本发明涉及生物医学检测技术领域，特别是涉及一种用于检测b族链球菌的rpa荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法。
背景技术：
b族链球菌(gbs)学名为无乳链球菌(streptococcusagalactiae)，为兼性厌氧的革兰氏阳性链球菌，通常寄居于人体阴道和直肠。自20世纪70年代，gbs已被证实是围产期母婴感染的主要致病菌之一，在围产医学中占有不可忽视的地位。现有的研究表明，正常孕妇gbs的带菌率为6.5％-36％，国内的妊娠妇女gbs带菌率为6.5％-15％。gbs感染是胎膜早破的重要发病因素，孕妇在分娩或发生胎膜早破时，gbs可经产道上行感染胎儿，可引起新生儿爆发性败血症、化脓性脑膜炎、肺炎等疾病，有较高的致死率。因此，孕妇产前筛查gbs越来越受到重视。
现有的b族链球菌检测方法主要以下几种：细菌培养法、抗原抗体测定法、核酸探针检测、荧光原位杂交法、脉冲场凝胶电泳法、聚合酶链反应、革兰染色法等。其中，细菌培养法是当前检测gbs的“金标准”，该方法操作简单、价格适中，但检测周期长(至少需要48h)，且灵敏度不高，有较高的假阴性率。随着分子生物学检验的普及，越来越多的研究证实聚合酶链式反应(pcr)检测法比传统的细菌培养法具有更高的灵敏度和特异性，可提高gbs的检出率。然而，pcr技术通常需要特制的仪器以及复杂的反应程序，成本高，耗时长，对于需要实时、现场、快速的非实验室环境检测及分析通常难以实现。
核酸体外恒温扩增(nucleicacidisothermalamplification，ncia)技术是近年来发展起来的新的分子检测技术。该技术能在恒温条件下，模拟体内核酸复制机制，实现对核酸的扩增。恒温扩增无需反复热变性，不仅简化了对仪器的要求，还大大缩短了反应时间。其中重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)能够在恒温条件下(37℃-42℃)实现对核酸的快速特异性扩增，且在20min内可将核酸扩增至可检测水平，具有良好的可操作性，能够在非实验室条件下完成核酸检测，被称为是最具有可替代pcr潜力的核酸检测技术。
rpa技术的关键在于引物和探针的设计。rpa所用引物和探针都比常规pcr的引物和探针长，多数pcr引物和探针不适用于rpa反应，且目前尚无可用于rpa引物设计的软件，因此rpa引物和探针的设计难度较大。rpa引物通常需30-38个碱基，这既有利于重组酶与引物结合形成蛋白-核苷酸复合物启动反应，又保证扩增产物的特异性。rpa探针长度约为46-52个碱基，内部添有酶切位点，3’端含有阻断物。仅当探针与模板互补结合，才可发生切割产生信号。
综上所述，基于gbs感染引起孕妇和新生儿相关症状、疾病的严峻性，产前筛查gbs显得尤为重要。rpa检测技术反应时间短、对硬件设备的要求低，可解决临床上gbs感染确诊时间长、对检测人员技术和实验室平台要求高等问题。通过对gbs基因组dna片段的序列分析，筛选出适用于rpa技术的引物和探针，可望研发出一种基于rpa技术的gbs快速诊断方法和试剂盒，为临床上早期诊断和及时治疗提供便利。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种用于特异性检测b族链球菌的rpa荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法。
一种用于检测b族链球菌的rpa荧光定量引物对，包括上游引物和下游引物，序列选自下列引物对中的一对：
引物对1上游引物5’-tttcaccagctgtattagaagtacatgctgatc-3’
下游引物5’-actgtctcagggttggcacgcaatgaagtc-3’；
引物对2上游引物5’-tttcaccagctgtattagaagtacatgctgatc-3’
下游引物5’-attcaaatcataaactgtctcagggttggcacgca-3’；
引物对3上游引物5’-tttcaccagctgtattagaagtacatgctgatc-3’
下游引物5’-aactgtctcagggttggcacgcaatgaagtcttt-3’；
引物对4上游引物5’-tctggaactctagtggctggtgcattgttatttt-3’
下游引物5’-actgtctcagggttggcacgcaatgaagtc-3’；
引物对5上游引物5’-tctggaactctagtggctggtgcattgttatttt-3’
下游引物5’-attcaaatcataaactgtctcagggttggcacgca-3’；
引物对6上游引物5’-tctggaactctagtggctggtgcattgttatttt-3’
下游引物5’-aactgtctcagggttggcacgcaatgaagtcttt-3’。
rpa分析的关键在于扩增引物和探针的设计，普通pcr引物多半是不适用的，因为rpa引物比一般pcr引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计rpa引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。
优选的，所述的rpa荧光定量引物对，序列为：
引物对6上游引物5’-tctggaactctagtggctggtgcattgttatttt-3’
下游引物5’-aactgtctcagggttggcacgcaatgaagtcttt-3’。
本发明又提供了一种用于检测b族链球菌的rpa荧光定量探针，序列为：
5’-gcttgatcaagatagcattcagttgagaaatatcaaagataatgttcaggg-3’，探针的其中两个核苷酸上连接有荧光基团和淬灭基团，且位于这两个核苷酸之间的某一个核苷酸为脱碱基位点；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。在rpa体系中引入一个带有荧光标记的探针，一方面可以提高rpa检测的特异性，另一方面还能实现对rpa扩增进行实时监控。所述的脱碱基位点是指该位点无法形成配对，所以能被相关的核酸外切酶识别，可以是缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸，或者该位点的脱氧核糖核酸不仅缺失含氮碱基，其五碳糖部分还用四氢呋喃取代，四氢呋喃的结构与五碳糖结构类似。
探针长度通常在46-52bp之间，在探针上分别设计两个基团(一个荧光基团，一个淬灭基团)，两个基团之间设计一个脱碱基位点，该位点能被一核酸外切酶特异性识别，该酶具有3’-5’外切酶活性，可以使荧光基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。该酶只能特异性识别双链dna，对单链dna无活性，因而产生的荧光信号强度可与扩增产物同步增长。探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。
优选的，所述的rpa荧光定量探针，序列为：
5’-gcttgatcaagatagcattcagttgagaaafhqcaaagataatgttcaggg-3’，其中f表示连接有荧光基团的dt(dt表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)，q表示连接有淬灭基团的dt，h表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸，3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。由于rpa荧光定量探针相对于普通荧光定量pcr探针来说，序列较长，如果将荧光基团和淬灭基团连接的两端，则效果相对于这样靠近设计来说，淬灭基团的对荧光基团的淬灭效果可能稍差。根据探针设计的常规要求，荧光基团不能连接到g上，因为g会淬灭荧光；而a与c连接荧光基团后，不如连接在t上稳定，所以选择将荧光基团连接到t上。
所述荧光基团为fam、tet、joe、hex或tamra，所述淬灭基团为bhq1或bhq2，本发明对荧光基团和淬灭基团的选择并没有特殊性，常用的用于荧光定量pcr的荧光基团和淬灭基团均可使用。所述修饰基团为c3-spacer(间隔子修饰)、磷酸化或biotin-teg(生物素修饰)。普通引物序列3’没有磷酸基团而是-oh，只有3’末端是-oh的片段才可以被聚合酶延伸，但3’修饰了上述修饰基团后，所得探针只能结合到模板上而不能扩增。
本发明还提供了一种用于检测b族链球菌的rpa荧光定量试剂盒，包含所述的rpa荧光定量引物对和所述的rpa荧光定量探针。
所述的rpa荧光定量试剂盒，包括核酸外切酶exoⅲ。外切酶exoⅲ可作用于平末端或3'凹陷末端双链dna3'→5'外切酶活性。对单链dna及3'突出末端双链dna无活性。外切酶exoⅲ也有rnaseh、3'磷酸酶和脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性。本发明就是基于外切酶exoⅲ的脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性，即ap(apurinic/apyrimidinic)位点内切酶活性功能设计。
所述的rpa荧光定量试剂盒，包括试剂盒
所述的rpa荧光定量试剂盒，包括浓度已知的标准品，所述标准品为包含如seqidno.1所示序列的质粒。如seqidno.1所示序列为gbs的camp基因序列。
本发明还提供了一种非医学诊断为目的的检测b族链球菌的方法，使用所述的rpa荧光定量试剂盒进行检测，包括以下步骤：
(1)提取样本dna作为模板；
(2)分别使用所述rpa荧光定量引物对及rpa荧光定量探针对步骤(1)所得模板及标准品进行rpa荧光定量扩增；
(3)对比样本与标准品的荧光定量信号得出样本中b族链球菌的含量。
该方法可以用于离体检测b族链球菌，而并非一定要用于检测疾病。离体检测可以是环境样品的检测、实验室或医院消毒后材料检测是否残留b族链球菌，或者可以对输血或输液制品进行检测以确保没有b族链球菌污染等。
本发明rpa荧光定量引物对是针对b族链球菌的基因组中的camp因子设计筛选获得的，能够特异性扩增b族链球菌，且扩增效果好。
本发明检测方法为基于rpa技术的荧光定量检测方法，可用于特异性检测b族链球菌，该方法操作简便，灵敏度高，反应条件温和，反应时间短，结合便携式的荧光检测仪即可进行病原微生物的快速定量检测。本发明检测方法的灵敏度可以达到5拷贝/μl。
附图说明
图1为实施例2中引物初筛过程rpa扩增产物电泳图，其中，泳道m为dnamarkerdl500(下同)，泳道1～11分别对应引物对1s/1a(251bp)、1s/2a(531bp)、1s/3a(231bp)、1s/4a(393bp)、2s/2a(173bp)、3s/1a(193bp)、3s/2a(473bp)、3s/3a(173bp)、3s/4a(335bp)、4s/2a(373bp)、4s/4a(235bp)。
图2为实施例3中引物优化过程rpa扩增产物电泳图，其中泳道1～9分别对应引物对4s/4a(235bp)、4s/5a(248bp)、4s/6a(236bp)、5s/4a(266bp)、5s/5a(279bp)、5s/6a(267bp)、6s/4a(200bp)、6s/5a(213bp)、6s/6a(201bp)。
图3为实施例4中荧光定量体系下不同引物进行rpa反应的gbs检测结果图，其中，曲线1～6分别对应引物对4s/4a(235bp)、4s/5a(248bp)、4s/6a(236bp)、5s/4a(266bp)、5s/5a(279bp)、5s/6a(267bp)。
图4为实施例5中荧光定量rpa反应体系的特异性验证结果图。
图5为实施例6中荧光定量rpa反应体系的灵敏度测试结果图，其中曲线1～9分别对应模板浓度108copy/μl、106copy/μl、105copy/μl、104copy/μl、103copy/μl、102copy/μl、10copy/μl、5copy/μl、0copy/μl。
图6为实施例7中防污染试剂(尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi))不会影响rpa反应体系的测试结果图，其中曲线1为不加防污染试剂，曲线2为加入防污染试剂。
具体实施方式
实施例1
b族链球菌基因组提取。
从中国微生物菌种查询网购买并获得gbs菌种冻干粉(atcc编号：12386)。用无菌水溶解冻干粉，并接种于哥伦比亚血琼脂平板上活化。经两次继代培养后挑取菌落于thb培养基37℃培养。收集菌液通过基因组提取试剂盒提取gbs全基因组dna。
实施例2
靶标序列确定和引物设计。
b族链球菌能产生camp因子，可促进金黄色葡萄球菌β-溶血素活性。大量研究表明，camp因子是gbs的主要致病因子。因此，本发明检测的靶标确定为b族链球菌基因组中编码camp因子的基因序列(genbank：x72754.1)。
通过对camp因子的序列分析，设计并合成了以下4对引物：
第一对
gbs-1s：5’-tttgacgaccttttggacaagtagtaagatacc-3’；
gbs-1a：5’-ccatttgctgggcttgattattactatttacat-3’。
第二对
gbs-2s：5’-ttaaagacttcattgcgtgccaaccctgagaca-3’；
gbs-2a：5’-actagcttagttatcccaaatcccatatcaata-3’。
第三对
gbs-3s：5’-actgcagtagaagtgattttagtttaaaggagg-3’；
gbs-3a：5’-ttactatttacatgatttaccacttgtggagttgtca-3’。
第四对
gbs-4s：5’-tttcaccagctgtattagaagtacatgctgatc-3’；
gbs-4a：5’-actgtctcagggttggcacgcaatgaagtc-3’。
将设计的4对引物通过两两交叉配对组合，选择扩增产物长度在100bp-550bp之间的引物对，使用twistdx公司的
将rpa反应液混合均匀后加入2.5μl280mm的mgoac溶液(醋酸镁溶液)，混匀后37℃放置40min完成扩增反应。利用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行rpa扩增产物检测(图1)。实验结果显示gbs-4s/4a的引物组合用于rpa扩增的产物条带单一且产物量最多，因此该对引物初筛效果最佳。
实施例3
为了进一步优化引物在rpa反应体系中的扩增效率和特异性，在gbs-4s/4a引物的基础上进行了部分位点的修改，并合成了2对新引物。
第一对
gbs-5s：5’-tctggaactctagtggctggtgcattgttatttt-3’；
gbs-5a：5’-attcaaatcataaactgtctcagggttggcacgca-3’。
第二对
gbs-6s：5’-gtgacaactccacaagtggtaaatcatgta-3’；
gbs-6a：5’-aactgtctcagggttggcacgcaatgaagtcttt-3’。
采用两两交叉配对组合方式进行rpa扩增反应(图2)，筛选结果显示gbs-4s/4a，gbs-4s/5a，gbs-4s/6a，gbs-5s/4a，gbs-5s/5a和gbs-5s/6a这6对引物组合的扩增产物单一且扩增效率较高，均能在琼脂糖凝胶电泳检测体系下实现基于rpa技术扩增检测gbs的要求。
实施例4
荧光定量体系检测gbs。
荧光定量检测体系相比于琼脂糖凝胶电泳的终点检验系统，其操作简便，可对扩增过程进行实时监控，更加适用于临床检验。为了考评筛选获得的rpa引物对在临床荧光定量检测体系中的检测性能，根据扩增产物序列引入一个带有荧光标记的探针。
gbs-p1：
5’-gcttgatcaagatagcattcagttgagaaafhqcaaagataatgttcaggg-3’，
其中f表示连接有荧光基团的dt，q表示连接有淬灭基团的dt，h表示缺失含氮碱基的脱氧核糖核酸，为脱碱基位点。探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，该修饰基团为c3-spacer。
该探针一方面可以提高rpa检测的特异性，另一方面还能实现对rpa扩增进行实时监控。在该探针中部的两个t碱基位置处分别设计了两个基团(一个荧光基团，一个淬灭基团)，两个基团之间设计一个脱碱基位点，该位点能被具有3’-5’外切酶活性的核酸外切酶特异性识别，使荧光基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。该核酸外切酶只能特异性识别双链dna，对单链dna无活性，因而产生的荧光信号强度可与扩增产物同步增长。
将筛选获得的引物对与探针配合使用，选用twistdx公司的
将rpa反应液混合均匀后加入2.5μl280mm的mgoac溶液，混匀后放入荧光定量pcr仪，反应程序为37℃，20s，50cycles/80cycles(循环数)。由于引物和探针的位置会影响到rpa反应对gbs检测的灵敏度和扩增信号，因此在荧光定量检测体系中再次对引物进行筛选(图3)。实验结果显示，最佳引物为gbs-5s/6a。
实施例5
基于荧光定量rpa反应检测gbs的特异性验证。
以b族链球菌(gbs)dna，人类乳头状瘤病毒(hpv)dna，人胎盘dna，鱼精dna和hela细胞基因组dna为检测模板，各样本均稀释至108copy/μl(拷贝/微升)，分别通过twistdx公司的
实施例6
基于荧光定量rpa反应检测gbs的灵敏度测试。
以含有b族链球菌camp因子基因序列的质粒为模板，计算并稀释成108copy/μl，106copy/μl，105copy/μl，104copy/μl，103copy/μl，102copy/μl，10copy/μl，5copy/μl共计8个浓度梯度作为灵敏度检测的模板，以灭菌水作为阴性对照。荧光定量rpa结果显示(图5)，该方法的检测灵敏度可以达到5copy/μl，具有很好的敏感度和较广的检测范围，能够满足临床gbs快速检测的要求。
实施例7
反应体系中加入尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)来防控污染。
在实施例4的体系中加入0.5μldutp，0.5μl的尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)37℃孵育5min，孵育结束后加入1.25μl的尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)，2.5μl醋酸镁混匀后放入荧光定量pcr仪。结果如图6所示，其中曲线1为不加防污染试剂，曲线2为加入防污染试剂，可以看出加入用于防污染的尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)对rpa检测结果没有影响。
序列表
<110>杭州德同生物技术有限公司
<120>一种用于检测b族链球菌的rpa荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法
<160>14
<170>siposequencelisting1.0
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<212>dna
<213>无乳链球菌(streptococcusagalactiae)
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agaatattatacccacttgataatggtaagttttatgctaaaaatgcagtttacttgtaa180
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