本发明涉及检测三阴乳腺癌的特异性引物领域，具体涉及一种检测待测dna甲基化的引物组合物、检测方法及应用。
背景技术：
：三阴乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。免疫系统可以通过免疫监视，以肿瘤特异性抗原为靶点，激活t细胞介导的抗肿瘤免疫反应，达到控制疾病的目的。人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen，hla)是机体免疫监视系统的重要组成部分，介导抗原呈递原件(antigenprocessingmachinery,apm)功能途径，将细胞内产生的抗原肽复合物递呈至细胞表面，使得细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxictlymphocytes,ctl)对细胞内源性抗原肽的识别成为可能，是抗肿瘤细胞免疫的重要前提。鳞状细胞类肿瘤及多种肿瘤细胞株中，hla-ⅰ类分子表达异常达9％～52％，其hla-ⅰ分子装配和稳定性的缺陷可能伴随着抗原呈递元件(apm)成员功能异常。在宫颈癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、食管鳞癌、头颈鳞癌、膀胱癌、卵巢癌和肾癌等常见恶性肿瘤中，发现hla-i类基因表达均存在不同程度的缺陷。近年来，发现三阴乳腺癌演进过程也与hla-ⅰ表达减弱或者完全缺失密切相关，尤其是与三阴乳腺癌临床进程和不良预后关系更为密切。由于三阴乳腺癌组织病理的多样性、同种病理肿瘤细胞的异质性和肿瘤生物学行为的复杂性，目前常规的单个基因检测对三阴乳腺癌的诊断价值有限。技术实现要素：本发明的目的是提供一种检测待测dna甲基化的引物组合物，可用于三阴乳腺癌的早期诊断。本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：一种检测待测dna甲基化的引物组合物，包括以下引物对：引物对a包括引物1和引物2，引物1的序列为：5’-aggaagagagagttaggatggtttttattttttga-3’，引物2的序列为：5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctaacaaaacaaacattctactaaaactca-3’；引物对b包括引物3和引物4，引物3的序列为：5’-aggaagagagttagtgtgatggttttggtttaggt-3’，引物4的序列为：5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctaacaaaacaaacattctactaaaactca-3’。进一步地，引物对a用于检测erp57基因的甲基化，引物对b用于检测lmp7基因的甲基化。进一步地，引物对a用于检测erp57基因cpg位点的甲基化，引物对b用于检测lmp7基因cpg位点的甲基化。本发明的另一目的在于提供一种pcr试剂组合物，包括pcr试剂a1和pcr试剂b1，pcr试剂a1包括按照体积份数的上述引物组合物中的引物对a2-3份、水1.3-1.5份、脱氧核苷酸混合物0.04-0.05份、dna聚合酶0.09-0.1份和dna聚合酶缓冲液0.5-0.6份，pcr试剂b1包括按照体积份数的上述引物组合物中的引物对b2-3份、水1.3-1.5份、脱氧核苷酸混合物0.04-0.05份、dna聚合酶0.09-0.1份和dna聚合酶缓冲液0.5-0.6份。进一步地，脱氧核苷酸混合物的浓度为25mmol/l，dna聚合酶的浓度为5u/μl。采用以上pcr试剂组合物，提高dna的纯度。本发明的另一目的在于提供一种检测待测dna甲基化的方法，包括如下步骤：s1、提取组织dna样品，凝胶电泳检测合格的dna浓度调整至70-75ng/μl，并且在-20～-40℃备用；s2、采用亚硫酸氢盐对dna进行修饰；s3、以转录起始点上游5000bp作为启动子区域，对成员基因erp57和lmp7经亚硫酸氢盐修饰后的dna序列分别设计一对特异性pcr引物；s4、以亚硫酸氢盐修饰后的dna为模板，进行pcr扩增、pcr产物纯化、体外转录、rnasea特异性酶切反应、树脂纯化、芯片点样质谱检测三阴乳腺癌特异的高甲基化基因及关键cpg位点。进一步地，步骤s4中的pcr扩增步骤中的循环参数包括：94℃10min4个循环；94℃45s，62℃48s，72℃1min10个循环；94℃45s，57℃48s，72℃1min35个循环；72℃3min1个循环。在以上扩增条件下，提高dna纯度，减少杂带。本发明的还一目的在于上述引物组合物或pcr试剂组合物，在乳腺癌中的应用，尤其在三阴乳腺癌中的应用。综上所述，本发明具有以下有益效果：根据基因erp57设计的序列为5’-aggaagagagagttaggatggtttttattttttga-3’的上游引物和序列为5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctaacaaaacaaacattctactaaaactca-3’的下游引物；根据基因lmp7设计的序列为5’-aggaagagagttagtgtgatggttttggtttaggt-3’的上游引物和序列为5’-cagtaatacgactcactatagggagaaggctaacaaaacaaacattctactaaaactca-3’的下游引物，以上组合物在三阴乳腺癌中表达下调，在三阴乳腺癌的检测中作为辅助参数。附图说明图1为乳腺病变组织中lmp蛋白的免疫组织化学染色注：以上均为免疫组化sp法(×400)；图2为乳腺病变组织中erap1、erp57蛋白的免疫组织化学染色；注：以上均为免疫组化sp法(×400)；图3为erp57的实验标准曲线；图4为erap1的实验标准曲线；图5为lmp2的实验标准曲线；图6为lmp7的实验标准曲线；图7为erp57基因的扩增曲线图；图8为erap1基因的扩增曲线图；图9为lmp2基因的扩增曲线图；图10为lmp7基因的扩增曲线图；图11为lmp7基因的cpg岛预测图；图12为erp57基因的cpg岛预测图；图13为erp57基因甲基化检测结果的epigram图；图14为lmp7基因甲基化检测结果的epigram图。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。实施例：本发明实施例提供的甲基化测试方法中所涉及的序列如表1所示。表1：序列本发明实施例提供的甲基化引物以及甲基化引物组成的甲基化引物组合中的各组特异性扩增引物序列均能够特异性地捕获待测样本中的目的基因，并通过pcr反应扩增目的基因，进而得出目的基因的甲基化水平。实施例：1、样本收集和保存收集不同临床分期的三阴乳腺癌和良性病变(乳腺纤维腺瘤)组织标本，一份用于免疫组织化学鉴定，另一份用锡箔纸包埋并用液氮冷冻，在-80℃保存。2、免疫组织化学法筛查取肿瘤和良性病变组织，在10％中性甲醛溶液中固定4小时，梯度乙醇各脱水2小时，二甲苯透明1小时，用熔化的石蜡包埋，石蜡经过凝固后，对其进行修整，之后每个标本连续切取4张，切片厚度为3μm，捞片并且在60℃烤箱中过夜。组织切片经常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，在tris-edta(ph9.0)溶液中进行抗原热修复(置95℃微波炉内持续20分钟)，室温下用3％过氧化氢溶液封闭15min，以清除内源性过氧化物酶。选择抗hla-a或hla-b或hla-c一抗(购自mab6383)和apm基因组(购自abs45135094)的单克隆抗体，每张切片加50μl抗体溶液，4℃冰箱过夜；然后，针对一抗的类型，选择相应的生物素标记二抗。将组织切片漂洗液(tbs缓冲液)洗涤3次之后，加入二抗，并在37℃恒温箱孵育1小时。最后，完成dab显色、苏木素复染细胞核、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，以便镜下观察判断。结果判定：hla-a、hla-b和hla-c蛋白的阳性表达为细胞质和/或细胞膜呈现棕黄色，tap1、tap2、lmp2、lmp7、lmp10、tapasin、erp57、erap1、calnexin、calreticulin蛋白的阳性表达为细胞质(偶见细胞核)呈现棕黄色或棕褐色颗粒。用光学显微镜观察免疫组织化学染色的切片，每个切片观察10个具有代表性的高倍镜视野，每个高倍镜视野计数100个细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，取10个视野的算术平均值。结果判定采用双盲法，由2位病理科医师对染色结果复阅核定。(一)三阴乳腺癌组织和纤维乳腺瘤中lmp2、lmp7和lmp10蛋白质表达水平关系lmp2、lmp7和lmp10蛋白主要在细胞质表达，有部分表达于细胞核(图1)。lmp2、lmp7蛋白在乳腺纤维腺瘤上皮细胞中正常表达，只有少数出现“完全缺失”(14％/18％)，但是三阴乳腺癌中正常表达水平下降，“部分缺失”和“完全缺失率”明显上升。从“完全缺失率”的角度分析，三阴乳腺癌组中lmp2、lmp7蛋白的缺失率很高(27.8％/67％；28.7％/46.1％)，与乳腺纤维腺瘤组相比均差异显著(p<0.01)(表2-4)，lmp10在乳腺纤维腺瘤和三阴乳腺癌组中的表达缺失率的趋势具有共性(乳腺纤维腺瘤48％，三阴乳腺癌56.5％)，但两组之间表达差异无统计学意义(p>0.05)。表2lmp2蛋白在乳腺病变组织中的表达表3lmp7蛋白在乳腺病变组织中的表达表4lmp10蛋白在乳腺病变组织中的表达(二)三阴乳腺癌组织和纤维乳腺瘤组织中erp57和erap1蛋白质表达水平的关系erp57在乳腺纤维腺瘤中呈棕黄色或棕褐色颗粒状强表达；在肿瘤组织细胞中表达下调，多呈阴性表达(图2)。erap1在乳腺纤维腺瘤中呈棕黄色或棕褐色颗粒状强表达；在肿瘤组织细胞中表达下调，多呈阴性表达(图2)。24例乳腺纤维腺瘤组织中erp57及erap1阳性表达率分别为100％(24/24)和83.3％(20/24)。124例三阴乳腺癌组织中erp57及erap1阳性表达率分别58.8％(73/124)和47.5％(59/124)。erp57及erap1在三阴乳腺癌中表达率明显低于乳腺纤维腺瘤中(p<0.01)，见表5。表5erp57与erap1在乳腺纤维腺瘤和三阴乳腺癌组织中的表达3、荧光定量pcr方法筛查分析(1)组织总rna提取：取一份铝箔纸包埋的冰冻组织标本(50～100mg)，在液氮冷冻状态下磨碎，加入trizol试剂采用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀方法提取组织总rna。经dna酶处理后，测定总rna浓度，以琼脂糖凝胶电泳、溴乙锭(替代品)显色和紫外成像质检(18和28srna)。(2)cdna合成：取1μg组织总rna，以oligo(dt)18为引物，合成cdna。(3)荧光定量pcr引物：选取lmp7和erp57基因，根据genebank数据库提供的mrna序列，利用专用软件(takara公司)设计其特异性引物对a和引物对b，并依托takara公司合成和质检。引物对a包括引物1(seq1)和引物2(seq2)，引物对b包括引物3(seq3)和引物4(seq4)。(4)pcr扩增：以cdna为模板，利用引物对a和与之对应的pcr试剂a1进行pcr扩增，其中pcr试剂a1包括引物对a2μl、水1.37μl、脱氧核苷酸混合物0.04μl、dna聚合酶0.09μl和dna聚合酶缓冲液0.5μl。利用引物对b和与之对应的pcr试剂b1进行pcr扩增，其中pcr试剂b1包括引物对b2μl、水1.37μl、脱氧核苷酸混合物0.04μl、dna聚合酶0.09μl和dna聚合酶缓冲液0.5μl。以2﹪琼脂糖凝胶电泳、溴乙锭显色和紫外成像获取pcr产物电泳图，选择pcr产物为单一特异性扩增条带。4、massarray技术定量分析hla-i和apm组成员基因甲基化状态s1、设计引物，扩增片段大小为200bp-600bp。在正向引物5’端加入10mertag，用于平衡pcr反应条件；反向引物5’端加入t7-promoter序列，用于后续的体外转录。引物设计完成后交由上海生工有限公司合成。s2、使用qiaampdnaminikit(qiagen)，提取组织中的dna。dna用分光光度计定量；并取100ngdna，用0.8％琼脂糖凝胶电泳质检，基因组dna电泳条带通常不小于20kb，电泳主带明显没有降解，a260/a280＝1.7-2.1，总量应不小于2ug。质检合格的dna将浓度调整到75ng/μl，转移至384孔板，-20℃储存备用。s3、dna样品亚硫酸盐处理：(1)加130μlctconversionreagent于对应的样品中，混匀；(2)pcr扩增，程序是：98℃，10min→64℃，2.5hours→4℃，forever。(3)加550μlm-bindingbuffer于ez纯化柱中，将处理好的样品取出放入对应的有m-bindingbuffer的ez纯化柱中，混匀后13,000rpm，30sec；(4)将收集管里的液体倒掉，加100μlwashbuffer，13000rpm，30sec；(5)加190μlm-desulphonationbuffer，室温放置15min，13,000rpm，30sec；(6)加200μlwashbuffer，13000rpm，30sec；(7)再加200μlwashbuffer，13000rpm，30sec；(8)将收集管里的液体倒掉，空离，13000rpm，1min；(9)将ez纯化柱放在一个干净的1.5ml离心管中，加20μlm-elutionbuffer，室温放置10min后，13000rpm，1min；(10)测定亚硫酸盐处理后的样品浓度。s4、以亚硫酸氢盐修饰后的dna为模板，进行pcr扩增，依照表6配制pcr体系运行如下pcr程序。表6pcr体系s5、pcr扩增程序结束后，通过电泳判断扩增结果。pcr产物电泳采用2％的琼脂糖凝胶进行，取5μl，2×loadingbuffer于电泳板里，加入1μlpcr产物进行电泳。s6、碱性磷酸酶处理(sap)(试剂盒：masscleavekit，sequenom)，依照下表7配制碱性磷酸酶处理体系。表7碱性磷酸酶处理体系以上体系充分混匀，用封口膜封好，1000rpm，1min，4℃离心，进行pcr扩增。pcr仪程序：37℃，3h→4℃，forever。s7、体外转录(ivt)和rnase酶切(试剂盒：masscleavekit，sequenom)，依照表8配制体外转录和rnase酶切处理体系。表8体外转录和rnase酶切处理体系tc体系vol.1×(μl)无霉无菌水(rnasefreewater)3.15t7聚合酶(5×t7polymerase)0.89缓冲液(buffer)0tcleavagemix0.24二硫苏糖醇(dtt)(100mm)0.22t7rna/dna0.44聚合酶(polymerase)0核糖核酸酶(rnasea)0.06总体积5.00sap处理后的pcr产物2.00将配好的体系充分混匀，用封口膜封好；1000rpm，1min，4±离心，放置于pcr仪中。pcr仪程序：37℃，3h→4℃，forever。s8、纯化、点样及质谱(试剂盒：spectroarraysandcleanresinkit,sequenom)。1.纯化：(1)将酶切产物平板离心，1000rpm，1min，4℃；(2)加18μlmbg水，移液枪吹吸5-6下混匀；用膜封好，1000rpm，1min，4℃离心；(3)加6mg树脂于样品中；用膜封好，放进杂交炉，室温，10rpm，30min，使树脂与样品充分作用；(4)4℃离心，3000rpm，3min。2.芯片点样及质谱检测使用massarraynanodispenserrs1000点样仪(sequenom)将纯化后产物点至384格式的spectrochip(sequenom)芯片上，将点制好的芯片放入massarraycompactsystem(sequenom)进行检测。spectrochip芯片使用maldi-tof(matrix-assistedlaserdesorption/ionization–timeofflight)基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术，检测数据通过epityper软件(sequenom)分析并输出结果。本发明构建了erp57、erap1、lmp2、lmp7的实验标准曲线，如图3、图4、图5和图6所示，以上基因的扩增曲线图如图7、图8、图9和图10所示。设计与合成erp57、erap1、lmp2和lmp7基因的mrna序列特异性引物，采用定量rt-pcr方法，对48例不同乳腺病变组织进行了mrna水平鉴定。结果显示，erp57和lmp7基因的转录水平在肿瘤组织中表达下调，与正常对照比较有统计学差异(p＜0.05)，但是erap1和lmp2表达水平无统计学差异(p>0.05)(见表9-10)，三阴乳腺癌发生与肿瘤组织内erp57和lmp7基因表达水平下调存在密切关系。表9乳腺纤维腺瘤和三阴乳腺癌中erp57、erap1基因mrna表达水平(x±s)表10乳腺纤维腺瘤和三阴乳腺癌中lmp2、lmp7基因mrna表达水平(x±s)三阴乳腺癌病变与apm基因甲基化水平的关系：以转录起始位点上游5000bp作为启动子区域，利用专用软件(methylprimerexpressversion1.0,abi公司)预测cpg岛(见图11-12)，使用sequenom公司epidesigner设计lmp7和erp57甲基化特异性引物序列，扩增片段大小分别为465bp和252bp，在正向引物5’端加入10mertag，用于平衡pcr反应条件；反向引物5’端加入t7-promoter序列，用于后续的体外转录(ivt)(见表11)。dna甲基化分析中，检测对象是单一cpg位点，而不是整体目的片段，通过dna片段的单一cpg位点进行单独测试，输出每一个cpg位点(或几个cpg联点)甲基化率信息。表11lmp7和erp57基因修饰后引物序列dna甲基化分析中，检测对象是单一cpg位点，通过dna片段的单一cpg位点进行单独测试，输出每一个cpg位点(或几个cpg联点)甲基化率信息。根据统计分析，发现erp57基因启动子区的目的cpg片段原有的9个cpg位点均发生不同程度的甲基化改变，而只有cpg_8和cpg_9单一cpg位点在不同乳腺病变组织之间均存在甲基化水平差异(p＜0.01)，lmp7基因启动子区的目的cpg片段原有的32个cpg位点均发生不同程度的甲基化改变，而只有cpg_1、cpg_12.13.14、cpg_25cpg_30等4个单一cpg位点或联合位点在不同乳腺病变组织之间存在甲基化水平差异(p＜0.01)(见表12-13，图13-14)。表12乳腺病变组织中erp57基因启动子区cpg单点甲基化水平分析sequenommassarray技术平台定量分析乳腺病变组织中erp57基因启动子区cpg位点甲基化谱，每一条横线a01-e05代表检测样本，0-250代表pcr产物长度，每一条纵线上的点代表一个标本该基因启动子区的一个cpg位点，颜色代表相应cpg岛甲基化水平，由淡黄色到深蓝色为递增。表13乳腺病变组织中lmp7基因启动子区cpg单点甲基化水平分析sequenommassarray技术平台定量分析乳腺病变组织中lmp7基因启动子区cpg位点甲基化谱，每一条横线a01-e05代表检测样本，0-250代表pcr产物长度，每一条纵线上的点代表一个标本该基因启动子区的一个cpg位点，颜色代表相应cpg岛甲基化水平，由浅色到深色为递增。本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。序列表<110>新疆医科大学附属肿瘤医院<120>检测待测dna甲基化的引物组合物、检测方法及应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aggaagagagagttaggatggtttttattttttga35<210>2<211>59<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cagtaatacgactcactatagggagaaggctaacaaaacaaacattctactaaaactca59<210>3<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aggaagagagttagtgtgatggttttggtttaggt35<210>4<211>59<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cagtaatacgactcactatagggagaaggctaacaaaacaaacattctactaaaactca59当前第1页12