切割并允许向所述患者的体液释放所述嵌入的至少一种试剂；以及在所述患者的所述液体中检测所述至少一种试剂。
项目20.一种制备项目1所述的多孔质基材的方法，所述方法包括以下步骤：(a)连接多孔基材与至少一种第一单链核酸序列，从而形成功能化基材；(b)使所述功能化多孔基材与至少一种活性剂接触，从而将所述试剂嵌入所述基材的孔中；(c)使所述嵌入的功能化与互补的第二单链核酸序列接触，从而用所述加帽序列加帽所述多孔基材的所述孔，并将所述至少一种活性剂截留在所述孔中；其中所述加帽序列能够在与至少一种第一分析物缔合后形成易于切割的构象。
项目21.根据项目20所述的方法，其中所述第二互补单链核酸序列包含具有游离构象和在与至少一种第二分析物缔合后的活性构象的核苷酸结构域；其中所述第二链的活性构象促使所述加帽序列能够在与至少一种第一分析物缔合后形成易于切割的构象。
项目22.一种制备项目6的多孔质基材的方法，所述方法包括以下步骤：(a)连接多孔基材与至少一种发卡单链核酸序列，从而形成功能化基材；(b)使所述功能化多孔基材与至少一种活性剂在其中所述发卡序列呈不规则构象的温度下接触；从而将所述试剂嵌入所述基材的孔中；(c)降低所述功能化嵌入的基材的温度，从而形成所述发卡构象，并加帽所述多孔基材的所述孔，且所述至少一种活性剂截留在所述孔中；其中所述加帽序列能够在与至少一种第一分析物缔合后形成易于切割的构象。
项目23.根据项目22所述的方法，其中所述至少一种发卡序列包含具有游离构象和在与至少一种第二分析物缔合后的活性构象的核苷酸结构域；其中活性构象促使所述加帽序列能够在与至少一种第一分析物缔合后形成易于切割的构象。
项目24.根据项目20–23的任一项所述的方法，其中所述加帽序列包含切口酶特异性核苷酸。
附图简述
为了更好地理解本文公开的主题并举例说明可如何在实践中进行，现将通过仅非限制性实例的方式，参考附图，描述实施方案，其中：
图1a-1b示出了本发明的实施方案的示意图。图1a示出了使用水溶性胺巯基交联剂n-ε-马来酰亚胺己酸硫代琥珀酰亚胺酯(硫代-emcs)用硫醇化序列(1)功能化的sio2纳米孔。图1b示出了分别使用mg2+依赖性或zn2+依赖性dna核酶的离子介导的mb+或th+从纳米容器的释放的示意图。
图2a-2d示出了在向负载染料的sio2np中加入不同浓度的mg2+-离子，随后向溶液中释放mb+持续60分钟的时间间隔之后，溶液中mb+的荧光光谱：(a)0mm、(b)0.1mm、(c)0.5mm、(d)1mm、(e)5mm、(f)10mm、(g)25mm、(h)50mm；(图2a)。图2b示出了从(1)/(4)功能化sio2np的孔释放的mb+作为mg2+离子浓度函数的校正曲线。图2c示出了在mb+释放后的时间依赖性的荧光变化。曲线(a)-用10mmmg2+离子处理(1)/(4)功能化sio2np后；曲线(b)-在mg2+离子的不存在下处理(1)/(4)功能化sio2np后。图2d示出了在用不同金属离子(10mm)处理(1)/(4)功能化sio2np持续60分钟的时间间隔后mb+的荧光变化。
图3a-3d示出了在向负载染料的sio2np中加入不同浓度的zn2+离子，然后向溶液中释放th+持续40分钟的时间间隔后，溶液中th+的荧光光谱：(a)0mm、(b)0.05mm、(c)0.1mm、(d)0.5mm、(e)1mm、(f)5mm、(g)10mm、(h)20mm。(b)从(1)/(5)功能化sio2np的孔释放的th+作为zn2+离子浓度函数的校正曲线。(c)在th+释放后时间依赖性荧光变化。曲线(a)-用5mmzn2+离子处理(1)/(5)功能化sio2np后；曲线(b)-在zn2+离子的不存在下处理(1)/(5)功能化sio2np后。(d)在用不同金属离子(5mm)处理(1)/(5)功能化sio2np持续40分钟的时间间隔后th+的荧光变化。(用于消除pb2+干扰的pdca浓度是10mm)。
图4a-4d示出了在任何输入信号的不存在下(0,0)(图4a)；图4b，在mg2+(10mm)和zn2+(0mm)的存在下，(1,0)；图4c，在mg2+(0mm)和zn2+(5mm)的存在下，(0,1)；以及图4d，在mg2+(10mm)和zn2+(5mm)的存在下，(1,1)，mb+和th+的双重荧光输出。
图5a-5c涉及使用包含atp适体序列的mg2+依赖性dna核酶的离子介导的mb+从纳米容器的释放。图5a是使用包含atp适体序列的mg2+依赖性dna核酶的离子介导的mb+从纳米容器的释放的示意图。图5b示出了在加入(a)0mg2+、0atp；(b)0mg2+、100μmatp；(c)20mmmg2+、0atp；(d)20mmmg2+、100μmatp后，在90分钟的时间间隔后，溶液中mb+的荧光光谱。图5c示出了在使用0mg2+、0atp(曲线(a))；0mg2+、100μmatp(曲线(b))；20mmmg2+(曲线(c))、0atp；20mmmg2+、100μmatp(曲线(d))释放mb后，时间依赖性荧光变化。
图6a-6c涉及使用包含能够在hg2+离子的存在下形成发卡结构的异质序列的mg2+依赖性dna核酶的离子介导的mb+从纳米容器的释放。图6a是使用包含能够在hg2+离子的存在下形成发卡结构的异质序列的mg2+依赖性dna核酶的离子介导的mb+从纳米容器释放的示意图。图6b示出了在加入(a)0mg2+、0hg2+；(b)0mg2+、1μmhg2+；(c)20mmmg2+、0hg2+；(d)20mmmg2+、1μmhg2+后，在60分钟的时间间隔后，溶液中mb+的荧光光谱。图6c是在使用0mg2+、0hg2+(曲线(a))；0mg2+、1μmhg2+(曲线(b))；20mmmg2+(曲线(c))、0hg2+；20mmmg2+、1μmhg2+(曲线(d))释放mb后，时间依赖性荧光变化。
图7a-7b示出了在10mmmg2+离子的存在(a)或不存在(b)下使用(1)/(4)修饰的mp-sio2np，在60分钟的时间间隔后，多柔比星在溶液中的荧光光谱(图7a)。图7b示出了在0mg2+、0atp(曲线(a))；0mg2+、100μmatp(曲线(b))；20mmmg2+、0atp(曲线(c))；20mmmg2+、100μmatp(曲线(d))的存在下，使用(1)/(6)修饰的mp-sio2np，在90分钟的时间间隔后，多柔比星在溶液中的荧光光谱。
图8a-8e示出了使用分析物-dna生物标志物作为打开发卡的活化剂并实施exoiii作为再生dna生物标志物的生物催化剂，解锁发卡-介孔sio2np并释放若丹明b，rhb(图8a)。图8b示出了，在exoiii(1u/μl)的存在下，在使mp-sio2np(10mg)经受不同浓度的生物标志物分析物持续60min的固定的时间间隔后，相应于rhb释放的荧光光谱。(a)0nm；(b)50nm；(c)100nm；(d)500nm；(e)1μm；(f)2.5μm。图8c是在(2)的恒定浓度(1μm)的存在下，在使mp-sio2np(10mg)经受不同浓度的exoiii持续60min的固定的时间间隔后，相应于rhb释放的荧光光谱。(a)0u/μl；(b)0.05u/μl；(c)0.1u/μl；(d)0.5u/μl；(e)1u/μl；(f)2u/μl。图8d是在rhb通过以下从mp-sio2np释放后观察到的时间依赖性荧光变化：(a)负载rhb的系统没有用标志物(2)或exoiii处理；(b)负载rhb的系统仅用生物标志物dna(2)(1μm)处理，没有加入exoiii；(c)负载rhb的系统仅用exoiii(1u/μl)处理，而没有加入(2)；(d)负载rhb的mp-sio2np用(2)(1μm)和exoiii(1u/μl)处理。图8e是在锁定发卡的负载rhb的mp-sio2np用以下处理后，释放rhb的荧光光谱：(a)无dna生物标志物；(b)、(c)和(d)分别用各自1μm的一个、两个、三个碱基突变体dna生物标志物(3)、(4)和(5)处理；(e)用(2)(1μm)处理。在所有实验中，exoiii(1u/μl)包括在系统中，且在60min的固定的时间间隔后记录荧光光谱。
图9a-9e涉及使用分析物-dna生物标志物作为打开发卡的活化剂并实施nb.bbvci切口酶作为再生dna生物标志物的生物催化剂用，解锁发卡-介孔sio2np并释放若丹明b，rhb(图9a)。图9b示出了，在nb.bbvci切口酶(0.5u/μl)的存在下，在使mp-sio2np(10mg)经受不同浓度的生物标志物分析物持续60min的固定的时间间隔后，相应于rhb释放的荧光光谱。(a)0nm；(b)50nm；(c)100nm；(d)500nm；(e)1μm；(f)2.5μm。图9c示出了，在(7)的恒定浓度(1μm)的存在下，在使mp-sio2np(10mg)经受不同浓度的nb.bbvci切口酶持续60min的固定的时间间隔后，相应于rhb释放的荧光光谱。(a)0u/μl；(b)0.05u/μl；(c)0.1u/μl；(d)0.5u/μl；(e)1u/μl；(f)2u/μl。图9d示出了在rhb通过以下从mp-sio2np释放后观察到的时间依赖性荧光变化：(a)负载rhb的系统没有用生物标志物(7)或切口酶处理；(b)负载rhb的系统仅用生物标志物dna(7)(1μm)处理，没有加入切口酶；(c)负载rhb的系统仅用切口酶(0.5u/μl)处理而没有加入(7)；(d)负载rhb的mp-sio2np用(7)(1μm)和切口酶(0.5u/μl)处理。图9e示出了在锁定发卡的负载rhb的mp-sio2np用以下处理后，释放rhb的荧光光谱：(a)无dna生物标志物；(b)、(c)和(d)分别用各自1μm的一个、两个、三个碱基突变体dna生物标志物(8)、(9)和(10)处理；(e)用(7)(1μm)处理。在所有实验中，nb.bbvci切口酶(0.5u/μl)包括在系统中，且在60min的固定的时间间隔后记录荧光光谱。
图10a-10e涉及通过经由形成atp-适体复合物打开发卡门控单元，同时用exoiii再生atp-生物标志物解锁发卡门控的mp-sio2np并释放rhb(图10a所示)。图10b示出了，在exoiii(1u/μl)的存在下，在用不同浓度的atp处理发卡保护的负载rhb的mp-sio2np持续90min的固定的时间间隔后，相应于rhb释放的荧光光谱。(a)0μm；(b)100μm；(c)500μm；(d)1mm；(e)2mm。图10c示出了在用不同浓度的exoiii和恒定浓度(1mm)的atp处理持续90min的固定的时间间隔后，相应于rhb从负载rhb的mp-sio2np释放的荧光光谱。(a)0u/μl；(b)0.1u/μl；(c)0.5u/μl；(d)1u/μl。图10d示出了在用以下处理负载rhb的mp-sio2np后，时间依赖性荧光变化：(a)无atp和无exoiii；(b)仅在atp(1mm)的存在下，没有exoiii；(c)仅在exoiii(1u/μl)的存在下，没有atp；(d)在atp(1mm)和exoiii(0.5u/μl)的存在下。图10e示出了证实atp特异性解锁孔的选择性研究。相应于rhb从负载rhb的mp-sio2np中释放的荧光光谱：(a)在atp的不存在下；(b)、(c)和(d)分别在utp、gtp、ctp各1mm的存在下；(e)在atp(1mm)的存在下。在exoiii(1u/μl)的存在下并在90min的固定的时间间隔后记录所有的荧光光谱。
图11a-11e涉及通过经由形成atp-适体复合物打开发卡门控单元，同时用nb.bbvci切口酶再生atp-生物标志物解锁发卡门控的mp-sio2np并释放rhb(图11a所示)。图11b示出了，在nb.bbvci切口酶(0.5u/μl)的存在下，在用不同浓度的atp处理发卡保护的负载rhb的mp-sio2np持续90min的固定的时间间隔后，相应于rhb释放的荧光光谱。(a)0μm；(b)100μm；(c)500μm；(d)1mm；(e)2mm。图11c示出了，在用不同浓度的nb.bbvci切口酶和恒定浓度(1mm)的atp处理持续90min的固定的时间间隔后，相应于rhb从负载rhb的mp-sio2np释放的荧光光谱。(a)0u/μl；(b)0.1u/μl；(c)0.5u/μl；(d)1u/μl。图11d示出了在用以下处理负载rhb的mp-sio2np后，时间依赖性荧光变化：(a)无atp且无切口酶；(b)仅在atp(1mm)的存在下，没有切口酶；(c)仅在切口酶(0.5u/μl)的存在下，没有atp；(d)在atp(1mm)和切口酶(0.5u/μl)的存在下。图11e示出了证实atp特异性解锁孔的选择性研究。相应于rhb从负载rhb的mp-sio2np中释放的荧光光谱：(a)在atp的不存在下；(b)、(c)和(d)分别在ctp、utp、gtp各1mm的存在下；(e)在atp(1mm)的存在下。在nb.bbvci切口酶(1u/μl)的存在下并在90min的固定的时间间隔后记录所有的荧光光谱。
图12a-12d示出了，在exoiii(1u/μl)的存在下，在使mp-sio2np(10mg)经受不同浓度的生物标志物分析物持续60min的固定的时间间隔后，相应于cpt释放的荧光光谱。图12a(a)0nm；(b)50nm；(c)100nm；(d)500nm；(e)1μm；(f)2.5μm。图12b示出了在cpt通过以下从mp-sio2np释放后观察到的时间依赖性荧光变化：(a)负载cpt的系统没有生物标志物(7)或exoiii；(b)负载cpt的系统仅用生物标志物(7)(1μm)处理，没有exoiii；(c)负载cpt的系统仅用exoiii(1u/μl)处理而没有(7)；(d)负载cpt的mp-sio2np用(7)(1μm)和exoiii(1u/μl)处理。图12c示出了，在nb.bbvci切口酶(0.5u/μl)的存在下，在使mp-sio2np(10mg)经受不同浓度的生物标志物分析物持续60min的固定的时间间隔后，相应于cpt释放的荧光光谱。(a)0nm；(b)50nm；(c)100nm；(d)500nm；(e)1μm；(f)2.5μm。图12d)在cpt通过以下从mp-sio2np释放后观察到的时间依赖性荧光变化：(a)负载cpt的系统没有生物标志物(2)或切口酶；(b)负载cpt的系统仅用生物标志物(2)(1μm)处理，没有切口酶；(c)负载cpt的系统仅用切口酶(0.5u/μl)处理而没有生物标志物(2)；(d)负载cpt的mp-sio2np用(2)(1μm)和切口酶(0.5u/μl)处理。
图13a-13d示出了，在exoiii(1u/μl)的存在下，在用不同浓度的atp处理mp-sio2np持续90min的固定的时间间隔后，相应于cpt释放的荧光光谱。图13a(a)0μm；(b)100μm；(c)500μm；(d)1mm；(e)2mm。图13b)在用以下处理负载cpt的mp-sio2np后，时间依赖性荧光变化：(a)无atp且无exoiii；(b)在atp(1mm)的存在下，没有exoiii；(c)在exoiii(1u/μl)的存在下，没有atp；(d)在atp(1mm)和exoiii(0.5u/μl)的存在下。图13c示出了，在nb.bbvci切口酶(0.5u/μl)的存在下，在用不同浓度的atp处理mp-sio2np持续90min的固定的时间间隔后，相应于cpt释放的荧光光谱。(a)0μm；(b)100μm；(c)500μm；(d)1mm；(e)2mm。图13d示出了以下的负载cpt的mp-sio2np的处理后，时间依赖性荧光变化：(a)无atp且无切口酶；(b)仅在atp(1mm)的存在下，没有切口酶；(c)在切口酶(0.5u/μl)的存在下，没有atp；(d)在atp(1mm)和切口酶(0.5u/μl)的存在下。3435
图14a-14b示出了与正常乳腺细胞(mcf-10a)比较，乳腺癌细胞(mda-mb-231)中cpt-mp-sio2的细胞毒性。与正常乳腺细胞(mcf-10a)比较，乳腺癌细胞(mda-mb-231)中cpt-mp-sio2的细胞毒性。图14a)在不同的时间间隔下具有内吞的fitc示踪的和负载cpt的mp-sio2np的mda-mb-231乳腺癌细胞的epi-荧光显微镜图像(内吞作用通过用150μg/ml二氧化硅np处理细胞培养物来实现，参见实验部分)。上图：与内吞颗粒缔合的fitc绿色荧光。下图：细胞中释放的cpt的蓝色荧光。图14b)在两个时间间隔(24h、48h)下相应于图i–mda-mb-231乳腺癌细胞；图ii-正常mcf-10a乳腺上皮细胞的细胞存活力结果：(a)未用负载cpt的mp-sio2np处理的细胞。(a)用负载cpt的mp-sio2np处理的细胞。(c)用20μg/ml游离的cpt处理的细胞。(d)用25μg/ml寡霉素，并随后用负载cpt的mp-sio2np处理的细胞。
具体实施方式
在本发明中，引入金属依赖性催化核酸作为用于打开介孔sio2的孔并释放孔截留的荧光底物的功能触发器。通过混合用mg2+或zn2+依赖性dna核酶功能化的两种介孔sio2混合物(hybrid)，荧光团的选择性(或多路复用)释放通过各自底物来证实，mg2+或zn2+依赖性dna核酶作为加帽单元将两种不同荧光团锁定在孔中。
另外，证实了由mg2+-序列或zn2+-序列组成的复合dna结构封闭两种介孔材料的孔中的染料(截留的底物)。仅在适体-底物复合物或金属离子核酸桥的合作形成这一触发活性dna核酶结构形成的过程后，由各自的dna核酶进行孔的打开。由于在特定离子(mg2+、zn2+)的存在下或在适体底物(atp)的共同掺入或共加入金属离子(hg2+)后孔打开，这些加入的组分被认为是用于逻辑运算的输入信号，孔的打开的触发，和截留的底物的释放作为这些逻辑运算的输出信号。
根据文献[51]制备直径为(350-400nm的介孔sio2np。估计孔直径是3nm，且介孔复合物的表面面积相应于632.8m2/g，且平均孔体积为7.2x10-2cm3/g。根据图1a，np用包含序列(1)的硫醇化核糖核苷碱基(ribonucleo-base)来功能化。(1)相应于mg2+依赖性-dna核酶的底物的序列，(mp-sio2-a)序列；和相应于zn2+依赖性dna核酶的底物的序列，(mp-sio2-b)。mp-sio2-a作为客体(guest)底物与亚甲蓝mb+,(2)相互作用，然而mp-sio2-b经受硫堇溶液th+,(3)，以分别负载介孔纳米颗粒。然后，负载mb+的mp-sio2-a和负载th+的mp-sio2-b分别用各自的mg2+依赖性和zn2+依赖性dna核酶序列(4)和(5)来处理。dna核酶序列(4)和(5)与(1)官能化颗粒的杂交产生分别捕获mp-sio2-a或mp-sio2-b的孔中的染料mb+或th+的双链体结构。彻底洗涤所得的sio2-np以除去与孔外面的表面结构域缔合的任何mb+或th+单元(参见图2s)。所得np保留非解离型染料的深颜色，意味着染料以锁定构象被截留在mp-sio2孔中。
图1b描述了离子介导的从各自的mp-sio2容器基质选择性释放mb+或th+染料的原理。在mg2+或zn2+离子的存在下，活性mg2+或zn2+依赖性dna核酶分别在(4)-mp-sio2-a或(5)-mp-sio2-b上生成。这分别导致了底物(4)和/或(5)的切割，导致双链体dna插入物的解离并分别释放mb+或th+。
图2a示出了，在用不同浓度mg2+处理(1)/(4)功能化mp-sio2-a后，在60分钟的固定的时间间隔后，在本体溶液中观察到的mb+的荧光。当mg2+的浓度增加时，通过从孔中释放在本体中生成的mb+荧光加强。图2b描绘了所得的校正曲线，表明在ca.10mm的mg2+浓度下，从孔中释放的mb+达到饱和值。图2c，曲线(a)，示出了在用mg2+离子(10mm)(1)/(4)功能化mp-sio2-a的处理后，时间依赖性荧光变化。本体溶液中的荧光随时间增加，并在ca.60分钟后达到饱和值。为了比较，图2c，曲线(b)，描绘了在mg2+的不存在下，在(1)/(4)修饰的mp-sio2-a的处理后，溶液中时间依赖性荧光变化。荧光变化基本上较低，且这些可归因于残余mb+从孔的外部的表面结构域的解吸，或归因于mb+从不完全封闭的孔的缓慢渗漏。在mb+释放60分钟后，从(1)/(4)-mp-sio2-a系统中获得的荧光强度，并使用适当的校正曲线，我们估计ca.2.7μmole/gsio2np的mb+通过dna核酶介导的加帽单元切割释放。图2d示出了用不同金属离子处理(1)/(4)修饰的mp-sio2-anp后，时间依赖性荧光变化。显然，选择性得到证明，且仅在mg2+的存在下，可观察到由于mb+从孔中释放而在本体溶液中增强的荧光。这些结果表明，mg2+依赖性dna核酶切割掉双链体dna锁定单元，从而促使mb+从孔的释放。特别令人关注的是，表现出的选择性，显示(1)/(4)-mp-sio2-a复合物对zn2+不敏感。这允许(1)/(5)-mp-sio2-b通过zn2+离子的选择性激活和硫堇从该复合物的释放。
以(1)/(5)功能化截留的硫堇，th+，(3)显示了相似的结果。图3a描绘了，在用不同浓度zn2+离子处理(1)/(5)功能化mp-sio2-bnp持续40分钟的固定的时间间隔后，本体溶液中th+的荧光强度。当zn2+的浓度增加时，本体溶液中的荧光加强，与th+从孔的增强的释放一致。所得的校正曲线示于图3b中，表明，在ca.5mm的zn2+浓度下，荧光水平趋于饱和值。图3c，曲线(a)示出了在zn2+，5mm的存在下，在(1)/(5)-mp-sio2-b的处理后时间依赖性荧光变化，而图4c，曲线(b)，描绘了在zn2+离子的不存在下，时间依赖性荧光变化。显然，在通过zn2+依赖性dna核酶激活th+的释放后，在40分钟的时间间隔后，时间依赖性荧光变化高出ca.4.2倍。从获得的荧光强度并使用适当的校正曲线，我们估计ca.3.9μmole/gsio2的th+从孔释放。在zn2+的不存在下，时间依赖性荧光变化归因于由通过(1)/(5)双链体不完全封闭孔所致的th+从孔的渗漏和/或由于残余th+从纳米颗粒上的非孔结构域解吸。th+从孔的增强的释放仅在zn2+离子的存在下进行，且所有其他加入的离子(除了pb2+)不影响th+从孔的释放，图3d。pb2+对孔的选择性打开的干扰可通过加入充当用于结合pb2+离子的选择性配体的2,6-吡啶二羧酸(pdca)来消除。
在pdca的存在下，消除孔的pb2+-诱导的打开而不影响孔的zn2+-离子刺激的打开。因此，推断，zn2+-依赖性dna核酶仅激活th+从(1)/(5)-mp-sio2-b容器的释放。由负载mb+的(1)/(4)-mp-sio2-anp和负载th+的(1)/(5)-mp-sio2-bnp组成的混合物用mg2+离子和zn2+离子的处理，导致mb+和th+从两种纳米颗粒容器释放。因此，mg2+和zn2+离子被认为是用于激活“and”逻辑闸门操作的输入信号，图4。mb+和th+的双重荧光输出被认为是“真实”输出“1”。因此，在不存在任何输入信号(0,0)下，仅观察到非常低的荧光，输出“0”，图4a。在mg2+或zn2+，输入信号(1,0)或(0,1)的存在下，仅生成mb+或th+的一个强烈荧光输出(输出“0”)，图4(b)和(c)。在mg2+和zn2+离子的存在下，观察到两种染料mb+和th+的强烈荧光带，得到输出“1”，图4d，and门控。
金属依赖性dna核酶的活性由发卡环中结合各自的金属离子的保守碱基序列，以及由用于dna核酶底物的结合的保守序列来控制。已证明异质碱基掺入进dna核酶的序列特异性环扰乱环对金属离子的结合亲和力，可能由于加入的碱基链的柔性导致dna核酶活性的降低。因此，预期柔性异质寡核苷酸序列掺入进mg2+或zn2+序列特异性环会扰乱dna核酶活性。然而这些加入的异质序列结合辅助底物/金属离子(例如，通过形成环或双链体)的设计可刚化dna核酶的环序列，从而恢复生物催化活性。即，设想通过设计进入dna核酶环的适体序列或链间金属结合序列，经由形成适体-底物复合物或金属离子稳定化双链体而变构激活dna核酶。实施该模式以通过atp适体复合物辅助或通过胸腺嘧啶-hg2+-腺嘧啶辅助激活mg2+依赖性dna核酶影响mb+从负载mb+的mp-sio2的释放。图5a示意性地示出了导致引起mb+从孔的释放的mg2+依赖性dna核酶的atp引导的组装的核酸纳米结构。核酸(6)包括对mg2+依赖性dna核酶特异性的碱基序列和包含atp适体序列的插入序列。预期(6)和(1)功能化ms-sio2的杂交形成柔性环结构，其展现结合mg2+的低亲和力，从而导致切割(1)并释放孔截留的mb+的无效催化剂。在atp的存在下，期望适体结构域折叠成发卡适体-atp复合物，从而导致dna核酶序列的刚化和与dna核酶序列缔合的碱基的空间邻近。在这些情况下，我们预期将进行mg2+与dna核酶环的有效结合。这将激活dna核酶以切割(1)，同时从孔释放mb+。
因此，通过(6)与(1)的杂交，使用(1)/(6)纳米结构作为用于孔的阻塞物单元使mb+截留在(1)-修饰的mp-sio2np的孔中。图5b，曲线(a)，描绘了在水性溶液中搅拌(1)/(6)-mb+锁定的mp-sio2np90分钟后，本体溶液中mb+的荧光光谱。观察到mb+的低荧光带，其归因于mb+从孔的渗漏和与非孔结构域缔合的痕量mb+的部分解吸。图5b，曲线(b)，描绘了在加入的atp的存在下由系统产生的荧光强度。未观察到atp对所得荧光的影响，意味着单独的atp不具有对孔的打开的影响。在mg2+的存在下，而没有加入的atp，由系统产生的荧光增加了40％，图5b，曲线(c)。该荧光值应该与在相似条件下在mg2+的存在下由(1)/(4)-mp-sio2产生的荧光比较(3倍荧光增强)。因此，结果表明，可能由于不有效结合mg2+离子的链(5)的柔性，包含插入的适体序列的突变的链(6)展现了低的催化活性。反过来，向该系统中加入atp，并在mg2+离子的存在下，导致mb2+从孔的有效释放和高荧光，图5b，曲线(d)。这些结果清楚地暗示atp-适体复合物的形成导致结合mg2+的刚化环的组装，产生用于切割(1)并打开孔的有效催化剂。图5(c)示出了不同系统中时间依赖性荧光变化。从由atp-适体-(1)/(6)-负载mb+的mp-sio2系统产生的饱和荧光值，并使用适当的校正曲线，我们估计在90分钟的时间间隔后，从孔释放ca.1.9μmole/gsio2的npmb+。在atp适体序列插入进zn2+-依赖性dna核酶的环区域后，观察到了非常相似的结果，(参见图s3)。我们发现，虽然zn2+-dna核酶突变的序列在从ms-sio2孔释放硫堇中是无效的，但atp-适体复合物的变构形成组装了导致有效打开孔并释放硫堇的活性zn2+-dna核酶环。
以上说明了通过适体-底物复合物形成的mg2+依赖性dna核酶和zn2+依赖性dna核酶的变构激活，这从而导致触发打开mp-sio2的孔，并从孔有效释放mb+或th+。dna核酶活性的相似变构控制通过使用金属离子(例如，hg2+)作为启动剂来实现。这例示于图6a中，其中核酸(7)包括mg2+依赖性dna核酶的两个结构域。将异质序列插入进保守的dna核酶序列中，且异质序列包含能够在hg2+离子的存在下形成t-hg2+-t桥接发卡结构的6-胸腺嘧啶碱基。因此，(7)与(1)功能化mp-sio2的杂交导致基质的孔中的mb+锁定。预期(7)的放大的环结构及它的柔性产生结合mg2+的不良纳米环境，并因此形成“解锁”孔的无效dna核酶。在hg2+离子的存在下，插入的序列形成发卡t-hg2+-t桥接结构，且这接触并刚化dna核酶环结构。结果，加入的hg2+变构激活mg2+-dna核酶结构，因此允许(1)的催化切割、孔的打开和孔负载的mb+的释放。图6b描绘了，在mg2+离子和hg2+的不存在下，曲线(a)，或仅在hg2+离子的存在下，曲线(b)，在互相作用(1)/(7)-锁定的mb+-mp-sio2后，本体溶液的荧光光谱。仅检测到残余的低强度荧光，其在hg2+离子的不存在或存在下是相同的。这些结果表明，与(7)相互作用的hg2+离子不促进mb+从孔的释放。在hg2+的不存在下，用mg2+-离子处理(1)/(7)-负载mb+的ms-sio2，导致本体溶液中的荧光非常低的增加，图6(b)，曲线(c)，暗示孔仍被锁定，导致mb+的弱释放。在共加入的hg2+-离子的存在下和在mg2+-离子的存在下，本体溶液中产生了高荧光，表明mb+从孔的有效释放(曲线d)。从不同系统释放mb+后，时间依赖性荧光变化描绘于图6c中。因此，共加入的hg2+离子充当用于催化切割(1)并从系统释放(2)的mg2+依赖性dna核酶的变构启动剂。从由hg2+/mg2+-(1)/(7)负载mb+的mp-sio2产生的荧光的饱和水平，图6c，曲线(d)，并使用各自校正曲线，我们估计在ca.60分钟的时间间隔后，ca.2.3μmole/gsio2np的(2)从孔释放。
还检查了抗癌药物多柔比星的mg2+诱导的释放的模型系统。图7a示出了将mg2+离子加入至(1)/(4)-加帽的截留多柔比星的sio2孔，导致孔的打开和药物的释放。特别令人关注的是，atp合作协同mg2+打开孔并释放多柔比星。在癌细胞中观察到的快速代谢产生大量的atp，并因此所得的atp可充当用于在癌细胞处靶向释放多柔比星的活性单元。图7b示出了在孔中通过用(1)/(6)双链体结构加帽它们截留的多柔比星，不通过单独的atp释放，通过仅mg2+离子无效释放，然而通过加入atp和mg2+离子有效释放。即，atp与(6)的适体序列的结合刚化了mg2+依赖性dna核酶的环序列，因此导致有效切割(1)并打开孔。
本发明还涉及负载了罗丹明b，rhb的dna门控的介孔sio2纳米颗粒，mp-sio2np，该rhb充当显示互补“感应”并“释放”功能的“智能”材料。dna孔加帽单元的解锁通过生物催化切割dna来实现，且解锁过程通过分析物-触发物的再生来放大。负载rhb的mp-sio2np用将rhb锁定在孔中的核酸发卡结构来加帽。通过核酸分析物触发物或通过形成适体-底物(atp)复合物打开发卡结构，以形成通过外切核酸酶iii、exoiii或切口酶，nb.bbvci切割的双链体结构。这导致靶分析物的再生、孔的自主解锁，及rhb的释放。该系统显示了选择性，并且靶dna中一个、两个、三个碱基突变或用其他核苷酸三磷酸取代atp阻止孔的解锁。类似于模型荧光底物的生物催化释放，抗癌药物喜树碱，cpt被截留在由(1)或(11)发卡结构锁定的孔中。药物在核酸(2)或atp和作为生物催化剂的exoiii的存在下从孔中释放。类似地，通过(6)或(12)发卡锁定在孔中的cpt，分别在atp以及作为切口酶的nb.bbvci的存在下从孔中释放。检查了用atp依赖性锁(6)加帽的负载cpt的mp-sio2np对mda-231乳腺癌细胞和mcf-10a正常乳腺细胞的存活力的效应。发现，对于mda-231癌细胞，观察到在48小时后65％细胞死亡，而对于正常细胞，仅观察到25％细胞死亡。癌细胞的较高细胞死亡与癌细胞中atp的增强的代谢合成良好相关。
此外，本发明设想用本文所述的功能性核酸门控mp-sio2np的孔，以及通过耦合识别/生物催化效应解锁孔。分析物(生物标志物)的识别事件使加帽元件转化为经历生物催化切断的新的功能元件。切断过程断裂加帽单元的部分，并释放分析物生物标志物用于进一步自主催化降解加帽元件，因此解锁孔，并允许释放孔截留的材料。因此，本文提出了感应生物标志物的“智能”模型材料的组装，该生物标志物触发自主生物催化解锁孔并从孔容器释放底物(药物的类似物)。生物标志物的生物催化再生提供了其中低量的生物标志物允许释放高含量的截留的底物(药物)的放大机制。
根据chen,c.；pu,f.；huang,z.；liu,z.；ren,j.；qu,x.nucleicacidsres.2011,39,1638-1644中报道的方法制备氨丙基硅氧烷-mp-sio2(300～400nm直径)。介孔材料显示了相应于733m2/g的表面面积，2-3nm的平均孔直径和0.19cm3/g的平均孔体积。
图8(a)描绘了一个耦合的感应/生物催化解锁过程，其实现核酸功能化mp-sio2np及外切核酸酶iii，exoiii，36-38作为生物标志物再生生物催化剂。exoiii的生物催化活性需要双链体结构，并且它水解消化双链体dna结构的3’-末端。因此，核酸(1)的5’-末端共价地连接至使用磺基-emcs作为共价交联剂的胺功能化mp-sio2np。核酸(1)包含在室温下产生包括用于识别核酸生物标志物的单链环的发卡结构的合适的碱基序列。然而，发卡结构显示了低解链温度(67.3℃)，并因此在较高温度下以无规则卷曲单链构型存在，且在室温下(25℃)它折叠成强力稳定化的发卡结构。因此，在90℃下，mp-sio2的孔负载了罗丹明b，rhb，作为荧光染料，该温度下核酸(1)呈无规则卷曲结构。然后，允许系统冷却至25℃，此时(1)折叠成发卡结构。负载了rhb的mp-sio2np被染料染色，但荧光染料不可移动，意味着染料事实上被截留于孔中。随后洗涤mp-sio2np以除去与孔外面的外部区域连接的任何荧光染料。用分析物(生物标志物)核酸(2)处理(1)-加帽的mp-sio2np导致打开发卡以形成双链体结构。双链体结构的3’-末端被exoiii水解“消化”，导致(1)的短缺及分析物(生物标志物)链(2)的释放。后面的分析物(生物标志物)链打开另外的发卡结构，并导致所得双链体通过消化3’-末端的随后切割。即，分析物(生物标志物)被发卡结构感应，并且它触发打开分析物的自主exoiii再生，并解锁孔，同时释放rhb。注意，分析物(生物标志物)链(2)不受exoiii影响，因为它包含单链3’-末端化核酸酯。图8(b)示出了使用不同浓度的分析物-生物标志物触发孔打开后，在60分钟的固定的时间间隔，并在1u/μlexoiii的存在下，释放的rhb的荧光强度。当分析物-生物标志物的浓度增加时，在60分钟的时间间隔内释放的染料的含量较高，与发卡通过(2)的初级打开的增加一致，该(2)触发靶生物标志物的再生和孔的exoiii刺激的打开。类似地，图8(c)示出了在(1)-加帽的mp-sio2np和固定浓度1μm的分析物-生物标志物(2)的存在下，在用不同浓度的exoiii处理60分钟的固定的时间间隔后，释放的rhb的荧光强度。显然，当exoiii的浓度增加时，释放的rhb的量较高，与发卡锁定的mp-sio2np通过靶生物标志物单元的自主exoiii再生的增加的打开一致。图8(d)示出了rhb从包括截留rhb的mp-sio2np的数个控制系统释放7的速率。即使在靶分析物-生物标志物的不存在下，截留的rhb从发卡加帽的孔浸出，曲线(a)。该rhb的渗漏与仅靶或exoiii的存在下(分别为曲线(b)和(c))非常类似。仅在分析物靶(1μm)和exoiii(1u/μl)的存在下进行rhb的快速释放，曲线(d)。60分钟后，释放的rhb达到饱和值。使用合适的校正曲线，估计rhb的释放量是ca.8.5μmol/gmp-sio2np。rhb从mp-sio2np的释放过程还对生物标志物-分析物的初级感应非常灵敏。图8(e)示出了分别在靶生物标志物链(3)、(4)和(5)中的一个、两个或单个碱基突变不打开发卡加帽单元，且不激活加帽单元的exoiii自主切割。使用(3)、(4)或(5)作为分析物-生物标志物，并在exoiii的存在下的rhb释放无效地进行，且与rhb从通道的背景渗漏非常类似，图8(d)，曲线(a)、(b)和(c)。
mp-sio2的发卡-核酸加帽的孔的另外的生物催化刺激打开，及截留的底物的释放描述于图9(a)中。mp-sio2np用核酸(6)通过将核酸的5’-末端共价地结合至使用磺基-emcs作为交联剂的胺-功能化的mp-sio2np来功能化。在90℃下，(6)作为单链的链而存在，而在25℃下，该链稳定成发卡结构。因此，mp-sio2np的孔在90℃下负载rhb，且该系统的冷却导致在孔中发卡锁定的rhb。发卡加帽的孔与分析物-生物标志物的相互作用导致双链体(6)/(7)的形成，其仍充当孔的结构阻塞物。然而，双链体结构(6)/(7)以这样的方式来定制，使得它包含用于双链体中的一个碱基的特定切口(以点标记)的编程的双链体序列。链(6)的切口导致不稳定双链体结构的分离，这产生废链(7)并再生用于发卡的再次开口的分析物-生物标志物并所得的双链体阻塞物的切口。注意，由(6)的折叠产生的发卡不包含用于被切口的合适的双链体结构域，并且这样的结构域仅在分析物-生物标志物与该发卡的单链感应环杂交后形成。因此，分析物-生物标志物与发夹加帽单元的杂交，触发打开孔门控单元的切口，并再生用于自主释放加帽单元的分析物-生物标志物，并随后释放截留的底物(rhb)。rhb的释放的速率通过打开锁定发卡加帽单元的分析物-生物标志物(7)的浓度来控制。图9(b)描绘了，在用不同浓度的分析物-生物标志物持续60分钟的固定的时间间隔和相应于0.5u/μl的恒定量的nb.bbvci切口酶处理(6)-加帽的mp-sio2np后，释放的rhb的荧光强度。当分析物-生物标志物的浓度增加时，释放的rhb的荧光加强，这与通过自主切口/分析物再生过程增强孔的打开的发卡-加帽单元的打开的较高程度一致。类似地，在分析物-生物标志物的固定浓度下，rhb从孔中的释放通过nb.bbvci切口酶的浓度来控制。图9(c)示出了，在不同量的切口酶的存在下，在用恒定浓度1μm的分析物-生物标志物处理(6)-加帽的负载rhb的mp-sio2np持续60分钟的固定的时间间隔后，释放的rhb的荧光强度。当酶的含量增加时，释放的rhb的量较高，与通过自主生物催化切割加帽单元和再生9分析物-生物标志物的增强的孔打开一致。在0.5u/μl的切口酶的存在下，系统的荧光强度达到饱和值，意味着在这些条件下，大多数的rhb从介孔基质中移出。对照实验，图9(d)，揭示当(6)加帽的孔不与切口酶或分析物-生物标志物互连时，观察到rhb的渗漏，曲线(a)，且单独的分析物-生物标志物或切口酶对rhb的释放的具有极少效应，分别是曲线(b)和(c)。图9(d)，曲线(d)示出了，在切口酶，0.5u/μl的存在下，在用分析物-生物标志物(7)，1μm处理包含截留的rhb的(6)发卡锁定的mp-sio2np后，溶液的时间依赖性荧光光谱。rhb从孔的有效释放仅当(6)-发卡锁定的孔与分析物-生物标志物和切口酶反应时才进行。在曲线(d)中观察到rhb的时间控制的释放，其在ca.60分钟后趋向于达到饱和值。从荧光光谱的饱和值，并使用合适的校正曲线，估计rhb的释放量是ca.12.4μmol/gmp-sio2np。(7)与发卡-(6)-修饰的mp-sio2np的杂交导致双链体结构被nb.bbvci切口和通过释放断裂的加帽单元解锁孔的进一步的支持通过片断化的产物之后的凝胶电泳实验来获得。另外，通过借助于分析物-生物标志物的发卡的耦合的打开和借助于精确切口识别位点(cctcagc/ggagt▲cg)的加帽单元的自助切口进行的(6)-修饰的孔的打开，揭示了明显的选择性，图9(e)。分别在分析物-生物标志物，序列(8)、(9)和(10)中的一个碱基、两个碱基或三个碱基错配，不打开发卡结构，并禁止通过切口酶自主生物催化除去加帽单元。因此，在突变体的存在下，rhb从孔的释放与染料从(6)-功能化孔的固有渗漏相似，图9(d)，分别是(a)、(b)和(c)。
在以上描述的系统中，核酸功能化孔的打开通过核酸分析物-生物标志物链来触发，其中由exoiii或切口酶刺激的生物催化反应提供了除去加帽元件，同时再生生物标志单元的工具。在本发明的另外的实施方案中，打开孔并释放截留的底物(rhb)通过适体-底物复合物和耦合的自主生物催化降解该适体-底物复合物而同时再生底物-生物标志物来实现。用于通过耦合的atp-适体复合物和exoiii生物催化过程从mp-sio2np孔控释rhb的一个构型示于图10(a)中。取代mp-sio2np的核酸(11)在90℃下以无规则卷曲存在，因此允许孔负载rhb。具有截留的rhb的孔被在25℃下是稳定的发卡结构加帽。将(11)发卡结构设计为包含适体序列(绿色)，并且这与单链序列(粉色)缀合，这确保exoiii可不水解影响发卡结构。在atp的存在下，发卡(11)打开，且打开的发卡的3’-末端被设计为与(11)的5’-结构域形成双链体结构。即，产生的atp-适体复合物通过该双链体结构域协同稳定。然而，所得的双链体提供了用于exoiii水解消化双链体的3’-末端的活性位点。该生物催化过程使atp-适体复合物不稳定，该atp-适体复合物释放atp用于产生适体-atp复合物的发卡结构的再次打开。因此，通过atp的发卡的打开触发启动耦合的exoiii刺激的atp再生，用于加帽单元的自主生物催化“消化”并释放截留的rhb。图10(b)示出了，在用不同浓度的atp持续90分钟的固定的时间间隔，并使用相应于1u/μl恒定浓度的exoiii处理mp-sio2np后，从孔释放的rhb的荧光光谱。类似地，图10(c)示出了，在用不同浓度的exoiii和恒定浓度(1mm)的atp处理np持续90分钟的固定的时间间隔后，从mp-sio2np释放的rhb的荧光光谱。rhb从多孔材料的释放通过增加atp的浓度或exoiii的浓度来增强，这与这两种成分控制孔的加帽单元的打开的事实一致。图10(d)示出了一组对照实验，进行这些实验以说明atp和exoiii对rhb从孔的控释的功能。在atp或exoiii的不存在下，观察到rhb从孔的渗漏，曲线(a)。在atp或exoiii的存在下，观察到rhb的相似渗漏率，分别是曲线(b)和(c)。rhb的增强的释放仅在1mmatp和1u/μlexoiii的存在下检测到，曲线(d)，与建议的机制一致，其中产生各自适体-底物复合物的(11)-功能化孔的打开与加帽单元的自主切割和atp分析物-生物标志物的再生耦合。使用校正曲线，估计rhb的释放量是ca.9.3μmol/gmp-sio2np。最后，(11)-功能化mp-sio2np的受控打开是atp选择性的，且其他核苷酸(utp、gtp、ctp)不影响孔的打开，图10(e)。
耦合的核酸/切口酶催化的孔打开，适体-底物复合物/切口酶方法被实施，以驱动用于rhb的控释的孔的自主打开，图11(a)。mp-sio2np用(12)来修饰，并在90℃下负载rhb。在系统冷却至25℃后，单链稳定在孔中加帽rhb的发卡结构。发卡的茎区域不包含待被nb.bbvci切口识别位点(cctcagc/ggagt▲cg)切口的序列特异性结构域。atp适体-复合物的形成将发卡结构重排为包含切口结构域的新的结构。atp适体-复合物的茎区域的断裂释放适体序列的主要片段，导致atp从断裂的序列中的释放。再生的atp生物标志物通过以下打开所有另外的发卡加帽单元，因此触发启动孔的自主打开，并释放rhb：通过atp循环耦合地打开发卡单元，形成atp-适体复合物，随后切口酶刺激适体序列断裂(ggagt▲cg)，以及再生atp生物标志物。图11(b)示出了，在不同浓度的atp的存在下，在(12)-加帽的负载rhb的mp-sio2np和恒定浓度0.5u/μl的切口酶处理90分钟的固定的时间间隔后，释放的rhb的荧光强度。当atp浓度增加时，释放的rhb的荧光强度加强。这些结果与以下事实一致：当atp的浓度越高时，通过atp浓度的孔的自主打开越高，atp-适体复合物的耦合形成和它由切口酶的断裂增强。图11(c)示出了，在用固定浓度1mm的atp，和不同浓度的nb.bbvci切口酶处理负载rhb的mp-sio2np，持续90分钟的固定的时间间隔后，释放的rhb的荧光强度。当切口酶的浓度增加时，rhb的释放较高，这与孔的增强的打开一致。图11(d)示出了，与对照系统比较，在通过耦合的atp/切口酶打开孔，释放rhb后，时间依赖性荧光变化13。而(12)-修饰的mp-sio2np显示了rhb的固有渗漏，曲线(a)，在仅atp或仅切口酶的存在下，渗漏过程仅轻微受到影响，分别为曲线(b)和(c)。仅1mmatp和0.5u/μlnb.bbvci切口酶的组合实质性增强rhb的释放，曲线(d)，与建议的机制一致。使用校正曲线，估计rhb的释放量是ca.14.1μmol/gmp-sio2np。图11(e)显示了使用各自atp-适体复合物和作为生物催化剂的切口酶，选择性atp-触发的rhb从(12)-功能化mp-sio2np的释放。在核苷酸ctp、utp和gtp的存在下，rhb的释放与在atp/切口酶不存在下观察到的rhb从mp-sio2np的固有渗漏极为相似，图11d，曲线(a)、(b)和(c)与(d)比较。
本实施方案通过证明以下事实被进一步延伸：抗癌药物喜树碱cpt的核酸触发的或atp-触发的释放可通过外切核酸酶iii或切口酶nb.bboci介导的孔的解锁来刺激。此外，描述了cpt在乳腺癌细胞中的有效细胞内释放，并比较了在乳腺癌细胞和正常乳腺细胞中解锁孔和释放cpt的效力以及这些细胞中细胞死亡的效应。图12(a)示出了，在exoiii的存在下，用不同浓度的靶dna(2)处理cpt-(1)-锁定的mp-sio2np持续60分钟的固定的时间间隔后，释放的cpt的荧光强度。当靶dna的浓度增加时，荧光增强，意味着更多的cpt从孔释放。图12(b)描绘了在从(1)-锁定的mp-sio2np释放cpt后，时间依赖性荧光变化。各自的对照实验示于图12(b)中，曲线(a)–(c)。显然，仅在用(2)和exoiii降解锁定位点解锁孔后，观察到cpt的有效释放，曲线(d)。在使用靶dna(7)和切口酶nb.bbvci作为打开机制从(6)-锁定的mp-sio2-np释放cpt后，观察到了相似结果，图12(c)和(d)。类似地，研究了在exoiii或切口酶的存在下atp刺激的打开和ctp从孔的释放。图13(a)示出了在用不同浓度的atp和exoiii处理包含孔内截留的cpt的(11)-加帽的mp-sio2np，持续90分钟的固定的时间间隔后，观察到的荧光光谱。当atp的浓度增加时，释放的cpt量较高，这与cpt从孔的增强的释放一致。使用合适的校正曲线，估计在90分钟的时间间隔后，释放了ca.10.8μmol/gmp-sio2np的cpt。图13(b)描绘了了在从(11)-加帽的mp-sio2np释放cpt后，时间依赖性荧光变化。类似地，图13(c)和(d)示出了，通过形成各自的atp-适体加帽单元并通过切口酶降解atp-适体复合物而利用atp作为“锁-钥”的调节剂，cpt从mp-sio2np的(12)-锁定的孔的释放。当atp的浓度增加时，cpt的释放增强，这与适体-atp复合物的含量的增加以及它们通过切口酶nb.bbvci的消化一致。在各自对照实验中，图13(d)，曲线(a)–(c)，以及在切口酶的存在下，图13(d)，曲线(d)，cpt从孔的释放的速率表明，在(12)-锁定的孔中截留的cpt仅在生物标志物和切口酶的存在下有效释放。从各自的校正曲线，估计在90分钟的时间间隔后，从孔释放了ca.13.4μmol/gmp-sio2np的cpt。
通过用dna或atp生物标志物将“锁-钥”转化为被生物催化过程(exoiii或nb.bbvci)解锁的新的功能单元而解锁mp-sio2np的孔并从mp-sio2np的孔释放cpt的概念被设计为控制药物递送和调控细胞死亡的通常方法。具体地，癌细胞中的高代谢导致高含量的atp，并因此它可提供用于癌细胞中的孔的选择性打开的化学触发物。然后，预期与正常细胞比较，化疗药物cpt在癌细胞中的增强的释放诱导癌细胞的最大死亡。
检查了cpt从(11)-锁定的mp-sio2np的可能的atp-触发的释放，以及释放的cpt具有对各自细胞的死亡的效应。在第一步中，检查了mp-sio2np对细胞的可能的细胞毒性。dna-锁定的np的外表面用异硫氰酸荧光素(ftic)功能化，并使mda-mb-231(乳腺癌细胞)、mcf-10a(正常乳腺细胞)细胞经历荧光素标记的np。观察到进入细胞的快速内吞作用，但未检测到细胞毒性效应。在接下来的步骤中，我们利用这样的事实：endogi存在于癌细胞中并且它显示exoiii-型外切酶活性。mp-sio2np负载cpt并用atp-敏感性发卡(11)将该药物锁定在孔中。使mda-mb-231乳腺癌细胞和mcf-10a正常乳腺细胞经历负载cpt的mp-sio2np。图14示出了mda-mb-231细胞的荧光特性，以及在用mp-sio2np处理48小时后两种类型细胞的存活力。图14(a)示出了用负载cpt的np处理的mda-mb-231细胞的时间依赖性荧光特性。24小时后细胞已显示了相应于与np缔合的荧光素标记物的绿色荧光，且甚至在48小时后该荧光占优势。这意味着np掺入进细胞。在24小时后，未观察到相应于解锁的cpt的蓝色荧光，在30小时后显示弱荧光，且在48小时的时间间隔后该荧光加强，意味着在该时间间隔后cpt释放进细胞。图14(b)图i和ii概述了负载cpt的np对细胞的存活力的效应(图i–mda-mb-231乳腺癌细胞，图ii–mcf-10a正常乳腺细胞)。提供适当的对照系统。从该结果，人们可发现，与cpt-未处理的对照比较(条目(a)对(b))，在48小时后，ca.65％癌细胞显示了细胞死亡，然而在该时间间隔(48小时)仅25％的非癌细胞经历了细胞死亡。在另外的对照实验中，在用负载cpt的mp-sio2np处理后，使两种细胞培养物经历寡霉素。寡霉素充当atp43的atp酶合成的抑制物，并因此，在寡霉素的存在下，癌细胞中cpt的atp刺激的释放应该被抑制。事实上，图14(b)，图i(比较条目(b)至(d))显示，与在atp合成抑制物的不存在下65％的细胞死亡比较，在寡霉素的存在下，观察到仅50％细胞死亡。这些结果与以下事实一致：atp在癌细胞中的高代谢合成导致mp-sio2np的增强的打开以及影响细胞死亡的cpt的有效释放。
实施例i-用于底物的dna核酶诱导的多重释放的sio2纳米颗粒
材料
原硅酸四乙酯(teos)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)和2,6-吡啶二羧酸(pdca)购自aldrich。n-(ε-马来酰亚胺己酸)硫代琥珀酰亚胺酯(硫代-emcs)购自piercebiotechnologies。溴化十六烷基三甲铵(ctab)、亚甲蓝(mb+)、硫堇(th+)、盐酸多柔比星、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸钠盐(hepes)、氯化镁(ii)、乙酸锌(ii)二水合物、乙酸铅(ii)三水合物、乙酸钙(ii)水合物，氯化锶(ii)六水合物、碳酸钡(ii)、氯化铜(ii)、乙酸钴(ii)四水合物、碳酸锰(ii)、乙酸镍(ii)四水合物、硫酸亚铁(ii)七水合物和乙酸汞(ii)均购自sigma。贯穿实验，使用来自nanopurediamond(barnsteadint.,dubuque,ia)的超纯水。所有dna寡核苷酸序列购自integrateddnatechnologies有限公司(coralville,ia)。在用hepes缓冲(20mm,ph7.0)溶液稀释硫醇标记的rna序列(1)后，用0.1m二硫苏糖醇(dtt)将其还原，并储存于-20℃下，然后在使用前用illustratmmicrospintmg-25柱(gehealthcare)纯化。
使用以下核酸：
(1)5’-sh(ch2)6caacaacatraggacatagaagaagaag-3’(seq.no.1)
(4)5’-cttcttcttctatgtcagcgatccggaacggcacccatgttgttgtt-g-3’(seq.no.2)
(5)5’-cttcttcttctatgtctccgagccggtcgaaatgttgttg-3’(seq.no.3)
(6)5’-cttcttcttctatgtcagcgatcctgggggagtattgcggaggaag-gcacccatgttgttgttg-3’(seq.no.4)
(7)5’-cttcttcttctatgtcagcgatcttttcggaaacgtttagcacccat-gttgttgttg-3’(seq.no.5)
(8)5’-cttcttcttctatgtctcatgggggagtattgcggaggaaggtcgaaatgttgttg-3’(seq.no.6)
使用仪器
使用caryeclipse设备(varianinc.)进行荧光测量。mb+、th+和多柔比星染料的激发波长分别为663nm、600nm和494nm。使用shimadzuuv-2401分光光度计记录uv-vis吸收光谱。sem图像使用magellan400l扫描电子显微镜来拍摄。
介孔二氧化硅纳米颗粒的合成
根据chen，c.；pu，f.；huang，z.；ren，j.；qu，x.nucleicacidres.2011，39，1638.制备氨基功能化的介孔sio2np。所得的np被沉淀，用蒸馏水和甲醇洗涤，并在空气中干燥。为了除去n-十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，将sio2np在包含hcl(37％，1ml)和甲醇(80ml)的溶液中回流16h，并然后用蒸馏水和甲醇彻底洗涤。所得的无ctab的氨基功能化的介孔sio2np存储于真空中以从孔中除去剩余的溶剂。
染料的负载
单分散sio2np如下制备：将10mg二氧化硅np沉浸于950μl的hepes缓冲液(20mm，ph7.0)中，并超声处理30min。溶液与50μl的硫代-emcs(10mg/ml)反应，并将所得的混合物震摇30min。为了除去过量的emcs，使用10000rpm离心3min沉淀介孔sio2np，并将其再溶解于950μl的hepes缓冲液中(20mm，ph7.0)。纯化的sio2np与50μl的硫醇化寡核苷酸((1)，1mm)反应，且将所得的溶液震摇2小时。修饰后，通过如前所述的二氧化硅np沉淀除去过量的dna。通过uv-vis光谱完成的剩下的rna定量为38nmol，其相应于1.2μmol/gsio2np。然后，将纯化的颗粒溶解于900μl包含500mmnacl的hepes缓冲液(20mm,ph7.0)，向其加入100μl染料(1mmmb+、th+或多柔比星)，且将所得的溶液震摇过夜。负载染料后，溶液与50μl互补dna(分别1mm的dna(4)、(5)、(6)、(7)或(8))温育，且将所得的混合物震摇2h。通过该过程获得的dna加帽的介孔sio2np使用包含500mmnacl的hepes缓冲液(20mm,ph7.0)洗涤八次直到实现低背景，以从sio2颗粒的表面除去任何物理吸附的染料。洗涤步骤在过程中通过染料的吸收光谱进行监测。mb+或th+在mg2+或zn2+依赖性dna核酶修饰的sio2np中的负载量概略地计算分别为6.3μmol/g或7.5μmol/gsio2np。
染料的释放
为了监测在mg2+或zn2+离子的存在下染料从介孔sio2np中的释放过程，将颗粒悬浮于1ml包含500mmnacl的hepes缓冲液(20mm,ph7.0)中，并分为五个190μl等份。以不同浓度将不同的离子加入这些样品，并对于mg2+或zn2+分别震摇1小时或40分钟。沉淀后记录样品的荧光光谱。为了测试染料在atp-或hg2+刺激的dna核酶依赖性sio2np中的释放过程，将介孔sio2np溶解于1ml包含500mmnacl和20mmmg2+或10mmzn2+的hepes缓冲液(20mm,ph7.0)中，将其分为五个190μl样品。然后sio2np与10μl的atp(2mm)或hg2+离子(20μm)反应。所得的溶液对于atp或hg2+离子分别震摇90分钟或1小时。这随后是在沉淀sio2np后，测量样品的荧光光谱。
实施例ii-使用dna或分子标志物作为触发刺激底物从核酸加帽的介孔sio2的扩大的生物催化释放
材料
原硅酸四乙酯(teos)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)和罗丹明b(rhb)购自aldrich。n-(ε-马来酰亚胺己酸)硫代琥珀酰亚胺酯(硫代-emcs)购自piercebiotechnologies。十六烷基三甲基溴化铵(ctab)和4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸钠盐(hepes)购自sigma。外切核酸酶iii(exoiii)、ne缓冲液1、切口酶nb.bbvci和ne缓冲液2购自newenglandbiolabs。喜树碱(cpt)、寡霉素、腺苷5′-三磷酸(atp)、尿苷5′-三磷酸(utp)、胞苷5′-三磷酸(ctp)和鸟苷5′-三磷酸(gtp)购自sigma-aldrich。所用的所有其他化学品均为分析纯，并按收货那样时使用而没有任何进一步纯化。贯穿实验，使用来自nanopurediamond(barnsteadint.，dubuque，ia)的超纯水。所有dna寡核苷酸序列购自integrateddnatechnologiesinc.(coralville，ia)。寡核苷酸按所提供的使用，并在水性溶液中稀释。
nb.bbvci切口酶的识别位点如下。
5’...cctcagc...3’
3’...ggagt▲cg...3’
寡聚物的序列如下：
(1)5’-sh(ch2)6caagggcagaagtcttcactgcccttgcacact-3’tm＝67.3℃(seq.no.7)
(2)5’-agtgtgcaagggcagtgaagacttgattgt-3’(seq.no.8)
(3)5’-agtgtgcaagagcagtgaagacttgattgt-3’(seq.no.9)
(4)5’-agtgtgctagagcagtgaagacttgattgt-3’(seq.no.10)
(5)5’-agtgtgctagagcagttaagacttgattgt-3’(seq.no.11)
(6)5’-sh(ch2)6aacgaagctgaggatgtgttcgtt-3’tm＝58.9℃(seq.no.12)
(7)5’-atcctcagcttcg-3’(seq.no.13)
(8)5’-atcctgagcttcg-3’(seq.no.14)
(9)5’-atcatgagcttcg-3’(seq.no.15)
(10)5’-atcatgagcgtcg-3’(seq.no.16)
(11)5’-sh(ch2)6cctccgctacctgggggagtattgcggaggaaggta-3’tm＝69.8℃(seq.no.17)
(12)5’-sh(ch2)6cctccgcaatactccgctgaggcctgggggagtattgcg
gaggaaggcctcagc-3’tm＝74.9℃(seq.no.18)
仪器
使用caryeclipse设备(varianinc.)进行荧光测量。在554nm的波长下激发罗丹明b(rhb)。用shimadzuuv-2401分光光度计记录uv-vis吸收光谱。tem图像使用200kv的加速电压在tecnaif20g2(feico.)上记录。使用nova1200ebet仪表(quantachromeinstruments,usa)通过在液氮的温度下的氮气吸附/解吸确定表面面积。
介孔二氧化硅纳米颗粒(mp-sio2np)的合成
根据先前报道的过程制备氨基功能化mp-sio2np。30收集的sio2np用大体积的蒸馏水和乙醇以8000rpm离心3min进行洗涤。为了除去n-将十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，sio2np在包含hcl(37％,1.00ml)和乙醇(80.00ml)的溶液中回流16h。获得的np用蒸馏水和乙醇彻底洗涤。最后，为了从孔除去剩余的溶剂，将所得的无ctab的氨基-功能化mp-sio2np在75℃下在真空中放置12h。
染料的负载和孔的加帽
为了制备单分散的mp-sio2np溶液，将10mg的二氧化硅np放置进950μl的hepes缓冲液(20mm,ph7.0)中并超声处理30min。溶液与50μl的硫代-emcs(10mg/ml)反应，并将混合物混合30min。为了除去过量的emcs，使用以8000rpm离心3min收集mp-sio2np，并将其再溶解于950μl的hepes缓冲液(20mm，ph7.0)中。纯化的sio2np与新鲜还原并纯化的硫醇化寡核苷酸(1)、(6)、(11)、(12)(80μl,1mm)反应，且将所得的溶液混合2h，将过量的dna通过沉淀从np溶液中除去。剩下的过量的dna的定量通过uv-vis光谱在dna/exoiii或dna/切口酶系统中完成为61nmol或8nmol，其相应于dna的量分别固定为1.9μmol/g或2.2μmol/gsio2np。
使用水浴(90℃)对孔负载染料，以为了打开连接的dna的发卡结构。将纯化的mp-sio2np溶解于900μl的hepes缓冲液(20mm，ph7.0，包含50mmnacl)中，将100μl的rhb或cpt(10mm)加入进该溶液，且在连续搅拌下使用水浴分别将反应混合物加热至90℃或75℃持续2h。然后，在退火过程中在连续搅拌下将样品分别在75℃、50℃和25℃下浸渍在水浴中持续20min。最后，使用蒸馏水洗涤mp-sio2np至少七次，直到实现低背景，以从sio2颗粒的表面除去物理吸附的染料。rhb在dna/exoiii或dna/切口酶系统中的负载量概略地计算分别为37.8μmol/g或31.3μmol/gsio2np。cpt在dna/exoiii或dna/切口酶系统中的负载量计算分别为34.5μmol/g或28.6μmol/gsio2np。
染料的释放
为了监测染料在两种不同系统dna/exoiii或dna/切口酶中的释放，将以上提及的mp-sio2np悬浮于850μl蒸馏水中，并分为五个样品，各自包含160μl溶液。然后，将20μl缓冲液1和10μl不同浓度的exoiii，或20μl缓冲液2和10μl不同浓度的切口酶分别加入进所得的溶液，并轻轻震摇。最后，将10μl不同浓度的dna加入进该混合物并震摇1h，且然后在沉淀后测量样品的发射的荧光光谱。
为了测试染料在atp刺激的exoiii或切口酶系统中的释放，将洗涤的mp-sio2np溶解于850μl蒸馏水中，并分为五个样品，各160μl。sio2np分别与20μl缓冲液1和10μl不同浓度的exoiii，或20μl缓冲液2和10μl不同浓度的切口酶孵育。然后，加入10μl不同浓度的atp，将获得的溶液震摇90min，并然后在沉淀后测量荧光光谱。
cpt对mda-mb-231(乳腺癌细胞)和mcf-10a(正常乳腺细胞)细胞的死亡的效应
mda-mb-231(乳腺癌细胞)、mcf-10a(正常乳腺细胞)细胞以每孔27000个细胞密度种植在24孔组织培养板。过夜后，先将细胞与寡霉素(25μg/ml)预孵育1h，然后负载mp-sio2(150μg/ml)两次(每次负载持续3h)。在负载细胞之间用新鲜生长培养基洗涤并然后重新负载。将细胞进一步培养过夜。为确定细胞存活力，将10μl阿尔玛蓝溶解加入至板的每个孔，并将细胞在co2保温箱中再孵育1h。在板阅读器(tecan)中检查阿尔玛蓝的荧光。细胞被培养在玻璃底显微镜皿中，并通过由共聚焦(质量当量)opti-grid设备(配备恒温阶段和hamamatsuorca-eraccd照相机的nikonte2000显微镜)辅助，并通过用于图像数据采集和分析的volocity4操作系统(improvision,coventry,uk)驱动的epi-荧光显微镜来分析。np的摄取和cpt从颗粒的释放用fitc-标记的(ex:519nm)和负载cpt(ex:423nm)的np通过显微镜来测量。
序列表
<110>耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司
<120>识别释放包含活性剂的纳米多孔基材、其制备方法和用途
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