一种检测致泻病原微生物的方法与流程

文档序号:15457614发布日期:2018-09-15 01:34
本发明涉及病原微生物检测
技术领域
,具体而言,涉及一种检测致泻病原微生物的方法。
背景技术
:腹泻是一种发病率高并流行于世界各地的胃肠道传染病,其发病率仅次于上呼吸道感,病原菌造成的腹泻是我国的常见病和多发病,病因比较复杂,尤其对婴幼儿人群危害更大,因此亟需建立腹泻病原菌的快速高效的诊断方法。常见的腹泻病原菌有以下几种。霍乱是由O1霍乱弧菌Vibriocholerae或O139霍乱弧菌Vibriocholerae引起的一种肠道传染病,是发展中国家的一个主要公共卫生问题。每年估计有300万-500万霍乱病例。沙门氏菌Salmonellaenterica是引起全球性食源性感染最严重的致病菌之一(FAO/WHO2009),可引起恶心、呕吐、腹泻等,严重时可导致感染者产生败血症,甚至死亡。自1982年首次在美国发现后,先后在英国、加拿大、德国等世界范围内相继爆发。在欧洲,超过2500个沙门氏菌血清型中,肠炎沙门氏菌占主要地位,引起超过60%的感染病例。在中国,70%~80%细菌性食物中毒都由沙门氏菌引起。副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus是一种广泛分布于近岸海水、海底沉积物和海产品中的嗜盐性细菌,也是引起我国特别是沿海地区细菌性食物中毒危害的首要食源性致病菌。痢疾菌Shigella是最常见的肠杆菌科的病原菌,可引起人类肠道传染病。空肠弯曲杆菌Campylobacterjejuni是弯曲菌属胎儿弯曲菌种的亚种之一。其引起人类肠炎和腹泻的事件在世界各地都有报导,并作为“人类一种新的疾病”被引起注意。在发达国家,空肠弯曲菌是次于轮状病毒引起儿童结肠炎的病原。腺病毒40/41型(Adenovirus)、星状病毒(Astrovirus)、诺如病毒GI型(NovirusGI)、诺如病毒GII型(NovirusGII)、轮状病毒(RotavirusA)、札如病毒(Sapovirus),均能引起腹泻。在我国及发达国家由细菌和病毒引起的食品中毒事件均占较大比例。现阶段这些造成腹泻的病原微生物的检测基本都是采用分子生物学的方法进行,例如荧光定量PCR方法、基因芯片技术等。荧光定量PCR方法是主流检测方法,但该方法存在检测通量低,操作要求高等缺点。同时基于核酸水平的基因芯片技术也被广泛应用于致病性细菌的检测,但是基因芯片技术目前绝大多数还处于实验室阶段,更多的用于基础性研究而不能平民化应用。且目前基因芯片法一般采用玻璃片作为固相支持物,实验过程需要相应的点样仪和芯片识读仪,成本较高。因此研发一种快速、方便、灵敏度高、价格低廉、可视化和高通量的检测方法将具有非常好的应用前景及市场推广能力。鉴于此,特提出本发明。技术实现要素:本发明的目的在于提供一种检测致泻病原微生物的核酸组合,该核酸组合可以检测出样本中致泻病原微生物(例如沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型),具有特异性好、灵敏度高等特点,其可以用于普通PCR技术、RT-PCR技术、膜芯片杂交技术等平台,具有广阔的应用前景。本发明的另一目的在于提供一种致泻病原微生物的检测试剂盒,该检测试剂盒含有上述的核酸组合,该检测试剂盒可直接用于检测出样本的致泻病原微生物(例如沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型),具有特异性好、灵敏度高、使用方便等特点。本发明的再一目的在于提供一种检测致泻病原微生物的方法,该检测方法使用上述的核酸组合对样本中的致泻病原微生物(例如沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型)进行检测,具有特异性好、灵敏度高、操作方便、结果准确、易于观察等特点。本发明是这样实现的:一方面,本发明提供的一种检测致泻病原微生物的核酸组合,其包括:其包括如下引物对中的一种或多种的组合:用于检测沙门氏菌invA基因且包括SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物的第一引物对;用于检测沙门氏菌ttr基因且包括SEQIDNO.3所示的上游引物和SEQIDNO.4所示的下游引物的第二引物对;用于检测痢疾菌ipaH基因且包括SEQIDNO.5所示的上游引物和SEQIDNO.6所示的下游引物的第三引物对;用于检测霍乱弧菌ompW基因且包括SEQIDNO.7所示的上游引物和SEQIDNO.8所示的下游引物的第四引物对;用于检测霍乱弧菌ctxAB基因且包括SEQIDNO.9所示的上游引物和SEQIDNO.10所示的下游引物的第五引物对;用于检测副溶血性弧菌toxR基因且包括SEQIDNO.11所示的上游引物和SEQIDNO.12所示的下游引物的第六引物对;用于检测副溶血性弧菌tdh基因且包括SEQIDNO.13所示的上游引物和SEQIDNO.14所示的下游引物的第七引物对;用于检测副溶血性弧菌trh基因且包括SEQIDNO.15所示的上游引物和SEQIDNO.16所示的下游引物的第八引物对;用于检测空肠弯曲菌hipO基因且包括SEQIDNO.17所示的上游引物和SEQIDNO.18所示的下游引物的第九引物对;用于检测腺病毒且包括SEQIDNO.19所示的上游引物和SEQIDNO.20所示的下游引物的第十引物对;用于检测札如病毒且包括SEQIDNO.23所示的上游引物和SEQIDNO.24所示的下游引物的第十一引物对;用于检测星状病毒且包括SEQIDNO.25所示的上游引物和SEQIDNO.26所示的下游引物的第十二引物对;用于检测轮状病毒且包括SEQIDNO.27所示的上游引物和SEQIDNO.28所示的下游引物的第十三引物对;用于检测诺如病毒GI型且包括SEQIDNO.29所示的上游引物和SEQIDNO.30所示的下游引物的第十四引物对;以及,用于检测诺如病毒GII型且包括SEQIDNO.31所示的上游引物和SEQIDNO.32所示的下游引物的第十五引物对。在都以DNA为模板的前提下,上述15种引物对可同时在同一体系中进行多重PCR,避免非特异性扩增,具有较高的特异性和灵敏度,此外,在多重PCR的基础上使用上述的核酸组合还可同时进行非对称PCR扩增(AsymmetricPCR),用以提高检测灵敏度。非对称PCR扩增技术是指在PCR扩增过程中采用不等量的上游引物和下游引物(或是扩增延伸条件不同的上游引物和下游引物),PCR扩增后产生大量的单链DNA,该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的对应的探针杂交,从而提高检测灵敏度。当然,在实际的检测过程中,由于札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型和诺如病毒GII型等,其遗传物质为RNA,需要将其反转成DNA后才能进行PCR。基于此,可将第一引物对至第十引物对对来自样本的总核酸(含DNA和RNA)模板进行多重普通PCR扩增,然后用第十一引物对至第十五引物对对来自样本的总核酸(含DNA和RNA)模板采用一步法进行多重RT-PCR扩增,然后将两次扩增的产物混合(也可以不混合,单独进行)后与相应的探针杂交检测出相应的致泻病原微生物。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述核酸组合还包括碱基序列如SEQIDNO.35-49所示的探针中的一种或多种。其中,SEQIDNO.35所示的沙门氏菌invA基因探针可与第一引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.36所示的沙门氏菌ttr基因探针可与第二引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.37所示的沙门氏菌invA基因探针可与第三引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.38所示的霍乱弧菌ompW基因探针可与第四引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.39所示的霍乱弧菌ctxAB基因探针可与第五引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.40所示的副溶血性弧菌toxR基因探针可与第六引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.41所示的副溶血性弧菌trh基因探针可与第七引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.42所示的副溶血性弧菌tdh基因探针可与第八引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.43所示的空肠弯曲菌hipO基因探针可与第九引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.44所示的腺病毒探针可与第十引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.45所示的札如病毒探针:可与第十一引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.46所示的星状病毒探针可与第十二引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.47所示的轮状病毒探针可与第十三引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.48所示的诺如病毒GI型探针可与第十四引物对的扩增产物结合;SEQIDNO.49所示的诺如病毒GII型探针可与第十五引物对的扩增产物结合。上述15种引物对的扩增产物通过碱基互补原则对应地与固定在膜芯片上的探针杂交,经显色处理后,可显示出相应颜色,进而使得检测结果可视化,提高检测的便捷性。本发明设计的引物和探针可以避免扩增产物与探针间的交叉结合,具有较好的特异性。使用探针检测时,可先将探针固定在膜芯片上,当然固定的方式可根据实际情况选择,例如通过对探针的5’端的氨基修饰,可以使得在制备膜芯片时,探针更容易或更稳定地结合在膜芯片上,提高其稳定性,防止探针脱落,避免出现假阴性结果。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述核酸组合还包括内参引物对,所述内参引物对中的上游引物的碱基序列如SEQIDNO.21所示,所述内参引物对中的下游引物的碱基序列如SEQIDNO.22所示。内参引物对可对内参基因的检测,可以使得检测结果可靠准确。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述核酸组合还包括内参探针,所述内参探针的碱基序列如SEQIDNO.50所示。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述核酸组合还包括外参引物对,所述外参引物对中的上游引物的碱基序列如SEQIDNO.33所示,所述外参引物对中的下游引物的碱基序列如SEQIDNO.34所示。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述核酸组合还包括外参探针,所述外参探针的碱基序列如SEQIDNO.51所示。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述核酸组合还包括阳性对照探针,所述阳性对照探针的碱基序列如SEQIDNO.52所示。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述核酸组合还包括用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子,所述阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQIDNO.54所示。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述核酸组合还包括阴性对照探针,所述阴性对照探针的碱基序列如SEQIDNO.53所示。阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性探针结合,而不与阴性探针结合。因此,在膜芯片上的阳性探针位置有斑点而阴性探针位置没有斑点说明杂交结果可靠,检测结果更可信。另一方面,本发明提供的如上所述的核酸组合在制备检测致泻病原微生物的试剂盒中的应用,所述致泻病原微生物选自沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型中一种或多种的组合。再一方面,本发明提供的一种致泻病原微生物的检测试剂盒,其包括核酸组合,该核酸组合包括如上所述的第一引物对至第十五引物对中的一种或多种的组合。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述试剂盒还包括膜芯片,所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQIDNO.35-49所示的探针中的一种或多种。上述15种引物对的扩增产物通过碱基互补原则对应地与固定在膜芯片上的探针杂交,经显色处理后,可显示出相应颜色,进而使得检测结果可视化,提高检测的便捷性。本发明设计的引物和探针可以避免扩增产物与探针间的交叉结合,具有较好的特异性。需要说明的是,探针在膜芯片上固定位置相互独立,即一个杂交区域仅固定一种探针。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述膜芯片上还固定有如下探针中的一种或几种:内参探针、外参探针、阳性对照探针以及阴性对照探针;所述内参探针碱基序列如SEQIDNO.50所示,所述外参探针的碱基序列如SEQIDNO.51所示,所述阳性对照探针的碱基序列如SEQIDNO.52所示,所述阴性对照探针的碱基序列如SEQIDNO.53所示。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述核酸组合还包括如下内参引物对、外参引物对和用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子中的一种或几种的组合;所述内参引物对中的上游引物的碱基序列如SEQIDNO.21所示,所述内参引物对中的下游引物的碱基序列如SEQIDNO.22所示;所述外参引物对中的上游引物的碱基序列如SEQIDNO.33所示,所述外参引物对中的下游引物的碱基序列如SEQIDNO.34所示;所述阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQIDNO.54所示。阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性探针结合,而不与阴性探针结合。因此,在膜芯片上的阳性探针位置有斑点而阴性探针位置没有斑点说明杂交结果可靠,检测结果更可信。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述阳性寡核苷酸单链DNA分子的5’端标记有生物素。进一步地,在本发明的一些实施方案中,每个引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种标记物。对上游引物的5’端或下游引物的5’端标记地高辛、异硫氰酸荧光素或生物素,可使得其扩增产物在于探针结合,通过其标记物与带有相应结合标记物的催化酶相结合,通过催化酶催化底物显色,实现可视化的检出效果。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括如下组分中的一种或多种:PCR缓冲液、RT-PCR缓冲液、去活化液、去活化清洗液、杂交液、杂交清洗液、酶孵育液、孵育清洗液1、孵育清洗液2以及显色液,其中,所述酶孵育液含用于催化底物显色的催化酶,所述显色液含有所述催化酶的所述底物,所述催化酶标记有地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体或链霉亲和素,所述催化酶上的标记物具有与上游引物或下游引物的标记物结合的能力。进一步地,在本发明的一些实施方案中,膜芯片可以是硝酸纤维素膜或尼龙膜,或者是聚丙烯膜,或者是硅片等能够起到固相支撑的作用的物质。较佳地,膜芯片为硝酸纤维素膜。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述催化酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶;当催化酶为辣根过氧化物酶时,底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和OPD(o-Phenylenediamine、邻苯二胺)中的任一种。TMB、ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物,在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应,使得检测结果可视化。当催化酶为碱性磷酸酶时,底物是对BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)和NBT(NitrotetrazoliμMBluechloride、四唑硝基蓝)的组合物、硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任一种。当上述催化酶为葡萄糖氧化酶时,上述底物是葡萄糖。葡萄糖经葡萄糖氧化酶(GOD)氧化,产生葡萄糖酸和过氧化氢,后者可通过辣根过氧化物酶-TMB显色系统进行检测。再一方面,本发明提供的一种检测致泻病原微生物的方法,其包括:以来自待测样本的总核酸提取物为模板,用如上所述的第一引物对至第十引物对中的一种或几种引物对的组合进行普通PCR扩增,用如上所述的第十一引物对至第第十五引物对中的一种或几种引物对的组合进行RT-PCR扩增;各引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于与催化酶结合的第一亲和物。采用两次扩增的目的在于:如果待测样本中的致泻病原微生物(例如自沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒)是以DNA为遗传物质,则通过普通PCR扩增实现检出目的,如果待测样本中的致泻病原微生物(例如札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型)是以RNA为遗传物质,则通过RT-PCR扩增实现检出目的。无论是何种类型的致泻病原微生物,采用上述的检出方法,均可以实现检出效果。进一步地,在本发明的一些实施方案中,在普通PCR扩增或者是RT-PCR扩增的反应体系中,各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比大于1,或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比大于1。进一步地,在本发明的一些实施方案中,在普通PCR扩增或者是RT-PCR扩增的反应体系中,各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比为1.1-1.5,或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比为1.1-1.5。在扩增反应体系中,通过控制上游引物与下游引物的摩尔比不为1,可以在进行多重PCR的同时,实现非对称PCR扩增,扩增后产生大量的单链DNA,该单链DNA相较于双链DNA可以有效的和固定在膜芯片上的对应的探针杂交结合,实现检出目的,提高检测灵敏度。进一步地,在本发明的一些实施方案中,在PCR扩增反应之后,所述方法还包括:杂交步骤;所述杂交步骤包括:将由普通PCR扩增反应得到的反应产物和由RT-PCR扩增反应的反应产物混合后与膜芯片反应,进行杂交处理;其中,所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQIDNO.35-49所示的探针中的一种或多种。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述杂交处理的条件包括:温度为44-46℃、转速为80-100rpm以及时间为40-50min。进一步地,在本发明的一些实施方案中,在进行杂交处理之前,所述杂交步骤还包括去活化处理;所述去活化处理包括:用去活化液对所述膜芯片进行孵育,36-38℃孵育8-10min;然后用去活化清洗液对所述膜芯片进行孵育,58-62℃孵育4-6min。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述去活化液为:NaOH溶液;所述去活化液为:90-110mmol/L的NaOH溶液;优选的,所述去活化清洗液为:含0.8%-0.12%SDS的SSPE缓冲液。进一步地,在本发明的一些实施方案中,在进行杂交处理之后,所述杂交步骤还包括酶孵育处理;所述酶孵育处理包括:将含有所述催化酶的酶孵育液与所述膜芯片接触,在温度为40-44℃、转速为80-100rpm条件下震荡孵育28-32min;所述催化酶标记有用于与所述第一亲和物特异性结合的第二亲和物。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述第一亲和物选自地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种;所述第二亲和物选自地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体和链霉亲和素;优选的,所述催化酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任意一种。进一步地,在本发明的一些实施方案中,在进行酶孵育处理之后,所述杂交步骤还包括显色处理;所述显色处理包括:将显色液与所述膜芯片接触,静置5-20min;其中,所述显色液含有所述催化酶的底物。综上,本发明提供检测致泻病原微生物的核酸组合、试剂盒以及检测方法是基于反向斑点杂交的可视化膜芯片技术进行多种致泻病原微生物检测,其工作原理是首先将针对各种致泻病原微生物的特异性序列的单链探针按顺序排列固定于膜芯片表面的特定区域,再将由引物对扩增的多重PCR产物与其杂交,这样PCR产物中的特异性序列单链DNA就会和膜芯片上的探针杂交,经洗涤去除未结合的DNA样品,利用待测PCR产物的DNA上带有的标记物例如生物素,结合了待测DNA的探针点就偶联上了生物素标记物,再经过相应的显色反应就能读取对应的杂交信号,这样一张膜芯片上就可以同时检测多种致泻病原微生物。本发明的探针为寡核苷酸探针,其顺序排列于膜芯片表面的特殊区域,形成低密度探针阵列。膜芯片同待测样本杂交后经底物显色可形成肉眼可视化的检测结果。总之,采用本发明提供的核酸组合、试剂盒和检测方法,可以实现对多种致泻病原微生物例如沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型的可视化检测,具有特异性和灵敏度高,操作方便、检测快速、结果可靠等特点。可以满足对特异性好、灵敏度高、结果可靠的致泻病原微生物检测的需求,具有非常好的应用前景及市场推广潜能。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实施例1中的膜芯片上各探针的固定位置模式图;图2为本发明实施例3中的对沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌的检测结果;图3为本发明实施例3中的对札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型和诺如病毒GII型的检测结果;图4为本发明实施例4中的对腹泻病人呕吐物样本检测的结果;图5为本发明实施例5中的腹泻病人粪便样本检测的检测结果。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供了一种致泻病原微生物的检测试剂盒,其包括核酸组合以及膜芯片。该核酸组合包括阳性寡核苷酸单链DNA和如下引物对,其中,每对引物对中的下游引物的5’端标记有生物素(biotin):用于检测沙门氏菌invA基因的第一引物对,其包括:上游引物:CTCAGACATGCCACGGTACAAC(SEQIDNO.1),下游引物:biotin-GCTCCACGAATATGCTCCACA(SEQIDNO.2);用于检测沙门氏菌ttr基因的第二引物对,其包括:上游引物:GCAACTGGCGGGAGAAAGCGGTCTT(SEQIDNO.3),下游引物:biotin-GATCGCCGCCTTCCACGAC(SEQIDNO.4);用于检测痢疾菌ipaH基因的第三引物对,其包括:上游引物:CCGGGATAAAGTCAGAACTCTC(SEQIDNO.5),下游引物:biotin-TCATTTGCTGTCACTCCCGA(SEQIDNO.6);用于检测霍乱弧菌ompW基因的第四引物对,其包括:上游引物:GTGCGGATAACCATTTAGTC(SEQIDNO.7),下游引物:biotin-GAGAAATGAATGTCACCATGA(SEQIDNO.8);用于检测霍乱弧菌ctxAB基因的第五引物对,其包括:上游引物:CCTTGACGAATACCAATCTA(SEQIDNO.9),下游引物:biotin-GTATTCTGCACACAAATCAG(SEQIDNO.10);用于检测副溶血性弧菌toxR基因的第六引物对,其包括:上游引物:TTTGGCACTATTACTACCGAT(SEQIDNO.11),下游引物:biotin-ATACTCACCAATCTGACGGAA(SEQIDNO.12);用于检测副溶血性弧菌tdh基因的第七引物对,其包括:上游引物:GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC(SEQIDNO.13),下游引物:biotin-TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC(SEQIDNO.14);用于检测副溶血性弧菌trh基因的第八引物对,其包括:上游引物:TTGGTTTCAATATTTTCAATATCT(SEQIDNO.15),下游引物:biotin-CATAACAAACATATGTCCATTGCCG(SEQIDNO.16);用于检测空肠弯曲菌hipO基因的第九引物对,其包括:上游引物:GTGCTAAGGCAATGATAGAAGATGG(SEQIDNO.17),下游引物:biotin-CTTTGTAAAGCCACAATAAGCAAAGA(SEQIDNO.18);用于检测腺病毒的第十引物对,其包括:上游引物:CACGGTGGGGTTTCTAAACTT(SEQIDNO.19),下游引物:biotin-GCCCCAGTGGTCTTACATGCACA(SEQIDNO.20);内参引物对,其包括:上游引物:TGCGGTTGGATCACCTCCT(SEQIDNO.21);下游引物:biotin-TCCCCACCTTCCAGTT(SEQIDNO.22);用于检测札如病毒的第十一引物对,其包括:上游引物:GAYCASGCTCTCGCYACCTAC(SEQIDNO.23),下游引物:biotin-CCCTCCATYTCAAACACTA(SEQIDNO.24);用于检测星状病毒的第十二引物对,其包括:上游引物:AAGCAGGTAACTGTTGAGGTC(SEQIDNO.25),下游引物:biotin-GGTTTTGGTCCTGTGACAC(SEQIDNO.26);用于检测轮状病毒的第十三引物对,其包括:上游引物:ACCATCTACACATGACCCTC(SEQIDNO.27),下游引物:biotin-GGTCACATAACGCCCC(SEQIDNO.28);用于检测诺如病毒GI型的第十四引物对,其包括:上游引物:CGCTGGATGCGNTTCCAT(SEQIDNO.29),下游引物::biotin-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC(SEQIDNO.30);用于检测诺如病毒GII型的第十五引物对,其包括:上游引物:ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA(SEQIDNO.31),下游引物:biotin-TCGACGCCATCTTCATTCACA(SEQIDNO.32);外参引物对,其包括:上游引物:GCGGGTCCTGCCGAAAGT(SEQIDNO.33);下游引物:biotin-GAAGTAACATATAGACAGACGCACAC(SEQIDNO.34)。另外,阳性寡核苷酸单链DNA碱基序列如下:biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC(SEQIDNO.54)。需要说明的是,在其他的实施例中,核酸组合可以包括第一至第十五引物对中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种或15种,其均可以根据检测需求进行选择,其均属于本发明的保护范围。本实例针对这三种致泻菌(沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌)提供两种或两种以上的检测引物对,可以对相应病原菌的两个基因或两个以上的基因位点检测,有利于提高检测结果的准确性,灵敏度以及特异性等性能。此外,本实施例中,膜芯片表面固定有如下探针,每个探针通过其5’端标记的氨基固定至膜芯片,各探针的碱基序列(5’-3’)如下:沙门氏菌invA基因探针:TATGAAGTTAATTATGGAAG(SEQIDNO.35);沙门氏菌ttr基因探针:GATGAAACGCGTGGGTAAA(SEQIDNO.36);痢疾菌ipaH基因探针:GATAGAAGTCTACCTGGCCTTC(SEQIDNO.37);霍乱弧菌ompW基因探针:ACCCGCGGCAATATTCGTTTT(SEQIDNO.38);霍乱弧菌ctxAB基因探针:CAGCATATGCACATGGAACACC(SEQIDNO.39);副溶血性弧菌toxR基因探针:TGCGTACTGCTGTTTACAAACCCAG(SEQIDNO.40);副溶血性弧菌trh基因探针:CGGTCAATCGGTTTTCACAAC(SEQIDNO.41);副溶血性弧菌tdh基因探针:TCAACATTCCTATAATTCTGTA(SEQIDNO.42);空肠弯曲菌hipO基因探针:GCGATGATGGCTTCTTCGGA(SEQIDNO.43);腺病毒探针:TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACT(SEQIDNO.44);札如病毒探针:CCRCCTATRAACCA(SEQIDNO.45);星状病毒探针:TCAACGTGTCCGTAACATTGTCAATAA(SEQIDNO.46);轮状病毒探针:ATGAGCACAATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA(SEQIDNO.47);诺如病毒GI型探针:TGGACAGGAGAYCGCRATCT(SEQIDNO.48);诺如病毒GII型探针:AGCACGTGGGAGGGCGATGG(SEQIDNO.49);内参探针:CGGTCGTGTAGGTTCGCCAGCCACTTA(SEQIDNO.50);外参探针:ATCACATTACTGGCCGAAGC(SEQIDNO.51);阳性对照探针(PC):GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG(SEQIDNO.52);阴性对照探针(NC):GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC(SEQIDNO.53)。上述19种探针按图1所示的位置顺序地分别固定在膜芯片上的相应位置。在其他的实施例中,探针的固定顺序可与本实施例有所不同。需要说明的是,在其他的实施例中,膜芯片上固定的探针类型可以是上述探针中的一种或多种,其均可以根据检测需求进行选择,其均属于本发明的保护范围。其中,上述膜芯片制作方法可参考如下方法:(1)探针制备:根据上述探针序列,合成5’端氨基修饰的探针,用0.5mol/LNaHCO3分别稀释各探针,制备5μM探针溶液;(2)探针固定:先对膜芯片活化使其带有羧基,将各种探针溶液按图1所示的位置顺序地分别点制到膜芯片上,探针通过末端的氨基固定在膜芯片上。(3)芯片封闭:采用氢氧化钠终止反应,封闭探针,室温晾干后,保存备用,制成膜芯片。其中,Blank位置点制不含探针的NaHCO3溶液。实施例2采用上述试剂盒检测待测样本中致泻病原微生物的方法,步骤如下:1提取核酸样本使用基因组提取试剂盒从样本中提取总核酸(包括DNA和RNA)。2PCR扩增2.1多重普通PCR扩增体系和条件反应体系如下:2×MultiplexPCRMasterMix:25μL;各引物对:上游引物(20μM):0.5μL,下游引物(20μM):0.6μL,将第一引物对至第十引物对以及内参引物对加入同一体系中;由步骤1得到的待测样本的核酸样本:10ng-1μg;阳性寡核苷酸单链DNA(20μM):0.5μL;加ddH2O至总体积50μL。PCR反应条件如下:预变性:温度95℃、时间5分钟;变性:温度95℃、时间15秒;退火:温度55℃、时间30秒;延伸:温度72℃、时间15秒,30个循环;最后延伸:温度72℃、时间5分钟。得到多重普通PCR产物。2.2多重RT-PCR扩增体系和条件反应体系如下:2×OneStepRT-PCRMasterMix:25μL;25×RT-PCREnzymeMix:2μL;各引物对:上游引物(20μM):0.5μL,下游引物(20μM):0.6μL,将第十一引物对至第十五引物对以及外参引物对加入同一体系中;外源RNA:0.2μL;外源RNA为外部加入参照物,证明RT-PCR过程运行正常;由步骤1得到的待测样本的核酸样本:10ng-1000ng;加ddH2O至总体积50μL。对上述反应体系进行一步法RT-PCR循环扩增,PCR反应条件如下:反转录:温度45℃、时间30分钟;预变性:温度95℃、时间2分钟;变性:温度94℃、时间30秒;退火:温度55℃、时间30秒;延伸:温度72℃、时间30秒,35个循环;最后延伸:温度72℃、时间5分钟。得到多重RT-PCR产物。3将到的PCR产物进行膜芯片斑点杂交检测,具体如下:(1)将固定有探针的膜芯片放入杂交盒中,芯片标签正面朝上,加入去活化液(100mmol/LNaOH)1mL,37℃孵育8min;(2)加入去活化清洗液(2×SSPE,0.1%SDS)1mL,60℃孵育5min;(3)吸除去活化清洗液(2×SSPE,0.1%SDS),加入杂交体系液(由多重普通PCR产物和多重RT-PCR产物混合变性后加入杂交液(2×SSPE,0.1%SDS)中混合得到)1mL,45℃水平摇床90rpm孵育45min;(4)吸除杂交体系液,加入预热好的杂交清洗液(2×SSPE,0.5%SDS)1mL,52℃水平摇床90rpm,震荡清洗5min,洗涤2次;(5)吸除杂交清洗液,加入预热好的酶孵育液(链霉亲和素标记的碱性磷酸酶,按1:2000的比例加入到999.5μL的孵育液(2×SSPE,0.5%SDS)中),42℃水平摇床90rpm,震荡孵育30min;(6)吸除酶孵育液,加入预热好的孵育清洗液1(2×SSPE,0.5%SDS)1mL,42℃水平摇床90rpm,震荡清洗5min,洗涤1次;(7)吸除孵育清洗液1,加入预热好的孵育清洗液2(含:0.3mol/LNaCl,20mmol/LNaH2PO4,20mmol/LC10H14N2Na2O8·2H2O,pH为7.4)1mL,37℃水平摇床90rpm,震荡清洗5min,洗涤2次;(8)吸除孵育清洗液2,加入显色液(含BCIP/NBT的混合物,即5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰)1mL,室温静置显色15min;(9)吸除显色液,加入去离子水1mL室温洗涤2次,待膜芯片干燥后进行结果判读。具体杂交流程如表1。表1杂交流程表(10)结果分析:在实际的样本检测过程中,应当在另外单独地设置空白对照实验、阴性对照实验、阳性对照实验,提高检测结果的准确性。a)空白对照:使用水作为空白对照样本作为模板,按上述的检测方法进行的结果,PC(阳性质控点)显色,NC(阴性质控点)不显色,其余靶点不显色;b)阴性对照:使用阴性对照样本(除沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型之外的微生物)作为模板,按上述的检测方法进行的结果,PC(阳性质控点)显色,NC(阴性质控点)不显色,内参显色;c)阳性对照:使用阳性对照样本(含沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腺病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型中的一种或多种的混合的核酸样本)作为模板,按上述的检测方法进行的结果,PC(阳性质控点)显色,NC(阴性质控点)不显色,内参显色,相应靶点显色(例如是阳性对照样本为沙门氏菌核酸样本,则在膜芯片invA和ttr的靶点区域有显色);同时满足以上三个条件的为有效实验,则可根据显色结果判断所含致泻病原微生物类型。需要说明的是:可通过肉眼判读结果,也可采用扫描仪判读结果,以减少人为主观判读带来的误差。扫描仪判读软件根据大量数据统计各靶点信号值,设定各靶标阈值,若信号值大于阈值判定为阳性,小于阈值判定为阴性。实施例3检测实施例1提供的试剂盒的特异性检测方法按实施例2的检测方法进行。1采用遗传物质为DNA的致泻病原微生物检测:采用沙门氏菌、空肠弯曲菌、痢疾菌、霍乱弧菌(含ctxAB毒力基因)、副溶血性弧菌(含tdh和trh毒力基因)等五种标准菌株提取的基因组DNA以及腺病毒核酸,对相应检测靶基因的引物、探针进行特异性检测,结果如图2所示,结果显示各靶标显色正常,无非特异显色,各样本无交叉反应,特异性较好。样品信息表见表2。表2DNA浓度信息表样本DNA浓度(ng/μL)DNA加入量沙门氏菌44.31μL空肠弯曲菌8.91μL痢疾菌1651μL霍乱弧菌88.41μL副溶血性弧菌72.01μL腺病毒54.31μL2采用遗传物质为RNA的致泻病原微生物检测:采用经确认分别含札如病毒、星状病毒、轮状病毒、诺如病毒GI型和诺如病毒GII型的样本提取基因组核酸作为模板,对相应检测靶基因的引物、探针进行特异性检测,结果如图3所示,显示各靶标显色正常,无非特异显色,各样本无交叉反应,特异性较好。样品信息表见表3。表3模板信息表实施例4腹泻病人呕吐物样本检测:对某腹泻病毒的呕吐物样本进行基因组核酸提取后,以该基因组核酸为模板,采用实施例1提供的试剂盒,按实施例2的方法检测,结果如图4所示,显示该呕吐物中检测出沙门氏菌和腺病毒,表明引起该腹泻病人的病原微生物是沙门氏菌和腺病毒两种,为后续治疗提供了实验依据。实施例5腹泻病人粪便样本检测:对某腹泻病毒的粪便样本进行基因组核酸提取后,以该基因组核酸为模板,采用实施例1提供的试剂盒,按实施例2的方法检测,结果如图5所示,显示该粪便样本中检测出空肠弯曲菌和轮状病毒,表明引起该腹泻病人的病原微生物是空肠弯曲菌和轮状病毒两种,为后续治疗提供了实验依据。综上,本发明实施例提供的针对致泻病原微生物检测的核酸组合、试剂盒和检测方法具有以下特点:1)操作简单,经过一次样本核酸提取,双管PCR扩增,单芯片杂交就可以同步检测样本中多种致泻病原微生物,具有平行分析和多重判断的特点;2)检验对象完备,包含了常见、常检的致泻微生物指标,而且致泻性细菌的指标还包含了一些具有卫生检疫意义的毒力基因,还可以很方便的加入新的检测指标;3)试剂盒采用了可视化膜芯片的检测方式,提高了系统的检测通量,并且检测结果可以直接用肉眼判断,方便,快捷;4)试剂盒操作简单,经济,无需特殊的昂贵仪器,适用于突发公共卫生事件的规模检测及初筛。以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>四川华汉三创生物科技有限公司<120>一种检测致泻病原微生物的方法<160>54<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ctcagacatgccacggtacaac22<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2gctccacgaatatgctccaca21<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3gcaactggcgggagaaagcggtctt25<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>4gatcgccgccttccacgac19<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5ccgggataaagtcagaactctc22<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6tcatttgctgtcactcccga20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7gtgcggataaccatttagtc20<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8gagaaatgaatgtcaccatga21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9ccttgacgaataccaatcta20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10gtattctgcacacaaatcag20<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>11tttggcactattactaccgat21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12atactcaccaatctgacggaa21<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>13gtaaaggtctctgacttttggac23<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>14tggaatagaaccttcatcttcacc24<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>15ttggtttcaatattttcaatatct24<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>16cataacaaacatatgtccattgccg25<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>17gtgctaaggcaatgatagaagatgg25<210>18<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>18ctttgtaaagccacaataagcaaaga26<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>19cacggtggggtttctaaactt21<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>20gccccagtggtcttacatgcaca23<210>21<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>21tgcggttggatcacctcct19<210>22<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>22tccccaccttccagtt16<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>23gaycasgctctcgcyacctac21<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>24ccctccatytcaaacacta19<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>25aagcaggtaactgttgaggtc21<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>26ggttttggtcctgtgacac19<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>27accatctacacatgaccctc20<210>28<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>28ggtcacataacgcccc16<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>nisa,c,g,ort<400>29cgctggatgcgnttccat18<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>30ccttagacgccatcatcatttac23<210>31<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>31atgttcagrtggatgagrttctcwga26<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>32tcgacgccatcttcattcaca21<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>33gcgggtcctgccgaaagt18<210>34<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>34gaagtaacatatagacagacgcacac26<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>35tatgaagttaattatggaag20<210>36<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>36gatgaaacgcgtgggtaaa19<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>37gatagaagtctacctggccttc22<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>38acccgcggcaatattcgtttt21<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>39cagcatatgcacatggaacacc22<210>40<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>40tgcgtactgctgtttacaaacccag25<210>41<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>41cggtcaatcggttttcacaac21<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>42tcaacattcctataattctgta22<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>43gcgatgatggcttcttcgga20<210>44<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>44tgcaccagacccgggctcaggtact25<210>45<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>45ccrcctatraacca14<210>46<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>46tcaacgtgtccgtaacattgtcaataa27<210>47<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>47atgagcacaatagttaaaagctaacactgtcaa33<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>48tggacaggagaycgcratct20<210>49<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>49agcacgtgggagggcgatgg20<210>50<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>50cggtcgtgtaggttcgccagccactta27<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>51atcacattactggccgaagc20<210>52<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>52gcatccagatcagaagcaataatgagcagtgcgagaagaacgagtgtccaaagtaccag59<210>53<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>53ggttccttgagaaatgttttacgggattacttccatgtttgttggatgatcctattttc59<210>54<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>54ctggtactttggacactcgttcttctcgcactgctcattattgcttctgatctggatgc59当前第1页1 2 3 
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