一种用于检测高血压用药相关基因的引物组合物及试剂盒的制作方法

文档序号:15457539发布日期:2018-09-15 01:32
本发明属于基因检测
技术领域
,涉及一种用于检测高血压用药相关基因的引物组合物及试剂盒。
背景技术
:利尿剂降压始于1948年,自1957年氯噻嗪(chlorothiazide)问世30多年期间,以氢氯噻嗪(双氢克尿塞,hydrochlorothiazide)为主的噻嗪类利尿剂一直是抗高血压药物的主力军之一,不论单用或与其他抗高血压药物联用,都有明确的疗效。几十年来国际大规模临床试验结果,进一步确定了它在降压治疗中的地位。欧美几个高血压处理原则委员会都建议无并发症的高血压病人,以利尿剂为首选药物。近年来,新型利尿剂吲达帕胺(寿比山,indapmide)的上市,使利尿剂在高血压病的治疗地位又有新的提高,它的特点是常用剂量仅表现为轻微的利尿作用,主要表现为血管扩张作用,降压有效率在80%左右,且不存在传统利尿剂的代谢异常副作用,已在临床广泛应用。心房钠尿肽前体A(natriureticpeptideprecursorA,NPPA)是研究多种疾病遗传易感性的“候选基因”,位于人染色体1p36.22,由三个外显子和2个内含子组成,在体内首先合成含151个氨基酸的前ANP原(prepro-ANP),经过一系列加工得到羧基末端99-126位氨基酸所组成的肽链,即ANP,其中17个氨基酸构成的环是其发挥生物活性的必需结构。心房钠尿肽(ANP)是由心房肌细胞合成和分泌的具有排钠利尿、扩张血管及抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)作用的物质,编码其前体物质(NPPA)基因的第3号外显子上存在T2238C突变,可能通过改变血浆ANP的浓度而影响降压治疗。研究发现,此位点上具有C等位基因的患者服用利尿剂比服用其他种类的降压药疗效更好,且更有利于减少心脑血管疾病的发生。研究发现,NPPAT2238C基因突变型患者对利尿药的反应更为敏感治疗效果好,而非突变患者对使用钙离子拮抗药效果更佳,检测NPPA基因型有利于患者选择适合于自己的抗高血压药物,防止远期副反应的发生。对于TT基因型患者,选择氨氯地平优于其他利尿类以及血管紧张素转化酶抑制剂。β受体阻滞剂是能选择性地与β肾上腺素受体结合、从而拮抗神经递质和儿茶酚胺对β受体的激动作用的一种药物类型。肾上腺素受体分布于大部分交感神经节后纤维所支配的效应器细胞膜上,其受体分为3种类型,可激动引起心率和心肌收缩力增加、支气管扩张、血管舒张、内脏平滑肌松弛和脂肪分解等,这些效应均可被β受体阻滞剂所阻断和拮抗。人类Beta1肾上腺受体(ADRB1)蛋白是Beta1肾上腺受体阻断药的作用靶点,研究发现ADRB1蛋白参与血压调控,是心脏交感神经肾上腺功能系统信号通路中的主要蛋白。Arg389Gly多态性位于细胞内羧基端,能影响配体介导的腺苷酸环化酶活性以及G蛋白偶联功能,从而影响心率和血压。ADRB1基因型的差异可能是ADRB1阻滞剂的降压疗效具有个体差异的原因之一。研究发现,ADRB1基因型为突变杂合子(Gly389Arg)和突变纯合子(Arg389Arg)的患者对Beta1受体阻断药较为敏感,而基因型为野生纯合子(Gly389Gly)对药物不敏感。细胞色素P450(CYP)家族是药物代谢酶中一种重要的酶系,在生物体内的内源性物质和外源性物质的代谢中均发挥重要作用。CYP2D6是CYP酶家族重要的成员之一,虽然它只占肝脏酶总量的2%-9%,却参与20%-30%药物的代谢。CYP2D6的代谢表型可分为超快代谢型(UMs)、快代谢型(EMs)、中等代谢型(IMs)、慢代谢型(PMs)。亚洲人(包括日本、韩国、中国和太平洋岛国人群)含有CYP2D6*10的发生概率为33%-43%,但是在白种人中发生的概率却很低,只有2%-5%。CYP2D6的底物包括原发性高血压治疗药物如普萘洛尔等β受体阻断剂,我国人群中CYP2D6的突变以CYP2D6*10(C100T,P34S)为主,突变率为56.41%,因此我国人群中突变杂合子型为大多数,代谢酶活性正常,野生纯合子型酶活性较高,需加大剂量,而突变纯合子型为慢代谢,需要减量。血管紧张素II受体拮抗剂(AngiotensinIIreceptorantagonists)是一类作用于肾素-血管紧张素系统的药物,主要应用于治疗高血压、糖尿病肾病和充血性心力衰竭。I型血管紧张素II受体(AngiotensinIIreceptortype1,AGTR1)是血管紧张素II(angiotensin,AngII)的受体,主要分布于血管平滑肌细胞上,介导AngII绝大多数生物学作用。它是肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensinsystem,RAS)的组成部分,对高血压的发生及药物治疗具有重要意义。人类AGTR1基因位于3q21-25,仅含1个外显子,无内含子区域。研究发现,AGTR1基因多态性中,T573C,A1166C及A1062G替换的频率最高,A1166C基因型的患者在使用洛沙坦和坎地沙坦时呈现更显著的血压反应。高血压患者对血管紧张素II受体阻断药(如氯沙坦、依贝沙坦、替米沙坦等)的药物敏感性如下:A1166A患者药物敏感性正常,建议使用常规剂量;A1166C患者药物敏感性升高,建议降低剂量;C1166C患者药物敏感性升高,建议降低剂量。细胞色素氧化酶P450(CYP2C9)是人类肝脏中一类重要的药物代谢酶,约占人类肝中CYP酶总量的20%。CYP2C9位于人类染色体10q24.2上,全长约50.71kb,包括9个外显子和8个内含子,编码490个氨基酸残基。CYP2C9等位基因的分布具有明显的人群、种族和地域差异,中国人群中,主要突变型基因为CYP2C9*3,是在第7个外显子第1075位发生A>C突变,造成CYP2C9多肽链上的第359位异亮氨酸突变成亮氨酸(Ile359>Leu359),其等位基因频率为1.0-3.5%。CYP2C9基因具有遗传多态性,目前已发现30多个等位基因。较早发现的突变等位基因为CYP*2-*6,其中CYP*2和*3最为常见同时也是研究得最多的突变。CYP2C9呈基因遗传多态性,导致CYP2C9酶活性在不同个体间存在差异,从而使得药物疗效出现个体差异。洛沙坦、厄贝沙坦等沙坦类是常用的降血压药物,是一类有效的血管紧张素受体拮抗药,它主要由CYP2C9代谢,研究显示,沙坦类药物在体内主要由CYP2C9代谢,多态性CYP2C9*3的突变致使酶活性显著下降,毒性增加,疗效降低。临床研究表明,CYP2C9*3突变可导致洛沙坦降压效果减弱;CYP2C9*3突变可增加缬沙坦和厄贝沙坦的血药浓度,导致缬沙坦和厄贝沙坦降压效果增强。因此,当高血压患者选择沙坦类药物时,应该先对CYP2C9进行基因检测,根据CYP2C9*3的基因型选择沙坦类药物。钙离子拮抗剂是通过阻滞钙通道来降低血压的化学制剂。它可以选择性抑制Ca2+经细胞膜上的钙通道进入细胞内,其通过扩张血管和负性肌力,松弛血管平滑肌,减少末梢血管阻力,从而起到降压作用。细胞色素P450(CytochromeP450,CYP)是一大类药物代谢酶,参与许多药物、生物异源性物质和内源性物质的代谢。CYP3A5主要在成人的肝脏和小肠表达,其表达具有明显的多态性。CYP3A5的基因突变是产生酶活性差异的最主要原因,其中CYP3A5*3在intron3(6959A>G)的突变引起可变剪切,产生了不稳定的蛋白质,从而使得突变性纯合子个体,即其携带基因CYP3A5*3/*3的人不表达CYP3A5。研究显示,钙拮抗剂类药物受CYP3A5*3基因多态性影响较大,含有突变基因型患者,药物毒副作用增加。α1受体阻滞剂能选择性阻断血管平滑肌突触后膜的α1受体,使血管扩张,致外周血管阻力下降及回心血量减少,从而降低收缩压和舒张压。G蛋白是一组可以与三磷酸鸟苷(GTP)结合、具有水解活性的蛋白质,在细胞膜受体和效应蛋白之间的信息传递过程中起中介作用。G蛋白是α肾上腺素受体的下游蛋白,是自主神经系统、肾素血管紧张素系统、内皮素系统等血压调控系统特异受体的耦合蛋白,它影响细胞的钠氢交换,决定血浆肾素活性和血清Na+、K+浓度,参与血压调控。G蛋白在信号传导中起“分子开关”作用。当G蛋白结构、含量、功能异常时,可以放大或缩小神经递质、激素的效应。研究发现GNB3亚单位基因第10外显子内具有一个C825T多态性,825T携带者GNB3基因转录mRNA核酸序列第498-620位碱基缺失,由此生成蛋白变异体,称为GNB3-S。GNB3-S有7个WD(由色氨酸及门冬氨酸组成)重复序列,但第3个WD结构中的后4个氨基酸及第4个WD结构中的前37个氨基酸缺失,最终形成的G蛋白复合体比野生型G蛋白复合体的活性更高,这种多态性加快细胞内信息传递、增高细胞Na+-H+交换活性、使高血压的发生危险及高血压引起的相关器官损伤危险增加。有研究表明,GNB3C825T基因型与α1受体阻滞剂的降压效果存在关联,其中,CC型降压幅度较TC/TT型更大。基因突变检测方法有很多,各国学者对此都进行了大量研究,已经报道的方法包括直接测序法、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、PCR-SSCP/RFLP、ScorpionsARMS、TaqManPCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点,在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法以及ARMS(Amplificationrefractorymutationsystem,扩增阻滞突变系统)法。其中,直接测序法能够发现一些新的未知突变,但检测能力有限,其检测灵敏度约20%左右,而且步骤复杂,整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列步骤,费时费力。ARMS方法是将分子信标(探针)与特异性的ARMS引物相结合创造出来的,ARMS引物3’端设计在突变位点,最后一个碱基与突变碱基配对,釆用无3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶,特异性地识别引物的3’末端,只有引物3’末端完全配对时,才能正常扩增,当引物3’末端发生错配时,不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后,探针两端的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光。然而,现在市场上的类似试剂盒价格昂贵,应用受到限制。技术实现要素:本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种用于检测高血压用药相关基因的引物组合物及试剂盒。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种用于检测高血压用药相关基因的引物组合物,该引物组合物包括NPPA引物组、ADRB1引物组、CYP2D6引物组、AGTR1引物组、CYP2C9引物组、CYP3A5引物组及GNB3引物组;所述的NPPA引物组包括以下引物:NPPA-FW:5’-CTGTGTTCTCTTTGCAGTAGT-3’;NPPA-FS1:5’-TGTGTTCTCTTTGCAGTATC-3’;NPPA-R:5’-GTGAGAAGTGTTGACAGGAA-3’;所述的ADRB1引物组包括以下引物:ADRB1-FW1:5’-CTTCCGCAAGGCCTTCCAAC-3’;ADRB1-FS1:5’-ACTTCCGCAAGGCCTTCCATG-3’;ADRB1-R:5’-TGGCCCCGACGACATCGTCG-3’;所述的CYP2D6引物组包括以下引物:CYP2D6-FW1:5’-ACGCTGGGCTGCACGCTAAC-3’;CYP2D6-FS1:5’-AACGCTGGGCTGCACGCTAGT-3’;CYP2D6-R:5’-ACCCACCACCCATGTTTG-3’;所述的AGTR1引物组包括以下引物:AGTR1-FW1:5’-CACTTCACTACCAAATGACCA-3’;AGTR1-FS1:5’-CACTTCACTACCAAATGATCC-3’;AGTR1-R:5’-TCTCAAATCAACACATTCATCG-3’;所述的CYP2C9引物组包括以下引物:CYP2C9-FW1:5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGA-3’;CYP2C9-FS1:5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGC-3’;CYP2C9-R:5’-CGGTGATGGTAGAGGTTTAA-3’;所述的CYP3A5引物组包括以下引物:CYP3A5-FW1:5’-AGAGCTCTTTTGTCTTTCTA-3’;CYP3A5-FS1:5’-AAGAGCTCTTTTGTCTTTCGG-3’;CYP3A5-R:5’-ATGTAATCCATACCCCTA-3’;所述的GNB3引物组包括以下引物:P1-FW1:5’-CATCTGCGGCATCACGTAC-3’;P1-FS1:5’-CATCTGCGGCATCACGTAT-3’;P1-R:5’-ACCCAGTGACAAGGGACAGC-3’。进一步地,该引物组合物还包括内控引物组,该内控引物组包括以下引物:CF:5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3’;CR:5’-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3’。一种所述的引物组合物在制备高血压用药相关基因的基因多态性检测试剂中的应用。一种用于检测高血压用药相关基因的试剂盒,该试剂盒包括所述的引物组合物。进一步地,该试剂盒还包括PCR反应液,该PCR反应液包括PCR缓冲液、Taq酶、MgCl2、dNTPs及SYBRGreenI染料。所述的PCR缓冲液为Tris-HCl缓冲液、Tris-乙酸(TAE)缓冲液或Tris-硼酸(TBE)缓冲液。作为优选的技术方案,该PCR反应液包括3’→5’外切酶活性高保真Taq酶(酶活力为2.5U)、1.0-5.0mMMgCl2、4.0-20.0mMdNTPs(包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP各1.0-5.0mM)及SYBRGreenI染料。进一步地,该试剂盒还包括阳性对照液及阴性对照液。作为优选的技术方案,所述的阳性对照液为含有试剂盒内可检测的7个位点对应的质粒混合液,质粒混合液中含有7种不同的带有待检测突变位点的NPPA、ADRB1、CYP2D6、AGTR1、CYP2C9、CYP3A5和GNB3等位基因,质粒混合液中的质粒浓度为1000copies/μl;所述的阴性对照液为Tris-HCL缓冲液,该Tris-HCL缓冲液的浓度为7-13mM,pH为7.5-8.5。一种高血压用药相关基因(NPPA、ADRB1、CYP2D6、AGTR1、CYP2C9、CYP3A5和GNB3)的基因多态性检测方法,包括以下步骤:1)待测样品的处理和模板的提取;2)利用所述的引物组合物配制荧光定量PCR反应体系;3)釆用ARMS法,利用各引物区分野生型和突变型基因序列,通过SYBRGreenI染料和扩增产物的杂交,检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。SYBR为检测信号,以SYBR信号达到设定的阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准,Ct值小于32为阳性,Ct值大于35为阴性,Ct值介于32到35之间为弱阳性。作为优选的技术方案,步骤1)所述的待测样品包括全血、血浆、血清或胸腔积液。作为优选的技术方案,步骤2)中所述的PCR反应体系中,各组分的含量如下:其中,引物组合物中各引物的浓度均为300nM。本发明高血压用药相关基因的基因多态性检测试剂盒采用SYBR染料法,建立了针对人类相关基因(NPPA、ADRB1、CYP2D6、AGTR1、CYP2C9、CYP3A5和GNB3)的基因多态性(如表1所示)的多重实时PCR检测方法。本发明经过大量试验,研究和分析成功筛选出能够用于快速、灵敏、有效地检测NPPA、ADRB1、CYP2D6、AGTR1、CYP2C9、CYP3A5和GNB3基因多态性的引物组合物,并利用这些引物开发出用于检测高血压用药相关基因多态性的方法和试剂盒。表1高血压用药相关基因的基因多态性形式高血压用药相关基因的特异性引物见下表2-8,表9为内参的检测引物。表2NPPA(2238)基因多态性的检测引物表3ADRB1(389)基因多态性的检测引物表4CYP2D6(100)基因多态性的检测引物表5AGTR1(1166)基因多态性的检测引物表6CYP2C9(1075)基因多态性的检测引物表7CYP3A5(6959)基因多态性的检测引物表8GNB3(825)基因多态性的检测引物表9内参的检测引物本发明中,根据各基因的碱基突变形式,利用ARMS-PCR方法,设计出与野生型和突变型基因片段相适配的引物,并采用常规引物合成方法合成出这些引物,用于对相关基因的基因多态性进行检测。ARMS-PCR方法的基本原理为:如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补,则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸,因此根据已知点突变设计相应的引物,其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补,从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下,SYBRGreenI发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合后,荧光大大增强。因此,SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。与现有技术相比,本发明具有以下特点:1)釆用ARMS技术与SYBR染料相结合的方法,得到一种能够快速、敏感而且简便地检测高血压用药相关基因(NPPA、ADRB1、CYP2D6、AGTR1、CYP2C9、CYP3A5和GNB3)基因多态性的试剂盒,该试剂盒包括特异性ARMS检测引物、内控引物及PCR反应液,通过设计ARMS检测引物并将Scorpions探针替换为SYBR染料,以使检测成本大大降低,更适合中国患者NPPA、ADRB1、CYP2D6、AGTR1、CYP2C9、CYP3A5和GNB3基因多态性的检测,具有检测快速、灵敏度高、特异性强、方法简单、结果准确的优势,适于推广应用;2)试剂盒可在50ng野生型基因组DNA背景下准确检出1%的突变DNA,且针对性设计不同突变位点的特异性引物,使用荧光定量PCR进行检测,检测过程均为闭管反应,大大降低污染。附图说明图1为本发明基因多态性检测试剂盒检测NPPA(2238)样品的扩增曲线图;图2为本发明基因多态性检测试剂盒检测ADRB1(389)样品的扩增曲线图;图3为本发明基因多态性检测试剂盒检测CYP2D6(100)样品的扩增曲线图;图4为本发明基因多态性检测试剂盒检测AGTR1(1166)样品的扩增曲线图;图5为本发明基因多态性检测试剂盒检测CYP2C9(1075)样品的扩增曲线图;图6为本发明基因多态性检测试剂盒检测CYP3A5(6959)样品的扩增曲线图;图7为本发明基因多态性检测试剂盒检测GNB3(825)样品的扩增曲线图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程。本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本
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技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本
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的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。实施例1:1、样本处理和核酸提取:利用商品化的DNA提取试剂盒处理样本,具体操作参见试剂盒说明书,所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度,其DNAOD260/OD280的值应在1.8~2.0,浓度应在5~50ng/μL之间,样本DNA质量不合格者不得用于检测,低于5ng/μL者重新进行核酸提取,高于50ng/μL者予以适当稀释至规定的浓度范围,提取完的DNA应立即进行检测,否则于-20℃以下保存,保存时间不能超过6个月。试剂盒质控品使用前室温融化,涡旋振荡10秒,2000rpm离心15秒待用。2、试剂配制:2.1配制说明:检测反应设置内控检测、阴性质控品检测和阳性质控品检测。2.2配制过程:提前30分钟将试剂取出,室温融化,涡旋振荡10秒,2000rpm离心15秒待用。确定每个检测位点反应数N和内控检测数M,N=待检样本数(n)+质控品数(2)+1;M=待检样本数(n)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量,计算如下表10:表10PCR反应体系配制表取15个灭菌离心管配制上述15个反应体系,试剂全部加入后涡旋振荡10秒,2000rpm离心15秒。然后将上述混合液18μL/管分装至PCR反应管中(无菌和RNase-Free)。3、加样:表11样品及质控品上样表名称成分加样量待检样本样本DNA2μL内控质控品2μL根据表11所示的上样比例,将已处理样本、质控品加入反应管中,盖紧管盖(避免气泡产生),2000rpm离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底,然后立即进行PCR扩增反应。4、PCR扩增程序设置:表12PCR反应程序的设定5、检验结果的解读:利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列,通过SYBRGreen染料和扩增产物的杂交,检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。检测各样品的扩增曲线图如图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7所示。SYBR为检测信号,以SYBR信号达到设定的阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准,Ct值小于32为阳性,Ct值大于35为阴性,Ct值介于32到35之间为弱阳性。实施例2:一种用于检测高血压用药相关基因的引物组合物包括NPPA引物组、ADRB1引物组、CYP2D6引物组、AGTR1引物组、CYP2C9引物组、CYP3A5引物组及GNB3引物组;NPPA引物组包括以下引物:NPPA-FW:5’-CTGTGTTCTCTTTGCAGTAGT-3’;NPPA-FS1:5’-TGTGTTCTCTTTGCAGTATC-3’;NPPA-R:5’-GTGAGAAGTGTTGACAGGAA-3’;ADRB1引物组包括以下引物:ADRB1-FW1:5’-CTTCCGCAAGGCCTTCCAAC-3’;ADRB1-FS1:5’-ACTTCCGCAAGGCCTTCCATG-3’;ADRB1-R:5’-TGGCCCCGACGACATCGTCG-3’;CYP2D6引物组包括以下引物:CYP2D6-FW1:5’-ACGCTGGGCTGCACGCTAAC-3’;CYP2D6-FS1:5’-AACGCTGGGCTGCACGCTAGT-3’;CYP2D6-R:5’-ACCCACCACCCATGTTTG-3’;AGTR1引物组包括以下引物:AGTR1-FW1:5’-CACTTCACTACCAAATGACCA-3’;AGTR1-FS1:5’-CACTTCACTACCAAATGATCC-3’;AGTR1-R:5’-TCTCAAATCAACACATTCATCG-3’;CYP2C9引物组包括以下引物:CYP2C9-FW1:5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGA-3’;CYP2C9-FS1:5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGC-3’;CYP2C9-R:5’-CGGTGATGGTAGAGGTTTAA-3’;CYP3A5引物组包括以下引物:CYP3A5-FW1:5’-AGAGCTCTTTTGTCTTTCTA-3’;CYP3A5-FS1:5’-AAGAGCTCTTTTGTCTTTCGG-3’;CYP3A5-R:5’-ATGTAATCCATACCCCTA-3’;GNB3引物组包括以下引物:P1-FW1:5’-CATCTGCGGCATCACGTAC-3’;P1-FS1:5’-CATCTGCGGCATCACGTAT-3’;P1-R:5’-ACCCAGTGACAAGGGACAGC-3’。上述引物组合物应用在制备高血压用药相关基因的基因多态性检测试剂中。一种用于检测高血压用药相关基因的试剂盒包括上述引物组合物及PCR反应液,该PCR反应液包括PCR缓冲液、Taq酶、MgCl2、dNTPs及SYBRGreenI染料。实施例3:一种用于检测高血压用药相关基因的引物组合物包括NPPA引物组、ADRB1引物组、CYP2D6引物组、AGTR1引物组、CYP2C9引物组、CYP3A5引物组及GNB3引物组;NPPA引物组包括以下引物:NPPA-FW:5’-CTGTGTTCTCTTTGCAGTAGT-3’;NPPA-FS1:5’-TGTGTTCTCTTTGCAGTATC-3’;NPPA-R:5’-GTGAGAAGTGTTGACAGGAA-3’;ADRB1引物组包括以下引物:ADRB1-FW1:5’-CTTCCGCAAGGCCTTCCAAC-3’;ADRB1-FS1:5’-ACTTCCGCAAGGCCTTCCATG-3’;ADRB1-R:5’-TGGCCCCGACGACATCGTCG-3’;CYP2D6引物组包括以下引物:CYP2D6-FW1:5’-ACGCTGGGCTGCACGCTAAC-3’;CYP2D6-FS1:5’-AACGCTGGGCTGCACGCTAGT-3’;CYP2D6-R:5’-ACCCACCACCCATGTTTG-3’;AGTR1引物组包括以下引物:AGTR1-FW1:5’-CACTTCACTACCAAATGACCA-3’;AGTR1-FS1:5’-CACTTCACTACCAAATGATCC-3’;AGTR1-R:5’-TCTCAAATCAACACATTCATCG-3’;CYP2C9引物组包括以下引物:CYP2C9-FW1:5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGA-3’;CYP2C9-FS1:5’-GCACGAGGTCCAGAGATAGC-3’;CYP2C9-R:5’-CGGTGATGGTAGAGGTTTAA-3’;CYP3A5引物组包括以下引物:CYP3A5-FW1:5’-AGAGCTCTTTTGTCTTTCTA-3’;CYP3A5-FS1:5’-AAGAGCTCTTTTGTCTTTCGG-3’;CYP3A5-R:5’-ATGTAATCCATACCCCTA-3’;GNB3引物组包括以下引物:P1-FW1:5’-CATCTGCGGCATCACGTAC-3’;P1-FS1:5’-CATCTGCGGCATCACGTAT-3’;P1-R:5’-ACCCAGTGACAAGGGACAGC-3’。该引物组合物还包括内控引物组,该内控引物组包括以下引物:CF:5’-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3’;CR:5’-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3’。上述引物组合物应用在制备高血压用药相关基因的基因多态性检测试剂中。一种用于检测高血压用药相关基因的试剂盒包括上述引物组合物及PCR反应液,该PCR反应液包括PCR缓冲液、Taq酶、MgCl2、dNTPs及SYBRGreenI染料。试剂盒还包括阳性对照液及阴性对照液。上述的对实施例的描述是为便于该
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的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3 
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