一种天冬氨酸酶突变体的制作方法

文档序号:15469496发布日期:2018-09-18 19:57阅读:300来源:国知局
本发明属于生物催化领域,具体地说,涉及一种天冬氨酸酶突变体,并且涉及该天冬氨酸酶突变体或者其表达微生物在生产天冬氨酸中的用途。
背景技术
:L-天冬氨酸(L-Asparticacid缩写Asp),又名α-氨基丁二酸,在医药,食品和化工领域有着广泛的用途。在医药方面,天冬氨酸可以用于治疗心脏病、肝脏病、高血压症,具有防止和恢复疲劳的作用,可与多种氨基酸一起制成氨基酸输液,用作氨解毒剂、肝功能促进剂和疲劳恢复剂;在食品工业方面,是一种良好的营养增补剂,添加于各种清凉饮料,也是甜味素(阿斯巴甜)-天冬酰苯丙氨酸甲酯的主要原料;在化工方面,可以作为制造合成树脂的原料,亦可作为化妆品的营养性添加剂等。目前,L-天门冬氨酸作为最主要的氨基酸之一,国内生产规模已经达到20000吨/年。L-天冬氨酸的工业化生产始于1974年的日本,我国在20世纪80年代后期也进行了工业化生产。目前,L-天门冬氨酸的制备主要是用生物酶法(固定化酶法和游离整体细胞法),即利用L-天冬氨酸酶催化氨与富马酸发生加成反应而得。游离整体细胞法与固定化细胞法相比,具有酶活力高、工艺简单、设备投资少等优势,具有很强的市场竞争力。游离整体细胞法合成L-天冬氨酸主要通过高产天门冬氨酸酶菌种的筛选、提高天冬氨酸酶活和酶的分子生物学等几个方面来提高酶转化效率。天冬氨酸酶(EC4.3.1.1,Aspartase,缩写ASPase)还可逆催化L-天冬氨酸转化为富马酸和NH4。大肠杆菌来源的L-天冬氨酸酶是由4个相同亚基组成,并呈点对称P212121排列,单亚基无催化功能,每个亚基由3个结构域组成(D1、D2和D3)呈S形,中央结构域(D2)含有一半以上的氨基酸残基,它是天冬氨酸酶-富马酸酶族最保守的结构域。由于亚基间相互作用,来自4个亚基的D25个螺旋束形成一个稳定的20螺旋簇,从而构成四聚体(JMedMolBiol2004,1(6):327-333.)。由于天冬氨酸具有广阔的用途,如何提高天冬氨酸的生产率从而降低生产成本一直是研究热点,而开发高催化活性的天冬氨酸酶ASPase始终是科研人员追求的目标。技术实现要素:为了获得具有高催化活性的天冬氨酸酶,本发明以大肠杆菌来源的天冬氨酸酶基因作为基础,通过易错PCR的方法建立ASPase基因突变库,再通过筛选基因突变库获得活力明显提高的天冬氨酸酶。因此,本发明的第一个目的在于提供一种天冬氨酸酶,其氨基酸序列为SEQIDNO:1:MSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRCQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGARAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIIPALVAPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ(SEQIDNO:1)。本发明的第二个目的在于提供编码上述天冬氨酸酶的基因。优选地,上述基因的碱基序列为SEQIDNO:2:atgtcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgggtaccagggaagttccagctgatgcctactatggtgttcacactctgagagcgattgaaaacttctatatcagcaacaacaaaatcagtgatattcctgaatttgttcgcggtatggtaatggttaaaaaagccgcagctatggcaaacaaagagctgcaaaccattcctaaaagtgtagcgaatgccatcattgccgcatgtgatgaagtcctgaacaacggaaaatgcatggatcagttcccggtagacgtctaccagggcggcgcaggtacttccgtaaacatgaacaccaacgaagtgctggccaatatcggtctggaactgatgggtcaccagaaaggtgaatatcagtacctgaacccgaacgaccatgttaacaaatgtcagtccactaacgacgcctacccgaccggtttccgtatcgcagtttactcttctctgattaagctggtagatgcgattaaccaactgcgtgaaggctttgaacgtaaagctgtcgaattccaggacatcctgaaaatgggtcgttgtcagctgcaggacgcagtaccgatgaccctcggtcaggaattccgcgctttcagcatcctgctgaaagaagaagtgaaaaatatccaacgtaccgctgaactgctgctggaagttaaccttggcgcacgtgcaatcggtactggtctgaacacgccgaaagagtactctccgctggcagtgaaaaaactggctgaagtcactggcttcccatgcgtaccggctgaagacctgatcgaagcgacctctgactgcggcgcttatgtaatggttcacggcgcgctgaaacgcctggctgtgaagatgtccaaaatctgtaacgacctgcgcttgctctcttctggcccacgtgccggcctgaacgagatcaacctgccggaactgcaggcgggctcttccatcatcccagctctcgtagctccggttgttccggaagtggttaaccaggtatgcttcaaagtcatcggtaacgacaccactgttaccatggcagcagaagcaggtcagctgcagttgaacgttatggagccggtcattggccaggccatgtttgaatccgttcacattctgaccaacgcttgctacaacctgctggaaaaatgcattaacggcatcactgctaacaaagaagtgtgcgaaggttacgtttacaactctatcggtatcgttacttacctgaacccgttcatcggtcaccacaacggtgacatcgtgggtaaaatctgtgccgaaaccggtaagagtgtacgtgaagtcgttctggaacgcggtctgttgactgaagcggaacttgacgatattttctccgtacagaatctgatgcacccggcttacaaagcaaaacgctatactgatgaaagcgaacagtaa(SEQIDNO:2)。本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。优选地,上述微生物选自大肠杆菌、酵母、枯草杆菌。更优选大肠杆菌BL21(DE3)。本发明的第五个目的在于提供上述天冬氨酸酶或表达微生物在生产L-天冬氨酸中的用途。在一种实施方式中,上述用途是以富马酸为底物原料,通过与氨发生加成反应来生产天冬氨酸。优选地,上述加成反应在pH8.5-9.0,温度40-45℃下进行。本发明用ASPase突变体的基因转化E.coliBL21(DE3),构建出高表达天冬氨酸酶的重组菌,使用该重组菌进行了50L规模化生产天冬氨酸的实验,发现底物富马酸的浓度可以达到400g/L,在pH8.5-9.0,温度40-45℃下反应,24小时转化率最高可以达到98.5%以上,证明具有工业化应用前景。附图说明图1是天冬氨酸酶SEQIDNO:1的最适反应pH值曲线图;图2是天冬氨酸酶SEQIDNO:1的最适反应温度曲线图。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度,其中所述的百分含量,除特别说明外,皆指质量百分含量。本文的实施例中,如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明,则该温度通常指室温(15-25℃)。作为构建天冬氨酸酶突变体的基础模板,来源于大肠杆菌EscherichiacoliPCN033的基因序列为GenBank:CP006632.1atgtcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgggtaccagggaagttccagctgatgcctactatggtgttcacactctgagagcgattgaaaacttctatatcagcaacaacaaaatcagtgatattcctgaatttgttcgcggtatggtaatggttaaaaaagccgcagctatggcaaacaaagagctgcaaaccattcctaaaagtgtagcgaatgccatcattgccgcatgtgatgaagtcctgaacaacggaaaatgcatggatcagttcccggtagacgtctaccagggcggcgcaggtacttccgtaaacatgaacaccaacgaagtgctggccaatatcggtctggaactgatgggtcaccagaaaggtgaatatcagtacctgaacccgaacgaccatgttaacaaatgtcagtccactaacgacgcctacccgaccggtttccgtatcgcagtttactcttctctgattaagctggtagatgcgattaaccaactgcgtgaaggctttgaacgtaaagctgtcgaattccaggacatcctgaaaatgggtcgtacccagctgcaggacgcagtaccgatgaccctcggtcaggaattccgcgctttcagcatcctgctgaaagaagaagtgaaaaatatccaacgtaccgctgaactgctgctggaagttaaccttggcgcaacagcaatcggtactggtctgaacacgccgaaagagtactctccgctggcagtgaaaaaactggctgaagtcactggcttcccatgcgtaccggctgaagacctgatcgaagcgacctctgactgcggcgcttatgtaatggttcacggcgcgctgaaacgcctggctgtgaagatgtccaaaatctgtaacgacctgcgcttgctctcttctggcccacgtgccggcctgaacgagatcaacctgccggaactgcaggcgggctcttccatcatgccagctaaagtaaacccggttgttccggaagtggttaaccaggtatgcttcaaagtcatcggtaacgacaccactgttaccatggcagcagaagcaggtcagctgcagttgaacgttatggagccggtcattggccaggccatgtttgaatccgttcacattctgaccaacgcttgctacaacctgctggaaaaatgcattaacggcatcactgctaacaaagaagtgtgcgaaggttacgtttacaactctatcggtatcgttacttacctgaacccgttcatcggtcaccacaacggtgacatcgtgggtaaaatctgtgccgaaaccggtaagagtgtacgtgaagtcgttctggaacgcggtctgttgactgaagcggaacttgacgatattttctccgtacagaatctgatgcacccggcttacaaagcaaaacgctatactgatgaaagcgaacagtaa(SEQIDNO:3)。其编码的野生型天冬氨酸酶(ASPase)的氨基酸序列为GenBank:AKK51077.1:MSNNIRIEEDLLGTREVPADAYYGVHTLRAIENFYISNNKISDIPEFVRGMVMVKKAAAMANKELQTIPKSVANAIIAACDEVLNNGKCMDQFPVDVYQGGAGTSVNMNTNEVLANIGLELMGHQKGEYQYLNPNDHVNKCQSTNDAYPTGFRIAVYSSLIKLVDAINQLREGFERKAVEFQDILKMGRTQLQDAVPMTLGQEFRAFSILLKEEVKNIQRTAELLLEVNLGATAIGTGLNTPKEYSPLAVKKLAEVTGFPCVPAEDLIEATSDCGAYVMVHGALKRLAVKMSKICNDLRLLSSGPRAGLNEINLPELQAGSSIMPAKVNPVVPEVVNQVCFKVIGNDTTVTMAAEAGQLQLNVMEPVIGQAMFESVHILTNACYNLLEKCINGITANKEVCEGYVYNSIGIVTYLNPFIGHHNGDIVGKICAETGKSVREVVLERGLLTEAELDDIFSVQNLMHPAYKAKRYTDESEQ(SEQIDNO:4)。为了获得酶活性更高的天冬氨酸酶突变体,本发明对野生型天冬氨酸酶的基因序列SEQIDNO:3进行点突变。通过易错PCR技术获得一个或多个氨基酸位点取代的突变体氨基酸序列,筛选出6个可提高天冬氨酸酶的酶活力的位点,然后以定点组合突变的方式,获得一株酶活力明显提高的突变体。在本文中,“L-天冬氨酸”可简称为“天冬氨酸”、“天门冬氨酸”或者“Asp”。在本文中,术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义,都是指未经基因工程改造的天冬氨酸酶SEQIDNO:4。本发明的天冬氨酸酶突变体由于氨基酸序列明确,因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。上述转化体宿主可以是任何适合表达天冬氨酸酶突变体的微生物,括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者枯草杆菌,优选大肠杆菌,更优选大肠杆菌BL21(DE3)。当作为生物催化剂用于生产天冬氨酸时,本发明的天冬氨酸酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶,包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等;所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。本发明的天冬氨酸酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。实施例材料和方法本文中的全基因合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成;表达载体由浙江华睿生物技术有限公司亚克隆制备。引物合成及测序皆由生工生物工程上海股份有限公司完成。本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等,主要参照《分子克隆实验指南》(第三版),J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔(美)编著,黄培堂等译,科学出版社,北京,2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。1.天冬氨酸酶(ASPase)活力测定天冬氨酸酶酶活测定底物溶液配制:称取富马酸100g,硫酸镁0.12g,加入适量蒸馏水搅拌均匀,缓慢加入浓氨水,调节pH8.5后定容至500mL,既得20%的富马酸铵溶液。将0.1-0.5g湿重的大肠杆菌菌体加入到20%富马酸铵底物溶液(内含2mMMg2+)中,45℃,250rpm,反应2小时。利用高锰酸钾滴定法(取反应液0.1mL,加入15mL98%浓硫酸,加热到60~70℃,用0.1M的KMnO4滴定,30s不褪色为滴定终点),测定反应体系中富马酸量,计算酶活。酶活定义:在45℃,pH8.5条件下,每分钟转化1μmol富马酸底物的酶量定义为一个酶活力单位U。2.天冬氨酸的HPLC测定色谱条件:安捷伦1260高效液相,watersSymmetry(250×4.6mm,5μm)色谱柱,流速1mL/min,波长:338nm,柱温:35℃,进样量20μL,流动相A:B(40:60)。流动相A相:称取2.72gCH3COONa·3H2O,加1000mL超纯水溶解后,加180μL三乙胺,用乙酸调pH至7.20,加3mL四氢呋喃。流动相B相:200mL乙腈和200mL甲醇,加入到100mL的流动相A中。柱前衍生剂:取270mg邻苯二甲醛+5mL无水乙醇+200μL2-巯基乙醇,用0.4M、pH9.5的硼酸缓冲液定容至50mL。此溶液要求现配现用。衍生样品溶液:精密量取适量反应液0.5mL至10mL容量瓶中,纯化水定容至刻度。精确移取0.5mL上述溶液于50mL棕色容量瓶中,依次加入10mL0.4M、pH9.5的硼酸缓冲液和10mL柱前衍生剂,快速摇动,1min后加入0.4M、pH9.5的硼酸缓冲液至刻度,过滤进液相进行分析。以外标法计算天冬氨酸含量(g/L)。3.培养基发酵培养基:蛋白胨20g/L,酵母浸粉5g/L,甘油4.0mL/L,反丁烯二酸(富马酸)2g/L,磷酸二氢钾1g/L,NH4NO38g/L,氨水调节pH至7.5,121℃灭菌20min。LB培养基:10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠,pH7.2,121℃高温高压灭菌20min。实施例1天冬氨酸酶基因工程菌构建1.1通过全基因序列合成序列SEQIDNO:3,两端设计酶切位点NdeI和BamHI,克隆到pSH质粒上相应位点,得到重组质粒pSH-ASPase,然后用氯化钙法转化入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)感受态细胞中,涂含卡那霉素的LB培养基平板,37℃培养过夜,挑选单菌落,接种到含有LB培养基的试管中,培养过夜,离心收集菌体,抽提质粒,基因测序确定正确,得到表达野生型ASPase的重组基因工程菌株BL21(DE3)/pSH-ASPase。氨基酸序列测定为SEQIDNO:4。1.2从含有ASPase工程菌种的平板挑选单克隆,接种到5mLLB培养基中,37℃培养过;1%v/v接种到含有100mL发酵培养基的1000mL摇瓶中培养4-6小时,OD600达到1.2-1.5,加入0.2mM的IPTG诱导,降温到25℃培养10-16小时,离心获得菌体,-80℃冻存24小时备用。实施例2易错PCR法构建天冬氨酸酶随机突变点库以SEQIDNO:3为模板,应用易错PCR技术构建随机突变体库。正向引物:5’-ATGTACCTGCGCACCATCCTCGGAAG-3’,反向引物:5’-CTCGAGCTAAATGCTTCTCGACGTCAAAAGC-3’。50μL易错PCR反应体系包括:50ng质粒模板pSH-ASPase,30pmol引物对,1XTaqbuffer,0.2mMdGTP,0.2mMdATP,1mMdCTP,1mMdTTP,7mMMgCl2,(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2,2.5个单位的Taq酶(fermentas)。PCR反应条件为:95℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃2min/kbp;30个循环;72℃10min。胶回收2.0kb随机突变片段作为大引物,用KOD-plusDNA聚合酶做MegaPrimerPCR:94℃5min,;98℃10s,60℃30s,68℃2min/kbp,25个循环;68℃10min。DpnI消化质粒模板,电转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),得到超过104个克隆的随机突变库。实施例3突变体库的高通量筛选3.1选取突变体库中的转化子接种到含600μLLB培养基的96孔深孔培养板中,培养基中含100μg/mL卡那霉素和0.1mMIPTG,37℃培养6h后,降温至25℃,培养过夜。5000rpm离心10min,弃上清,置于-70℃冷冻1h,室温融化30min。3.2试剂配制:反应母液:200g富马酸,加入约800ml水,搅拌均匀后,用浓氨水调节PH至8.5,然后加入终浓度为2mM的硫酸镁,搅拌均匀后,定容至1L。终止反应液:2M盐酸。3.3反应过程:在冻融菌体中加入600μL反应母液,45℃的条件下反应60min,加入等体积的终止液终止反应,然后5000rpm离心10min,取200μL上清,检测240nm下的吸光值。3.4高酶活突变体的测定和筛选按照前述方法,对各个天冬氨酸酶突变体的酶活力,进行重复筛选和测定。在随机突变库,通过对约10000个突变体克隆筛选,筛选出6个可提高天冬氨酸酶的酶活力的位点,结果如表1所示。表1.部分天冬氨酸酶突变体的酶活力比较天冬氨酸酶编号突变氨基酸酶比活力(%)*野生ASPase--100ASPase-368T190C,T233R447ASPase-2547V367G,K327M257ASPase-3248N329C395ASPase-3661T190C,T233R,M324I,K327L,N329A1075ASPase-5348T233R,K327L,N329C547ASPase-6572M324I436ASPase-7136T190C,K327L635ASPase-7617T233R,K327L,N329A867*酶比活力:以野生酶的酶活力(U/ml)与菌体浓度OD(OD/ml)的比值为100%。其中编号为ASPase-3661的突变体(T190C,T233R,M324I,K327L,N329A)的酶活力相对于野生型ASPase提高了约10倍。ASPase-3661的突变体氨基酸序列为SEQIDNO:1。实施例4高酶活基因工程菌的构建将突变体ASPase-3661的编码基因SEQIDNO:2按照实施例1中的方法克隆到pSH质粒中,得到重组质粒pSH-ASPase-3661,然后用氯化钙法转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,涂含卡那霉素的LB培养基平板,37℃培养过夜,挑选10个单菌落,接种到含有LB培养基的试管中,培养过夜,离心收集菌体,抽提质粒,基因测序确定突变正确,得到重组菌株。本领域技术人员应当理解,包括SEQIDNO:2在内的突变体ASPase-3661编码基因、也可在枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母中表达,表达宿主不限于大肠杆菌。实施例5野生型ASPase和突变体ASPase-3661菌株的发酵分别从表达野生型ASPase和表达突变体ASPase-3661的基因工程菌种的平板上挑选单克隆,接种到5mLLB培养基中,37℃培养过;5%v/v接种到含有3L发酵培养基的5L发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司)中培养4-6小时,OD600达到1.2-1.5,加入0.2mM的IPTG诱导,降温到25℃培养10-16小时,离心获得菌体,-80℃冻存24小时备用。实施例6突变体ASPase-3661的反应特点考察6.1测定天冬氨酸酶ASPase-3661的最适pH值。天冬氨酸酶酶活测定底物溶液配制:称取富马酸10g,硫酸镁0.012g,加入适量蒸馏水搅拌均匀,缓慢加入浓氨水,分别调节溶液pH为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0,定容至50mL,即得20%的富马酸铵溶液。将0.1-0.5g湿重的大肠杆菌菌体加入到20%富马酸铵底物溶液(内含2mMMg2+)中,于45℃,250rpm下反应2小时。利用高锰酸钾滴定法(取反应液0.1mL,加入15mL98%浓度的浓硫酸,加热到60~70℃,然后用0.1MKMnO4滴定,30s不褪色为滴定终点),测定反应体系中富马酸量,计算酶活。将统计结果绘制成曲线,得到如图1所示的最适反应pH值曲线图。由该曲线可知,天冬氨酸酶SEQIDNO:1的最适反应pH值为pH8.5-9.0。6.2测定天冬氨酸酶ASPase-3661的最适反应温度。天冬氨酸酶酶活测定底物溶液配制:称取富马酸10g,硫酸镁0.012g,加入适量蒸馏水搅拌均匀,缓慢加入浓氨水,调整至pH8.5,定容至50mL,既得20%的富马酸铵溶液。将0.1-0.5g湿重的大肠杆菌菌体加入到20%富马酸铵底物溶液(内含2mMMg2+)中,分别控制反应温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃,在pH8.5,250rpm下反应2小时。利用高锰酸钾滴定法(取反应液0.1mL,加入15mL98%浓度的浓硫酸,加热到60~70℃,然后用0.1MKMnO4滴定,30s不褪色为滴定终点),测定反应体系中富马酸量,计算酶活。将统计结果绘制成曲线,得到如图2所示的最适反应温度曲线图。由该曲线可知,天冬氨酸酶SEQIDNO:1的最适反应温度为40-45℃。实施例7突变体ASPase-3661催化富马酸加氨反应制备L-天冬氨酸7.1不同酶量ASPase-3661催化富马酸加氨反应制备L-天冬氨酸反应体系200mL,底物富马酸浓度为400g/L(内含2mMMg2+),用浓氨水调节至pH8.5,加酶量分别为1000、2000、4000、8000、10000U/g底物,于45℃、pH8.5、250rpm下反应20-24h,测定L-天冬氨酸,计算底物最高转化率,结果见表2。表2:不同酶量ASPase-3661催化富马酸反应制备L-天冬氨酸7.3规模化生产L-天冬氨酸反应体系50L,称取底物富马酸20kg,硫酸镁24g,加入适量蒸馏水搅拌均匀,缓慢加入浓氨水,调整至pH8.5,加酶量为4000U/g底物,定容至50L。于45℃下搅拌反应24h,检测体系中产物L-天冬氨酸生成量。确定最后反应体系的底物转化率超过98.5%。上述实施例对本发明的天冬氨酸酶突变体生产L-天冬氨酸的工艺进行了验证,相关的工艺条件可以进一步优化。本领域的技术人员应理解,在不违背本发明的思想下,本领域技术人员可以在此基础上做出各种改动或者修改,所做的各种变形或者修改的等价形式,同样应属于本发明的范围。另外,需说明的是,本说明书中对先前公开的文献的列举和论述不应视为承认该文献是现有技术或者是公知常识。序列表<110>浙江华睿生物技术有限公司<120>一种天冬氨酸酶突变体<130>SHPI1810346<160>4<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>478<212>PRT<213>人工序列()<400>1MetSerAsnAsnIleArgIleGluGluAspLeuLeuGlyThrArgGlu151015ValProAlaAspAlaTyrTyrGlyValHisThrLeuArgAlaIleGlu202530AsnPheTyrIleSerAsnAsnLysIleSerAspIleProGluPheVal354045ArgGlyMetValMetValLysLysAlaAlaAlaMetAlaAsnLysGlu505560LeuGlnThrIleProLysSerValAlaAsnAlaIleIleAlaAlaCys65707580AspGluValLeuAsnAsnGlyLysCysMetAspGlnPheProValAsp859095ValTyrGlnGlyGlyAlaGlyThrSerValAsnMetAsnThrAsnGlu100105110ValLeuAlaAsnIleGlyLeuGluLeuMetGlyHisGlnLysGlyGlu115120125TyrGlnTyrLeuAsnProAsnAspHisValAsnLysCysGlnSerThr130135140AsnAspAlaTyrProThrGlyPheArgIleAlaValTyrSerSerLeu145150155160IleLysLeuValAspAlaIleAsnGlnLeuArgGluGlyPheGluArg165170175LysAlaValGluPheGlnAspIleLeuLysMetGlyArgCysGlnLeu180185190GlnAspAlaValProMetThrLeuGlyGlnGluPheArgAlaPheSer195200205IleLeuLeuLysGluGluValLysAsnIleGlnArgThrAlaGluLeu210215220LeuLeuGluValAsnLeuGlyAlaArgAlaIleGlyThrGlyLeuAsn225230235240ThrProLysGluTyrSerProLeuAlaValLysLysLeuAlaGluVal245250255ThrGlyPheProCysValProAlaGluAspLeuIleGluAlaThrSer260265270AspCysGlyAlaTyrValMetValHisGlyAlaLeuLysArgLeuAla275280285ValLysMetSerLysIleCysAsnAspLeuArgLeuLeuSerSerGly290295300ProArgAlaGlyLeuAsnGluIleAsnLeuProGluLeuGlnAlaGly305310315320SerSerIleIleProAlaLeuValAlaProValValProGluValVal325330335AsnGlnValCysPheLysValIleGlyAsnAspThrThrValThrMet340345350AlaAlaGluAlaGlyGlnLeuGlnLeuAsnValMetGluProValIle355360365GlyGlnAlaMetPheGluSerValHisIleLeuThrAsnAlaCysTyr370375380AsnLeuLeuGluLysCysIleAsnGlyIleThrAlaAsnLysGluVal385390395400CysGluGlyTyrValTyrAsnSerIleGlyIleValThrTyrLeuAsn405410415ProPheIleGlyHisHisAsnGlyAspIleValGlyLysIleCysAla420425430GluThrGlyLysSerValArgGluValValLeuGluArgGlyLeuLeu435440445ThrGluAlaGluLeuAspAspIlePheSerValGlnAsnLeuMetHis450455460ProAlaTyrLysAlaLysArgTyrThrAspGluSerGluGln465470475<210>2<211>1437<212>DNA<213>人工序列()<400>2atgtcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgggtaccagggaagttccagctgat60gcctactatggtgttcacactctgagagcgattgaaaacttctatatcagcaacaacaaa120atcagtgatattcctgaatttgttcgcggtatggtaatggttaaaaaagccgcagctatg180gcaaacaaagagctgcaaaccattcctaaaagtgtagcgaatgccatcattgccgcatgt240gatgaagtcctgaacaacggaaaatgcatggatcagttcccggtagacgtctaccagggc300ggcgcaggtacttccgtaaacatgaacaccaacgaagtgctggccaatatcggtctggaa360ctgatgggtcaccagaaaggtgaatatcagtacctgaacccgaacgaccatgttaacaaa420tgtcagtccactaacgacgcctacccgaccggtttccgtatcgcagtttactcttctctg480attaagctggtagatgcgattaaccaactgcgtgaaggctttgaacgtaaagctgtcgaa540ttccaggacatcctgaaaatgggtcgttgtcagctgcaggacgcagtaccgatgaccctc600ggtcaggaattccgcgctttcagcatcctgctgaaagaagaagtgaaaaatatccaacgt660accgctgaactgctgctggaagttaaccttggcgcacgtgcaatcggtactggtctgaac720acgccgaaagagtactctccgctggcagtgaaaaaactggctgaagtcactggcttccca780tgcgtaccggctgaagacctgatcgaagcgacctctgactgcggcgcttatgtaatggtt840cacggcgcgctgaaacgcctggctgtgaagatgtccaaaatctgtaacgacctgcgcttg900ctctcttctggcccacgtgccggcctgaacgagatcaacctgccggaactgcaggcgggc960tcttccatcatcccagctctcgtagctccggttgttccggaagtggttaaccaggtatgc1020ttcaaagtcatcggtaacgacaccactgttaccatggcagcagaagcaggtcagctgcag1080ttgaacgttatggagccggtcattggccaggccatgtttgaatccgttcacattctgacc1140aacgcttgctacaacctgctggaaaaatgcattaacggcatcactgctaacaaagaagtg1200tgcgaaggttacgtttacaactctatcggtatcgttacttacctgaacccgttcatcggt1260caccacaacggtgacatcgtgggtaaaatctgtgccgaaaccggtaagagtgtacgtgaa1320gtcgttctggaacgcggtctgttgactgaagcggaacttgacgatattttctccgtacag1380aatctgatgcacccggcttacaaagcaaaacgctatactgatgaaagcgaacagtaa1437<210>3<211>1437<212>DNA<213>GenBank:CP006632.1<400>3atgtcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgggtaccagggaagttccagctgat60gcctactatggtgttcacactctgagagcgattgaaaacttctatatcagcaacaacaaa120atcagtgatattcctgaatttgttcgcggtatggtaatggttaaaaaagccgcagctatg180gcaaacaaagagctgcaaaccattcctaaaagtgtagcgaatgccatcattgccgcatgt240gatgaagtcctgaacaacggaaaatgcatggatcagttcccggtagacgtctaccagggc300ggcgcaggtacttccgtaaacatgaacaccaacgaagtgctggccaatatcggtctggaa360ctgatgggtcaccagaaaggtgaatatcagtacctgaacccgaacgaccatgttaacaaa420tgtcagtccactaacgacgcctacccgaccggtttccgtatcgcagtttactcttctctg480attaagctggtagatgcgattaaccaactgcgtgaaggctttgaacgtaaagctgtcgaa540ttccaggacatcctgaaaatgggtcgtacccagctgcaggacgcagtaccgatgaccctc600ggtcaggaattccgcgctttcagcatcctgctgaaagaagaagtgaaaaatatcca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