一种基于测定环境胁迫下斑马鱼M受体的奇数受体亚型表达评估水质的方法与流程

文档序号:15457521发布日期:2018-09-15 01:32
本发明属于分子生态学
技术领域
,具体涉及一种基于测定环境胁迫下斑马鱼M受体的奇数受体亚型表达评估水质的方法。
背景技术
:随着社会经济的快速发展以及人口的迅猛增长,水污染问题日益严重,直接危害到我们的正常生活,世界各国都面临着淡水资源短缺的问题。我国作为一个人口大国,人均淡水量较低,又由于工业废水,废渣的排放,农业化肥农药的滥用,生活污水和生活垃圾的乱倒,导致地下水和河流的严重污染,可用的淡水资源越来越少,水资源短缺问题受到人们的广泛关注,国家也制定了相应的法律法规来监管和治理,相应的水质评估和监测也成为研究热点。目前水质评估的方法很多,包括物理、化学检测,生物监测等。随着科技的发展和社会的需求,快速水质评估越来越受到广大学者的青睐,其中,主要使用斑马鱼来作为受试生物。斑马鱼具有易饲养,繁殖快,成本低,胚胎外部发育,以及与人类基因具有87%的高度同源性等优点,使其成为国际标准模式生物,常可用于水质环境的评估和监测。人们通过对斑马鱼的死亡率、致畸率,行为变化,代谢变化等来测定受到环境损伤后斑马鱼的变化,并以此来进行水质的评估和监测等。但是,斑马鱼这些指标的变化都受到内在神经的支配,具有一定的延时性。M受体这一神经递质(乙酰胆碱)受体表达在受到外界环境胁迫后必然会发生变化,因此考虑采用M受体蛋白表达变化量来进行水质的评估。但是由于目前尚未找到斑马鱼相应的M受体抗体,无法直接进行斑马鱼M受体蛋白活性的测定。技术实现要素:针对上述现有技术存在的问题,本发明通过实时荧光定量PCR技术快速检测斑马鱼眼部M受体奇数受体的表达量的变化,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,在线监控反应过程,结合相关的软件对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。本发明所述方法较其他的方法灵敏度更高,可以达到相对定量或绝对定量的目的,并且通过对斑马鱼M受体奇数受体表达量变化的检测,进而实现快速水质评估的目的。本发明的目的之一是提供一种荧光定量PCR在快速检测斑马鱼M受体奇数受体中的应用。本发明的目的之二是提供一种荧光定量PCR在快速检测斑马鱼M受体奇数受体的方法。本发明的目的之三是提供上述方法在水质评估与监测中的应用。为实现上述目的,具体的,本发明采用以下技术方案:本发明的第一个方面,提供一种荧光定量PCR在快速检测斑马鱼M受体奇数受体中的应用。其中,所述斑马鱼为成年斑马鱼,进一步优选的,斑马鱼鱼龄为3~6个月;进一步的,所述斑马鱼M受体奇数受体的提取检测部位为眼部;进一步的,所述斑马鱼M受体奇数受体包括但不限于M1a,M1b,M3a,M3b,M5a,M5b;更进一步的,所述斑马鱼M受体奇数受体为M5b;本发明的第二个方面,提供一种荧光定量PCR在快速检测斑马鱼M受体奇数受体的方法,所述方法为:S1.提取斑马鱼总RNA;S2.cDNA克隆:对提取的总RNA进行反转录得cDNA;S3.荧光定量PCR:进行PCR扩增,得到扩增曲线和溶解曲线,并对数据进行分析,进而得到M受体奇数受体表达量的变化;其中,所述斑马鱼为成年斑马鱼,进一步优选的,斑马鱼鱼龄为3~6个月;进一步的,提取斑马鱼总RNA的部位为眼部;进一步的,所述斑马鱼M受体奇数受体包括但不限于M1a,M1b,M3a,M3b,M5a,M5b;更进一步的,所述斑马鱼M受体奇数受体为M5b;本发明的第三个方面,提供上述方法在水质的评估与监测中的应用。本发明的有益效果:1)本发明克服了无法直接测定斑马鱼M受体蛋白含量变化的缺陷,提出使用荧光定量PCR技术直接对斑马鱼眼部M受体表达量进行测定,该方法灵敏度高、稳定性好、方便快捷;2)本发明直接对神经内分泌系统中的M受体表达量的变化进行检测,相对于其他评估指标来说可以更快速更准确的评估水质的变化;3)本发明特异性高,从分子方面研究胆碱能系统的内在作用机制入手,结合外在行为表现的研究,最终实现对水质的在线评估监测。附图说明图1为实施例1斑马鱼眼部M5b受体相对表达量的变化图,其中,图1(a)为0.1TU浓度下;图1(b)为10%地表水浓度;图2为生物逐级行为模型。具体实施方式应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。结合具体实例对本发明作进一步的说明,以下实例仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件,通常按照常规条件,或按照销售公司所推荐的条件;在本发明没有特别限定,均可通过商业途径购买得到。如前所述,由于目前尚未找到斑马鱼相应的M受体抗体,无法直接进行斑马鱼M受体蛋白活性的测定,因而影响利用斑马鱼对水质的评估监测。有鉴于此,本发明的一个具体实施方式中,提供一种荧光定量PCR在快速检测斑马鱼M受体奇数受体中的应用。本发明的又一具体实施方式中,所述斑马鱼为成年斑马鱼,优选的,斑马鱼鱼龄为3~6个月;申请人经过研究发现,成年斑马鱼特别是鱼龄在3~6个月,其斑马鱼眼部M受体奇数受体在自然情况下表达稳定;本发明的又一具体实施方式中,所述斑马鱼M受体奇数受体的提取检测部位为眼部;申请人经试验发现,斑马鱼眼部M受体奇数受体特别是M5b受体其基因表达量对污染物非常敏感,即使暴露于微量污染物,其基因表达量也能在短时间内发生显著的变化,从而实现对水质的评估;本发明的又一具体实施方式中,所述斑马鱼M受体奇数受体包括但不限于M1a,M1b,M3a,M3b,M5a,M5b;优选的,所述斑马鱼M受体奇数受体为M5b;本发明的又一具体实施方式中,提供一种荧光定量PCR在快速检测斑马鱼M受体奇数受体的方法,所述方法为:S1.提取斑马鱼总RNA;S2.cDNA克隆:对提取的总RNA进行反转录得cDNA;S3.荧光定量PCR:进行PCR扩增,得到扩增曲线和溶解曲线,并对数据进行分析,进而得到M受体奇数受体表达量的变化;本发明的又一具体实施方式中,所述斑马鱼为成年斑马鱼,优选的,斑马鱼鱼龄为3~6个月;本发明的又一具体实施方式中,提取斑马鱼总RNA的部位为眼部;本发明的又一具体实施方式中,所述斑马鱼M受体奇数受体包括但不限于M1a,M1b,M3a,M3b,M5a,M5b;更进一步的,所述斑马鱼M受体奇数受体为M5b;本发明的又一具体实施方式中,提供上述方法在水质评估与监测中的应用;具体的,所述应用方法为:通过采用荧光定量PCR快速检测斑马鱼M受体奇数受体基因表达变化量,进而对水质情况进行评估与监测。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。需要说明的是,实施例中选用斑马鱼均为5月龄成年斑马鱼。实施例1一、斑马鱼暴露实验1、LC50-48h测定:测定环境中的污染物(以溴氰菊酯为例)对斑马鱼的48h的半数致死浓度,并以该浓度为一个毒性单位(1TU)。参照国标GB/T13267-91的测定方法对LC50-48h进行测量。2、母液配制:配制溴氰菊酯的母液,然后再稀释到相应的浓度进行实验。3、暴露:暴露时设置了10%的地表水浓度和0.1TU两个浓度梯度以及空白对照组,实验中设置三个平行,进行暴露,每隔4小时取样一次。二、组织匀浆获取1、解剖:从不同的时间点中,取出暴露的斑马鱼进行解剖,解剖出斑马鱼的眼部,然后进行研磨,每两条鱼为一个样品。2、将10-20mg组织加裂解液(使用前先检查是否已加入β-巯基乙醇)进行组织研磨。三、总RNA的提取(使用试剂盒进行提取)根据试剂盒里的说明书,按照具体步骤进行总RNA的提取:1、匀浆处理:向匀浆中加入RNase-FreeddH2O和ProteinaseK,混匀后56℃处理10-20min。12,000rpm(~13,400хg)离心2-5min取上清液,加入0.5体积的无水乙醇,混匀后转移到吸附柱,离心30-60sec,弃废液。2、去蛋白和DNA:向吸附柱中加去蛋白液RW1,离心30-60sec,弃废液;配制DNaseⅠ工作液加入吸附柱中,室温放置15min。然后在向吸附柱中加入去蛋白液RW1,离心30-60sec,弃废液。3、漂洗:向吸附柱中加入漂洗液RW(使用前加入乙醇),室温静置2min,离心30-60sec,弃废液,重复该步骤,再离心2min,弃废液,室温静置数分钟,晾干漂洗液。4、获取RNA:将吸附柱转入新的离心管中,向吸附膜悬空滴加50μLRNase-FreeddH2O,室温放置2min,最后离心2min得到RNA溶液。四、RNA质量检测吸取1μL的样品RNA,使用nanodrop对提取的RNA的浓度和质量进行检测。主要是看Conc值和A260/A280的值,选取完整性好的RNA进行反后续实验。五、cDNA第一链合成(使用试剂盒):建立20μL反应体系1、解冻:将模板RNA在冰上解冻,其余的5хgDNABuffer、FQ-RTPrimerMix、10хFastRTBuffer、RNase-FreeddH2O室温解冻即可,使用前先混匀。2、按照表1配制gDNA去除反应体系,混匀后简短离心,在42℃孵育3min,取出放置冰上。表1gDNA去除反应体系组成成分使用量5хgDNABuffer2μLTotalRNA-RNase-FreeddH2O补足到10μL3、按照表2配制反转录反应体系表2反转录反应体系组成成分使用量10хFastRTBuffer2μLRTEnzymeMix1μLFQ-RTPrimerMix2μLRNase-FreeddH2O补足到10μL4、将配制的反转录反应体系加到表1的gDNA去除步骤的反应液中,混匀,42℃孵育15min。95℃孵育3min后放于冰上,将得到的cDNA用于后续的荧光定量PCR或低温保存(-20℃)。六、荧光定量PCR(使用相应的试剂盒)1、配制表3的PCR反应体系,最好在冰上进行。表3RealTimePCR反应体系2、采用两步法进行实验,按照说明书上的步骤进行程序设定。3、盖上反应管,轻柔混匀。4、将反应体系置于荧光定量PCR仪(这里使用的是96实时荧光定量PCR仪)中进行反应。5、将得到的实验结果进行处理分析。溴氰菊酯对斑马鱼眼部的M受体的奇数受体亚型M5b的表达量的影响如图1所示,检测M5b受体的表达量变化的结果表明,不管是在哪种浓度下,在最开始都会出现受体表达量急剧增加的现象,其中10%地表水(2μg/L)增加量多于0.1TU(0.52μg/L),说明此时斑马鱼受到的刺激较大,随后出现相应的下降,但是下降后,在低浓度的0.1TU的暴露下,受体的表达量随着暴露时间的增加而出现适应调整的波动状态,而随着浓度的增加(10%地表水浓度),受体除了刚开始的表达量增加外,过后受体的表达量基本都低于对照,并且表达量波动不大。很明显的发现在10%地表水浓度作用下,起初斑马鱼受到的刺激大于0.1TU浓度,0.5h受体的表达量10%地表水高。这跟生物逐级行为模型(如图2)所描述的规律相符合,所以,通过对斑马鱼眼部的M受体的奇数受体亚型的表达量变化的研究可以实现对水质的快速评估预警。以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。当前第1页1 2 3 
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