一种用于检测B族链球菌的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法与流程

文档序号:15457588发布日期:2018-09-15 01:34

本发明涉及生物医学检测技术领域,特别是涉及一种用于检测B族链球菌的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法。



背景技术:

B族链球菌(GBS)学名为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae),为兼性厌氧的革兰氏阳性链球菌,通常寄居于人体阴道和直肠。自20世纪70年代,GBS已被证实是围产期母婴感染的主要致病菌之一,在围产医学中占有不可忽视的地位。现有的研究表明,正常孕妇GBS的带菌率为6.5%-36%,国内的妊娠妇女GBS带菌率为6.5%-15%。GBS感染是胎膜早破的重要发病因素,孕妇在分娩或发生胎膜早破时,GBS可经产道上行感染胎儿,可引起新生儿爆发性败血症、化脓性脑膜炎、肺炎等疾病,有较高的致死率。因此,孕妇产前筛查GBS越来越受到重视。

现有的B族链球菌检测方法主要以下几种:细菌培养法、抗原抗体测定法、核酸探针检测、荧光原位杂交法、脉冲场凝胶电泳法、聚合酶链反应、革兰染色法等。其中,细菌培养法是当前检测GBS的“金标准”,该方法操作简单、价格适中,但检测周期长(至少需要48h),且灵敏度不高,有较高的假阴性率。随着分子生物学检验的普及,越来越多的研究证实聚合酶链式反应(PCR)检测法比传统的细菌培养法具有更高的灵敏度和特异性,可提高GBS的检出率。然而,PCR技术通常需要特制的仪器以及复杂的反应程序,成本高,耗时长,对于需要实时、现场、快速的非实验室环境检测及分析通常难以实现。

核酸体外恒温扩增(Nucleic acid isothermal amplification,NCIA)技术是近年来发展起来的新的分子检测技术。该技术能在恒温条件下,模拟体内核酸复制机制,实现对核酸的扩增。恒温扩增无需反复热变性,不仅简化了对仪器的要求,还大大缩短了反应时间。其中重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)能够在恒温条件下(37℃-42℃)实现对核酸的快速特异性扩增,且在20min内可将核酸扩增至可检测水平,具有良好的可操作性,能够在非实验室条件下完成核酸检测,被称为是最具有可替代PCR潜力的核酸检测技术。

RPA技术的关键在于引物和探针的设计。RPA所用引物和探针都比常规PCR的引物和探针长,多数PCR引物和探针不适用于RPA反应,且目前尚无可用于RPA引物设计的软件,因此RPA引物和探针的设计难度较大。RPA引物通常需30-38个碱基,这既有利于重组酶与引物结合形成蛋白-核苷酸复合物启动反应,又保证扩增产物的特异性。RPA探针长度约为46-52个碱基,内部添有酶切位点,3’端含有阻断物。仅当探针与模板互补结合,才可发生切割产生信号。

综上所述,基于GBS感染引起孕妇和新生儿相关症状、疾病的严峻性,产前筛查GBS显得尤为重要。RPA检测技术反应时间短、对硬件设备的要求低,可解决临床上GBS感染确诊时间长、对检测人员技术和实验室平台要求高等问题。通过对GBS基因组DNA片段的序列分析,筛选出适用于RPA技术的引物和探针,可望研发出一种基于RPA技术的GBS快速诊断方法和试剂盒,为临床上早期诊断和及时治疗提供便利。



技术实现要素:

本发明针对现有技术中存在的不足,提供了一种用于特异性检测B族链球菌的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法。

一种用于检测B族链球菌的RPA荧光定量引物对,包括上游引物和下游引物,序列选自下列引物对中的一对:

引物对1 上游引物 5’-TTTCACCAGCTGTATTAGAAGTACATGCTGATC-3’

下游引物 5’-ACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTC-3’;

引物对2 上游引物 5’-TTTCACCAGCTGTATTAGAAGTACATGCTGATC-3’

下游引物 5’-ATTCAAATCATAAACTGTCTCAGGGTTGGCACGCA-3’;

引物对3 上游引物 5’-TTTCACCAGCTGTATTAGAAGTACATGCTGATC-3’

下游引物 5’-AACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTCTTT-3’;

引物对4 上游引物 5’-TCTGGAACTCTAGTGGCTGGTGCATTGTTATTTT-3’

下游引物 5’-ACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTC-3’;

引物对5 上游引物 5’-TCTGGAACTCTAGTGGCTGGTGCATTGTTATTTT-3’

下游引物 5’-ATTCAAATCATAAACTGTCTCAGGGTTGGCACGCA-3’;

引物对6 上游引物 5’-TCTGGAACTCTAGTGGCTGGTGCATTGTTATTTT-3’

下游引物 5’-AACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTCTTT-3’。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计,普通PCR引物多半是不适用的,因为RPA引物比一般PCR引物长,通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率,影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时,变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。

优选的,所述的RPA荧光定量引物对,序列为:

引物对6 上游引物 5’-TCTGGAACTCTAGTGGCTGGTGCATTGTTATTTT-3’

下游引物 5’-AACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTCTTT-3’。

本发明又提供了一种用于检测B族链球菌的RPA荧光定量探针,序列为:

5’-GCTTGATCAAGATAGCATTCAGTTGAGAAATATCAAAGATAATGTTCAGGG-3’,探针的其中两个核苷酸上连接有荧光基团和淬灭基团,且位于这两个核苷酸之间的某一个核苷酸为脱碱基位点;3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。在RPA体系中引入一个带有荧光标记的探针,一方面可以提高RPA检测的特异性,另一方面还能实现对RPA扩增进行实时监控。所述的脱碱基位点是指该位点无法形成配对,所以能被相关的核酸外切酶识别,可以是缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸,或者该位点的脱氧核糖核酸不仅缺失含氮碱基,其五碳糖部分还用四氢呋喃取代,四氢呋喃的结构与五碳糖结构类似。

探针长度通常在46-52bp之间,在探针上分别设计两个基团(一个荧光基团,一个淬灭基团),两个基团之间设计一个脱碱基位点,该位点能被一核酸外切酶特异性识别,该酶具有3’-5’外切酶活性,可以使荧光基团与淬灭基团分离,从而产生荧光信号。该酶只能特异性识别双链DNA,对单链DNA无活性,因而产生的荧光信号强度可与扩增产物同步增长。探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

优选的,所述的RPA荧光定量探针,序列为:

5’-GCTTGATCAAGATAGCATTCAGTTGAGAAAFHQCAAAGATAATGTTCAGGG-3’,其中F表示连接有荧光基团的dT(dT表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸),Q表示连接有淬灭基团的dT,H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸,3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。由于RPA荧光定量探针相对于普通荧光定量PCR探针来说,序列较长,如果将荧光基团和淬灭基团连接的两端,则效果相对于这样靠近设计来说,淬灭基团的对荧光基团的淬灭效果可能稍差。根据探针设计的常规要求,荧光基团不能连接到G上,因为G会淬灭荧光;而A与C连接荧光基团后,不如连接在T上稳定,所以选择将荧光基团连接到T上。

所述荧光基团为FAM、TET、JOE、HEX或TAMRA,所述淬灭基团为BHQ1或BHQ2,本发明对荧光基团和淬灭基团的选择并没有特殊性,常用的用于荧光定量PCR的荧光基团和淬灭基团均可使用。所述修饰基团为C3-Spacer(间隔子修饰)、磷酸化或biotin-TEG(生物素修饰)。普通引物序列3’没有磷酸基团而是-OH,只有3’末端是-OH的片段才可以被聚合酶延伸,但3’修饰了上述修饰基团后,所得探针只能结合到模板上而不能扩增。

本发明还提供了一种用于检测B族链球菌的RPA荧光定量试剂盒,包含所述的RPA荧光定量引物对和所述的RPA荧光定量探针。

所述的RPA荧光定量试剂盒,包括核酸外切酶ExoⅢ。外切酶ExoⅢ可作用于平末端或3'凹陷末端双链DNA 3'→5'外切酶活性。对单链DNA及3'突出末端双链DNA无活性。外切酶ExoⅢ也有RNase H、3'磷酸酶和脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性。本发明就是基于外切酶ExoⅢ的脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性,即AP(Apurinic/apyrimidinic)位点内切酶活性功能设计。

所述的RPA荧光定量试剂盒,包括试剂盒Liquid exo/exo RT Quick Kit中的所有试剂和醋酸镁溶液,镁离子能够激活聚合酶和外切酶Ⅲ的活性,控制RPA反应启动。

所述的RPA荧光定量试剂盒,包括浓度已知的标准品,所述标准品为包含如SEQ ID No.1所示序列的质粒。如SEQ ID No.1所示序列为GBS的cAMP基因序列。

本发明还提供了一种非医学诊断为目的的检测B族链球菌的方法,使用所述的RPA荧光定量试剂盒进行检测,包括以下步骤:

(1)提取样本DNA作为模板;

(2)分别使用所述RPA荧光定量引物对及RPA荧光定量探针对步骤(1)所得模板及标准品进行RPA荧光定量扩增;

(3)对比样本与标准品的荧光定量信号得出样本中B族链球菌的含量。

该方法可以用于离体检测B族链球菌,而并非一定要用于检测疾病。离体检测可以是环境样品的检测、实验室或医院消毒后材料检测是否残留B族链球菌,或者可以对输血或输液制品进行检测以确保没有B族链球菌污染等。

本发明RPA荧光定量引物对是针对B族链球菌的基因组中的cAMP因子设计筛选获得的,能够特异性扩增B族链球菌,且扩增效果好。

本发明检测方法为基于RPA技术的荧光定量检测方法,可用于特异性检测B族链球菌,该方法操作简便,灵敏度高,反应条件温和,反应时间短,结合便携式的荧光检测仪即可进行病原微生物的快速定量检测。本发明检测方法的灵敏度可以达到5拷贝/μL。

附图说明

图1为实施例2中引物初筛过程RPA扩增产物电泳图,其中,泳道M为DNA Marker DL500(下同),泳道1~11分别对应引物对1S/1A(251bp)、1S/2A(531bp)、1S/3A(231bp)、1S/4A(393bp)、2S/2A(173bp)、3S/1A(193bp)、3S/2A(473bp)、3S/3A(173bp)、3S/4A(335bp)、4S/2A(373bp)、4S/4A(235bp)。

图2为实施例3中引物优化过程RPA扩增产物电泳图,其中泳道1~9分别对应引物对4S/4A(235bp)、4S/5A(248bp)、4S/6A(236bp)、5S/4A(266bp)、5S/5A(279bp)、5S/6A(267bp)、6S/4A(200bp)、6S/5A(213bp)、6S/6A(201bp)。

图3为实施例4中荧光定量体系下不同引物进行RPA反应的GBS检测结果图,其中,曲线1~6分别对应引物对4S/4A(235bp)、4S/5A(248bp)、4S/6A(236bp)、5S/4A(266bp)、5S/5A(279bp)、5S/6A(267bp)。

图4为实施例5中荧光定量RPA反应体系的特异性验证结果图。

图5为实施例6中荧光定量RPA反应体系的灵敏度测试结果图,其中曲线1~9分别对应模板浓度108copy/μL、106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、103copy/μL、102copy/μL、10copy/μL、5copy/μL、0copy/μL。

图6为实施例7中防污染试剂(尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI))不会影响RPA反应体系的测试结果图,其中曲线1为不加防污染试剂,曲线2为加入防污染试剂。

具体实施方式

实施例1

B族链球菌基因组提取。

从中国微生物菌种查询网购买并获得GBS菌种冻干粉(ATCC编号:12386)。用无菌水溶解冻干粉,并接种于哥伦比亚血琼脂平板上活化。经两次继代培养后挑取菌落于THB培养基37℃培养。收集菌液通过基因组提取试剂盒提取GBS全基因组DNA。

实施例2

靶标序列确定和引物设计。

B族链球菌能产生cAMP因子,可促进金黄色葡萄球菌β-溶血素活性。大量研究表明,cAMP因子是GBS的主要致病因子。因此,本发明检测的靶标确定为B族链球菌基因组中编码cAMP因子的基因序列(GenBank:X72754.1)。

通过对cAMP因子的序列分析,设计并合成了以下4对引物:

第一对

GBS-1S:5’-TTTGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAAGATACC-3’;

GBS-1A:5’-CCATTTGCTGGGCTTGATTATTACTATTTACAT-3’。

第二对

GBS-2S:5’-TTAAAGACTTCATTGCGTGCCAACCCTGAGACA-3’;

GBS-2A:5’-ACTAGCTTAGTTATCCCAAATCCCATATCAATA-3’。

第三对

GBS-3S:5’-ACTGCAGTAGAAGTGATTTTAGTTTAAAGGAGG-3’;

GBS-3A:5’-TTACTATTTACATGATTTACCACTTGTGGAGTTGTCA-3’。

第四对

GBS-4S:5’-TTTCACCAGCTGTATTAGAAGTACATGCTGATC-3’;

GBS-4A:5’-ACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTC-3’。

将设计的4对引物通过两两交叉配对组合,选择扩增产物长度在100bp-550bp之间的引物对,使用TwistDX公司的Liquid Basic试剂盒进行扩增。RPA反应体系如下:

将RPA反应液混合均匀后加入2.5μL 280mM的MgOAc溶液(醋酸镁溶液),混匀后37℃放置40min完成扩增反应。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行RPA扩增产物检测(图1)。实验结果显示GBS-4S/4A的引物组合用于RPA扩增的产物条带单一且产物量最多,因此该对引物初筛效果最佳。

实施例3

为了进一步优化引物在RPA反应体系中的扩增效率和特异性,在GBS-4S/4A引物的基础上进行了部分位点的修改,并合成了2对新引物。

第一对

GBS-5S:5’-TCTGGAACTCTAGTGGCTGGTGCATTGTTATTTT-3’;

GBS-5A:5’-ATTCAAATCATAAACTGTCTCAGGGTTGGCACGCA-3’。

第二对

GBS-6S:5’-GTGACAACTCCACAAGTGGTAAATCATGTA-3’;

GBS-6A:5’-AACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTCTTT-3’。

采用两两交叉配对组合方式进行RPA扩增反应(图2),筛选结果显示GBS-4S/4A,GBS-4S/5A,GBS-4S/6A,GBS-5S/4A,GBS-5S/5A和GBS-5S/6A这6对引物组合的扩增产物单一且扩增效率较高,均能在琼脂糖凝胶电泳检测体系下实现基于RPA技术扩增检测GBS的要求。

实施例4

荧光定量体系检测GBS。

荧光定量检测体系相比于琼脂糖凝胶电泳的终点检验系统,其操作简便,可对扩增过程进行实时监控,更加适用于临床检验。为了考评筛选获得的RPA引物对在临床荧光定量检测体系中的检测性能,根据扩增产物序列引入一个带有荧光标记的探针。

GBS-P1:

5’-GCTTGATCAAGATAGCATTCAGTTGAGAAAFHQCAAAGATAATGTTCAGGG-3’,

其中F表示连接有荧光基团的dT,Q表示连接有淬灭基团的dT,H表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸,为脱碱基位点。探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团,该修饰基团为C3-Spacer。

该探针一方面可以提高RPA检测的特异性,另一方面还能实现对RPA扩增进行实时监控。在该探针中部的两个T碱基位置处分别设计了两个基团(一个荧光基团,一个淬灭基团),两个基团之间设计一个脱碱基位点,该位点能被具有3’-5’外切酶活性的核酸外切酶特异性识别,使荧光基团与淬灭基团分离,从而产生荧光信号。该核酸外切酶只能特异性识别双链DNA,对单链DNA无活性,因而产生的荧光信号强度可与扩增产物同步增长。

将筛选获得的引物对与探针配合使用,选用TwistDX公司的Liquid Exo试剂盒进行荧光定量检测。RPA反应体系如下:

将RPA反应液混合均匀后加入2.5μL 280mM的MgOAc溶液,混匀后放入荧光定量PCR仪,反应程序为37℃,20s,50Cycles/80Cycles(循环数)。由于引物和探针的位置会影响到RPA反应对GBS检测的灵敏度和扩增信号,因此在荧光定量检测体系中再次对引物进行筛选(图3)。实验结果显示,最佳引物为GBS-5S/6A。

实施例5

基于荧光定量RPA反应检测GBS的特异性验证。

以B族链球菌(GBS)DNA,人类乳头状瘤病毒(HPV)DNA,人胎盘DNA,鱼精DNA和Hela细胞基因组DNA为检测模板,各样本均稀释至108copy/μL(拷贝/微升),分别通过TwistDX公司的Liquid Exo试剂盒进行荧光定量RPA检测,以灭菌水作为阴性对照。实验结果显示(图4),只有B组链球菌能够被GBS-5S/6A引物和GBS-P1探针特异地检出,而其他样本均无扩增条带,因此采用该引物和探针具有很好的特异性。

实施例6

基于荧光定量RPA反应检测GBS的灵敏度测试。

以含有B族链球菌cAMP因子基因序列的质粒为模板,计算并稀释成108copy/μL,106copy/μL,105copy/μL,104copy/μL,103copy/μL,102copy/μL,10copy/μL,5copy/μL共计8个浓度梯度作为灵敏度检测的模板,以灭菌水作为阴性对照。荧光定量RPA结果显示(图5),该方法的检测灵敏度可以达到5copy/μL,具有很好的敏感度和较广的检测范围,能够满足临床GBS快速检测的要求。

实施例7

反应体系中加入尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)来防控污染。

在实施例4的体系中加入0.5μL dUTP,0.5μL的尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)37℃孵育5min,孵育结束后加入1.25μL的尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI),2.5μL醋酸镁混匀后放入荧光定量PCR仪。结果如图6所示,其中曲线1为不加防污染试剂,曲线2为加入防污染试剂,可以看出加入用于防污染的尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)对RPA检测结果没有影响。

序列表

<110> 杭州德同生物技术有限公司

<120> 一种用于检测B族链球菌的RPA荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1467

<212> DNA

<213> 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)

<400> 1

atattggtaa gaagaaattt ccttaaaaat aagattaaat aggttgtaaa gtatccgtat 60

gggttttact tgaaaaacta aattaaatta tcaagaaatt accccccagg ataggcgcca 120

agaatattat acccacttga taatggtaag ttttatgcta aaaatgcagt ttacttgtaa 180

taatgttaaa tataggggga aagaaagcgc tttgacgacc ttttggacaa gtagtaagat 240

accaacatgg gccctgtaaa ttaaaaatac tgcagtagaa gtgattttag tttaaaggag 300

gaaatttatt atgaacgtta cacatatgat gtatctatct ggaactctag tggctggtgc 360

attgttattt tcaccagctg tattagaagt acatgctgat caagtgacaa ctccacaagt 420

ggtaaatcat gtaaatagta ataatcaagc ccagcaaatg gctcaaaagc ttgatcaaga 480

tagcattcag ttgagaaata tcaaagataa tgttcaggga acagattatg aaaaaccggt 540

taatgaggct attactagcg tggaaaaatt aaagacttca ttgcgtgcca accctgagac 600

agtttatgat ttgaattcta ttggtagtcg tgtagaagcc ttaacagatg tgattgaagc 660

aatcactttt tcaactcaac atttaacaaa taaggttagt caagcaaata ttgatatggg 720

atttgggata actaagctag ttattcgcat tttagatcca tttgcttcag ttgattcaat 780

taaagctcaa gttaacgatg taaaggcatt agaacaaaaa gttttaactt atcctgattt 840

aaaaccaact gatagagcta ccatctatac aaaatcaaaa cttgataagg aaatctggaa 900

tacacgcttt actagagata aaaaagtact taacgtcaaa gaatttaaag tttacaatac 960

tttaaataaa gcaatcacac atgctgttgg agttcagttg aatccaaatg ttacggtaca 1020

acaagttgat caagagattg taacattaca agcagcactt caaacagcat taaaataata 1080

tttgtatttt tcgtgtgatg ctgtcgactt cgtgattttg tactaccatg attgttatga 1140

ttaaaagatt tacgacaata gtcataatag tagaacgatg tcaccatttt aaataataaa 1200

gtgattagtc atttgactaa atttgccaag tatcaaagga aataaagatt atgactaaaa 1260

agataactgt tgtagcatta gaaacattga ttgcccagca taataatatc catttgatag 1320

acgttcgtga agagcatgag tatcgtggag ggcatattcc aggtgcgata aatcttcctt 1380

tgagtcactc agtcataagt ttgaacagtt agataaaata aggaatatta tcttgttggc 1440

aacgaggggg aagatctatt agagcat 1467

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

tttgacgacc ttttggacaa gtagtaagat acc 33

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ccatttgctg ggcttgatta ttactattta cat 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

ttaaagactt cattgcgtgc caaccctgag aca 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

actagcttag ttatcccaaa tcccatatca ata 33

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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actgcagtag aagtgatttt agtttaaagg agg 33

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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ttactattta catgatttac cacttgtgga gttgtca 37

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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tttcaccagc tgtattagaa gtacatgctg atc 33

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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actgtctcag ggttggcacg caatgaagtc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

tctggaactc tagtggctgg tgcattgtta tttt 34

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

attcaaatca taaactgtct cagggttggc acgca 35

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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gtgacaactc cacaagtggt aaatcatgta 30

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

aactgtctca gggttggcac gcaatgaagt cttt 34

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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gcttgatcaa gatagcattc agttgagaaa tatcaaagat aatgttcagg g 51

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