本发明属于细胞基因工程领域，尤其涉及一种人蛋白基因fkbp52过表达载体及其制备方法和应用。
背景技术：
：子宫内膜异位症(endometriosis，em)是子宫内膜生长在子宫之外，会导致炎症创伤、疼痛和生育率降低，并伴随体内性激素水平的变化而出现周期性出血以及一系列临床症状的疾病。em多出现于育龄期女性中，发病率高达10％，因较高的发病率和导致慢性盆腔疼痛与不育的风险，严重影响了育龄女性的身心健康。孕酮(黄体酮，p4)与其核孕酮受体(pr)所介导的通路称为p4/pr信号通路。p4/pr信号通路的正常维持对于胚胎着床和维持怀孕至关重要。孕酮通过其核孕酮受体(pr)来启动一系列参与到排卵、子宫内膜容受性、着床、子宫内膜蜕化和怀孕维持的基因转录中去，是保证育龄女性正常怀孕及生产的关键基因信号通路。fkbp52蛋白又称fkbp4，是一种免疫亲合蛋白分子伴侣，它能够与成熟的pr形成复合体，通过促进p4/pr信号通路的激活参与到怀孕相关的基因调节。研究发现，fkbp52缺失会增加怀孕期间子宫p4耐受性，表现为患者虽然有正常的p4和pr表达水平，但pr活性明显降低。因此，fkbp52的正常表达是p4/pr通路激活和怀孕各阶健康进行的重要基因保证。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种人蛋白基因fkbp52过表达载体及其制备方法和应用，为子宫内膜异位症的相关研究提供巨大便利。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：人蛋白基因fkbp52过表达载体，在pcdna3.1载体的kpni和xbai酶切位点之间构建有人源fkbp52cds区(编码区)序列。人源fkbp52cds区来自fkbp52基因，其具有序列表seq.id.no.1的碱基序列，其编码的蛋白具有序列表seq.id.no.2的氨基酸序列。上述蛋白基因fkbp52过表达载体的制备方法，将人fkbp52蛋白的胞内段碱基序列克隆到pcdna3.1载体的kpni和xbai酶切位点之间，kpni酶切位点位于碱基序列的上游，xbai酶切位点位于碱基序列的下游，从而构建成为可以完成细胞瞬转过表达的fkbp52-pcdna3.1过表达载体。人fkbp52蛋白片段属于fkbp52基因来自于人子宫内膜组织，其具有序列表seq.id.no.1的碱基序列。上述蛋白基因fkbp52过表达载体的制备方法，按以下步骤操作进行：<1>根据ncbi上fkbp52基因的碱基序列(基因登录号：nm_002014.3的199-1578)，以人子宫内膜组织总rna反转录为cdna为模板，克隆人源fkbp52cds区序列；<2>将人源fkbp52cds区序列片段插入到pcdna3.1载体的kpni和xbai酶切位点之间。克隆所用引物为：fkbp52-kpni-f：5’-ggggtaccatgacagccgaggagatgaag-3’(序列表seq.id.no.3)，fkbp52-xbai-r：5’-gctctagactatgcttctgtctccacctg-3’(序列表seq.id.no.4)。其pcr产物长度为1396bps(包括酶切位点与保护碱基)。克隆的反应体系和条件以及反应程序分别为：反应体系和条件为：反应程序为：上述蛋白基因fkbp52过表达载体在细胞系过表达fkbp52mrna或蛋白方面的应用。针对目前子宫内膜异位症相关研究存在问题，发明人设计并构建了一种人蛋白基因fkbp52过表达载体，在pcdna3.1载体的kpni和xbai酶切位点之间构建有人源fkbp52cds区序列。据此，还建立了相应构建方法，即将人fkbp52蛋白的胞内段碱基序列克隆到pcdna3.1载体的kpni和xbai酶切位点之间，kpni酶切位点位于碱基序列的上游，xbai酶切位点位于碱基序列的下游，从而构建成为可以直接用于细胞转染的fkbp52-pcdna3.1过表达载体。实验结果显示，使用该测序验证后的过表达质粒转染的细胞经qpcr检测和蛋白质免疫印迹检测，均可在细胞中特异性高表达fkbp52的mrna及蛋白，测定结果清晰准确，价格低廉，大幅缩减实验成本。因此，本发明构建的fkbp52过表达载体，可以在人子宫内膜正、异位细胞实现fkbp52基因的mrna与蛋白过表达，同时也可作为亚克隆模板，参与到慢病毒包装等研究中。可见，本发明有效解决了人源fkbp52蛋白在细胞系中高表达的问题，为fkbp52基因通路的研究提供了实验基础。与现有技术相比，本发明的突出优势在于：(1)本发明的过表达载体可直接用于常规过表达载体亚克隆，并用于细胞系转化，获得瞬时转染的高表达fkbp52细胞株。(2)本发明的过表达载体经转染之后效果经qpcr、蛋白质免疫印迹证实准确可靠。附图说明图1是pcr克隆琼脂糖电泳图，图中：m是marker。图2是单克隆菌落pcr电泳图，图中：m是marker，1-4分别是4个单克隆电泳结果，所有单克隆均获得了目的条带。图3是qpcr检测过表达柱状图，横坐标分别为blank空载组、空载fkbp52组、过表达fkbp52组，纵坐标是相对表达量。图4是wb结果图，由左到右分别是过表达、空载和空白组。图5是wb结果灰度图，由左到右分别是过表达、空载和空白组。具体实施方式实施例1fkbp52过表达质粒用于细胞系转染过表达mrna一、基因克隆(一)人子宫内膜组织totalrna的提取(1)样本的前期处理：取约10mg组织，液氮研磨后加入洁净ep管中，加1mltrizol，混匀，静置15分钟，使其充分裂解；(2)分相：加入200μl体积的氯仿(为trnzol总体积的1/5)，充分颠倒混匀，室温下静置3分钟，12000rpm4℃离心15分钟，溶液分层，小心吸取含rna的上清移到一新的离心管中。(3)rna沉淀：向吸取的上清中加入1μlrna共沉淀剂，混匀，再加入异丙醇400μl，颠倒数次混匀，室温静置10min，12000rpm4℃离心10分钟，在管底可见rna沉淀，弃上清。(4)rna清洗：在离心管中加入1ml75％乙醇(depc水新鲜配制)，颠倒混匀，12000rpm4℃离心5分钟，小心地弃上清。(5)rna溶解：敞开离心管口，室温干燥5～10分钟使残留液体挥发，待rna略干后，加30μldepc水溶解沉淀，取少量检测，其余可保存于-80℃或液氮中。(二)去dna表1去dna体系及条件(三)逆转录(thermo试剂盒逆转录)表2逆转录体系及条件1接着加入以下试剂：表3逆转录加入试剂三、pcr1、以人子宫内膜组织提取的totalrna逆转录的cdna为模板，反应体系及条件如下：表4pcr反应体系及条件表5pcr反应程序pcr反应完取2μlpcr产物进行2％琼脂糖电泳分析，结果如图1，可见扩增出片段大小与理论大小相符。四、产物的纯化回收按照凝胶纯化试剂盒(axygen，货号：ap-gx-250)说明书进行产物纯化。(1)事先称量一只2.0ml的空ep管重量并记录于管壁；(2)在紫外灯下切下含有目的dna的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μl体积)。(3)加入3个凝胶体积的bufferde-a，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。(4)加0.5个bufferde-a体积的bufferde-b，混合均匀。(5)吸取步骤3中的混合液，转移到dna制备管(置于2ml离心管)中，12,000×g离心1min，弃滤液。(6)将制备管置回2ml离心管，加500μlbufferw1，12,000×g离心30s，弃滤液。(7)将制备管置回2ml离心管，加700μlbufferw2，12,000×g离心30s，弃滤液；以同样的方法，再用700μlbufferw2洗涤一次12,000×g离心1min。(8)将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。(9)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加30μleluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱dna。(10)取少量检测浓度，其余可保存于-20℃中。五、酶切表6酶切体系及条件六、酶切回收纯化酶切后回收纯化酶切产物，按照纯化试剂盒(axygen，货号：ap-gx-250)说明书进行纯化产物。(1)pcdna3.1(+)(质粒)酶切产物跑完琼脂糖凝胶电泳后按以下步骤操作：1)事先称量一只2.0ml的空ep管重量并记录于管壁；2)在紫外灯下切下含有目的dna的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μl体积)。3)加入3个凝胶体积的bufferde-a，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。4)加0.5个bufferde-a体积的bufferde-b，混合均匀。(2)fkbp52酶切产物则按以下步骤操作：1)事先准备一只1.5ml的空ep管2)短暂离心pcr产物，测量pcr产物或酶促反应液的体积，并转移至准备好的ep管中。3)加入3倍体积的bufferde-a，涡旋混匀。4)加0.5倍bufferde-a体积的bufferde-b，混合均匀。之后步骤相同：5)吸取步骤3)中的混合液，转移到dna制备管(置于2ml离心管)中，12,000×g离心1min，弃滤液。6)将制备管置回2ml离心管，加500μlbufferw1，12,000×g离心30s，弃滤液。7)将制备管置回2ml离心管，加700μlbufferw2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μlbufferw2洗涤一次12,000×g离心1min。8)将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。9)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加30μleluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱dna。10)取少量检测浓度，其余可保存于-20℃中。七、连接连接反应体系如下：表7连接体系及条件八、转化(1)取连接产物加到50μldh5α感受态细胞中，混匀，冰浴30分钟。(2)将上述转化液置于42℃水浴90秒，取出后立即置于冰浴中放置2-3分钟。(3)向其中加入800μl37℃预热的lb(不含抗生素)培养基，200rpm、37℃振荡培养1小时。(4)2500rpm离心5min，将上清液吸走，留100μl混匀菌液，加到含amp抗生素lb固体琼脂培养基上(抗生素浓度100μg/ml)，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。九、菌落pcr鉴定随机挑取上述平板上的若干单菌落，于加有400μlamp液体培养基1.5mlep中，标好编号(共挑取4个单菌落)，200rpm、37℃振荡培养4小时。依据编号另取相等灭菌数量pcr管，反应体系及条件如下：表8pcr鉴定反应体系及条件反应程序为：表9pcr鉴定反应程序pcr反应完取2μlpcr产物进行1％琼脂糖电泳分析，结果如图2所示。由电泳图可知条带大小相符。取1、2、3、4号进行测序鉴定。将阳性的克隆送测序公司测序进一步鉴定确认得到fkbp52过表达载体。二、qpcr检测(一)细胞提取rna1、细胞来源实验室培养的3组细胞：空白组(记为blank)、转染fkbp52-空载质粒组(记为空载-fkbp52)、转染fkbp52过表达质粒组(记为过表达-fkbp52)(已用2mltrizol进行裂解)。2、提取步骤(trizol法)(1)从-80℃冰箱中拿出细胞，解冻15min，摇匀，吸取1ml进行实验。(2)加入200μl氯仿，大力摇15s，静置5min。(3)4℃12000g离心15min。(4)小心吸取上层水相(大概400μl)，加入等量异丙醇，轻轻混匀，静置10min。(5)4℃12000g离心10min，弃上清。(6)加入1ml75％乙醇，使沉淀悬浮，4℃12000g离心10min，弃上清。(7)干燥沉淀(大概5min)，加入20μldepch2o。3、检测rna浓度表10rna浓度(二)去dna处理取2μgrna进行后续实验实验体系：表11去dna体系及条件(三)逆转录1、去dna处理完成后，重新测定浓度表12重新测定浓度2、逆转录取1μgrna进行逆转录(采用thermo试剂盒)(1)在冰上将下列体系配制好表13逆转录体系templaterna1μgoligo(dt)primer0.5μlwater，nuclease-freeto6μltotalvolume6ul(2)混匀，离心后，65℃孵育5min，立即放冰上5min。(3)加入下列试剂表14逆转录加入试剂5xreactionbuffer2ul10mmdntpmix1μlribolockrnaseinhibitior(20u/μl)0.5μlrevertaidm-mulvrt(200u/μl)0.5μltotalvolume10ul(4)混匀，离心后，42℃60min，70℃5min。(三)qpcr检测1、模板制备取逆转录好的cdna稀释10倍后作为模板进行后续的实验。2、qpcr检测(采用英赞2xsybrgreenqpcrpromix)反应体系如下：表15qpcr检测反应体系程序如下：表16qpcr检测反应程序(四)检测结果realtimepcr检测结果如图3，由柱状图可知，转染了过表达载体的细胞中能够检测到较空白与空载组更高的fkbp52mrna表达，证明过表达载体能够在细胞内实现fkbp52mrna的过表达。实施例2fkbp52克隆质粒用于细胞系转染过表达蛋白一、细胞蛋白提取(一)细胞来源以人源fkbp52过表达载体对细胞进行转染，细胞转染分为3组：空白组，过表达空载组，过表达组。(二)细胞样品蛋白制备在细胞样品中加入适量裂解液ripa(含蛋白抑制剂)冰上裂解30min，再经过超声波细胞粉碎机超声破碎，4℃，13000rpm离心30min。离心完成后移取上清至洁净离心管中，立即使用或者-80℃保存。(三)总蛋白浓度检测蛋白样品提取完成后将上清做倍数稀释后以bca蛋白定量法测定蛋白吸光值(od)值，再通过标准曲线计算蛋白样品的浓度。(1)12％分离胶和5％浓缩胶的配置(ml)表1712％分离胶和5％浓缩胶的配制(2)制胶：将玻璃板刷洗干净，用双蒸水冲净，晾干。在制胶架上安装玻璃板，按上表配方配制分离胶，注入两块玻璃板中间，并在液面上加入适量超纯水压平胶面，静置30min。待胶凝固后，倒掉上层水并用滤纸将水分吸干。然后按配方配制浓缩胶注入玻璃板中，小心插入梳子，静置30min待胶凝固后将胶板夹紧到电泳槽上，小心拔出梳子，用滴头冲洗泳道中的碎胶。(3)蛋白变性：将待测蛋白以一定倍数稀释后再和loadingbuffer以3∶1的体积比混合，沸水浴10min，然后取出样品管置于冰上降温。(4)上样(5)电泳：在电泳槽内加入电泳缓冲液，接通电源，80v恒压电泳至溴酚蓝跑出浓缩胶层，时间大约为30min。分离胶电泳为120v，当溴酚蓝迁移至距离分离胶下缘约1cm时，关掉电源，停止电泳。(四)转膜(1)预先配置1l1×转移电泳缓冲液预冷至4℃。(2)先将pvdf膜在甲醇中浸泡30s，再将其转移至转膜缓冲液浸泡15min，然后把滤纸、凝胶一起放到转膜缓冲液中浸泡15min。(3)按夹心法依次将(转膜夹黑色面)海绵、滤纸、滤纸、凝胶、pvdf膜、滤纸、滤纸、海绵(白色面)按顺序放好，小心赶除所有的气泡，将转膜夹放入转印槽中，倒入适量转膜缓冲液，400ma稳流电转移1h(转膜条件依据不同蛋白进行优化)。(五)封闭pvdf膜，去离子水洗涤。将pvdf膜浸入5％脱脂牛奶的封闭液中，室温封闭1h。(六)孵育抗体取出已封闭的pvdf膜，置于1×tbs-t缓冲液中，于摇床上缓慢洗涤3×5min。然后移入第一抗体中，室温摇床孵育或者4℃孵育过夜。一抗孵育完成后将一抗回收，将pvdf膜置于1×tbs-t缓冲液中，于摇床上缓慢洗涤3×5min。然后分别对应移入有hrp标记的第二抗体中，室温摇床孵育1h。内参孵育：取出已封闭的pvdf膜，浸于1×tbs-t缓冲液中，于摇床上缓慢洗涤3×5min。然后移入内参抗体中，室温摇床孵育或者4℃孵育过夜。(七)洗膜将pvdf膜浸于1×tbs-t缓冲液中，于摇床上缓慢浸洗3×10min。(八)ecl化学发光显影将pvdf膜至于保鲜膜上，取适量等体积的a液和b液混合，混匀后加在膜的表面，移至凝胶成像分析仪中，曝光显影，如图4，如图可知，过表达组wb条带浓度高于空白组与空载组，表明载体能够实现fkbp52的蛋白过表达。灰度值分析用imagej软件对目的条带进行灰度值(面积)计算，结果如图5，如图可知，过表达组wb条带灰度值高于空白组与空载组，表明载体能够实现fkbp52的蛋白过表达。序列表<110>广西医科大学第一附属医院南宁维尔凯生物科技有限公司<120>人蛋白基因fkbp52过表达载体及其制备方法和应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1980<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atggtggcccggcgcaagcgcgagcacagcaccctctggttccctgagggcttctcactg60cacaaggacgtggcctctggtcacaagggccggcgggaacccgtgggccaggacgcgctg120ggcatgaagaacatggccaagggtgagagcctgatgggggaggtggccacagactggatg180gacacagagtgcccagaggccaagcggctaaaggtagaggagccaggcatgggggctgag240gaggctgtggattgccgtcagtggactcaacaccatctggttgctgctgacatccgcgtg300gcaccagccatggcactgacaccaccacagggcgacgcagatgctgatggcatggatgtc360aatgtgcgtggcccagatggcttcaccccgctaatgctggcttccttctgtgggggggct420ctggagccaatgccaactgaagaggatgaggcagatgacacatcagctagcatcatctcc480gacctgatctgccagggggctcagcttggggcacggactgaccgtactggcgagactgcc540ttgcacctggctgcccgttatgcccgtgctgatgcagccaagcggctgctggatgctggg600gcagacaccaatgcccaggaccactcaggccgcactcccctgcacacagctgtcacagcc660gatgcccagggtgtcttccagattctcatccgaaaccgctctacagacttggatgcccgc720atggcagatggctcaacggcactgatcctggcggcccgcctggcagtagagggcatggtg780gaagagctcatcgccagccatgctgatgtcaatgctgtggatgagcttgggaaatcagcc840ttacactgggctgcggctgtgaacaacgtggaagccactttggccctgctcaaaaatgga900gccaataaggacatgcaggatagcaaggaggagacccccctattcctggccgcccgcgag960ggcagctatgaggctgccaagctgctgttggaccactttgccaaccgtgagatcaccgac1020cacctggacaggctgccgcgggacgtagcccaggagagactgcaccaggacatcgtgcgc1080ttgctggatcaacccagtgggccccgcagcccccccggtccccacggcctggggcctctg1140ctctgtcctccaggggccttcctccctggcctcaaagcggcacagtcggggtccaagaag1200agcaggaggccccccgggaaggcggggctggggccgcaggggccccgggggcggggcaag1260aagctgacgctggcctgcccgggccccctggctgacagctcggtcacgctgtcgcccgtg1320gactcgctggactccccgcggcctttcggtgggccccctgcttcccctggtggcttcccc1380cttgaggggccctatgcagctgccactgccactgcagtgtctctggcacagcttggtggc1440ccaggccgggcgggtctagggcgccagccccctggaggatgtgtactcagcctgggcctg1500ctgaaccctgtggctgtgcccctcgattgggcccggctgcccccacctgcccctccaggc1560ccctcgttcctgctgccactggcgccgggaccccagctgctcaacccagggacccccgtc1620tccccgcaggagcggcccccgccttacctggcagtcccaggacatggcgaggagtacccg1680gcggctggggcacacagcagccccccaaaggcccgcttcctgcgggttcccagtgagcac1740ccttacctgaccccatcccccgaatcccctgagcactgggccagcccctcacctccctcc1800ctctcagactggtccgaatccacgcccagcccagccactgccactggggccatggccacc1860accactggggcactgcctgcccagccacttcccttgtctgttcccagctcccttgctcag1920gcccagacccagctggggccccagccggaagttacccccaagaggcaagtgttggcctga1980<210>2<211>459<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2metthralagluglumetlysalathrgluserglyalaglnserala151015proleuprometgluglyvalaspileserprolysglnaspglugly202530valleulysvalilelysarggluglythrglythrglumetpromet354045ileglyaspargvalphevalhistyrthrglytrpleuleuaspgly505560thrlyspheaspserserleuasparglysasplyspheserpheasp65707580leuglylysglygluvalilelysalatrpaspilealailealathr859095metlysvalglygluvalcyshisilethrcyslysproglutyrala100105110tyrglyseralaglyserproprolysileproproasnalathrleu115120125valphegluvalgluleuphegluphelysglygluaspleuthrglu130135140glugluaspglyglyileileargargileglnthrargglyglugly145150155160tyralalysproasngluglyalailevalgluvalalaleuglugly165170175tyrtyrlysasplysleupheaspglnarggluleuargphegluile180185190glygluglygluasnleuaspleuprotyrglyleugluargalaile195200205glnargmetglulysglygluhisserilevaltyrleulysproser210215220tyralapheglyservalglylysglulyspheglnileproproasn225230235240alagluleulystyrgluleuhisleulysserpheglulysalalys245250255glusertrpglumetasnsergluglulysleugluglnserthrile260265270vallysgluargglythrvaltyrphelysgluglylystyrlysgln275280285alaleuleuglntyrlyslysilevalsertrpleuglutyrgluser290295300serpheserasngluglualaglnlysalaglnalaleuargleuala305310315320serhisleuasnleualametcyshisleulysleuglnalapheser325330335alaalaileglusercysasnlysalaleugluleuaspserasnasn340345350glulysglyleupheargargglyglualahisleualavalasnasp355360365phegluleualaargalaasppheglnlysvalleuglnleutyrpro370375380asnasnlysalaalalysthrglnleualavalcysglnglnargile385390395400argargglnleualaargglulyslysleutyralaasnmetpheglu405410415argleualagluglugluasnlysalalysalaglualasersergly420425430asphisprothraspthrglumetlysglugluglnlysserasnthr435440445alaglyserglnserglnvalgluthrgluala450455<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggggtaccatgacagccgaggagatgaag29<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gctctagactatgcttctgtctccacctg29当前第1页12